APOPTOSIS.ppt

1、APOPTOSIS SIGNAL PATHWAYS,金英 药理教研室 2005 10 30,Content :,Apoptosis overview Apoptosis signal pathway Detection methods for apoptosis,Apoptosis overview:,Definition Features History Significances,Definition,Apoptosis 是细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序，自己结束其生命的过程(programmed cell death，PCD)。 PCD：1965 年由Lockshin R

2、and Willias C 提出的。 Apoptosis：1972年Kerr J.F 提出的。 是多细胞生物体正常发育、维持成体组织结构不可缺少的部分。,Normal,Apoptotic,细胞凋亡的形态学的特征,Membrane blebbing,Human neutrophils are constantly produced in the marrow and released into the blood to search for invading pathogens. After only one day, they commit suicide and are replaced b

3、y younger cells. Beginning with the typical neutrophil shape (left) this apoptotic neutrophil undergoes a series of changes including violent membrane blebbing (called zeiosis) seen above, and fragmentation of DNA creating a vacuolar nucleus. Apoptotic cells break into smaller pieces called apoptoti

4、c bodies that other body cells recognize and eat.,Cells dying by apoptosis. The electron micrograph shows an apoptotic cell in the mammary gland. Apoptotic cell death is a normal occurrence here, balancing the proliferation of mammary epithelial cells that occurs in each menstrual cycle. Note the di

5、sintegrating nuclear envelope and the dark clumps of condensed chromatin. For comparison, part of a normal cell is visible to one side of the picture.,ApoptosisNecrosis,Morphological features,membrane blebbingno blebbing sizeshrinkageswelling chromatin aggregationyesno apoptotic bodyyesno organelles

6、intactdisintergration,Biochemical features,membrane integrityno damageloss DNA fragmentationinternucleosomalrandom DNA ladderDNA smear caspases cascade yes no energy requirementrequirednot required,Physiological significance,cell deathindividualgroup causesphysiologicalpathological inflammationnoyes

7、,1987,1991,1993,1996-7,1989,1972,1977- 1982,The term “apoptosis” coined （Kerr首次提出),Death genes in C. elegans identified,Discovery of Bcl-2,p53 discovered as an apoptosis regulator,Caspases identified,Death receptors (TNFR,Fas/Apol-1),Role Cytochrome c and apoptosome confirmed,2000,IAPs discovered,Sm

8、ac discovered,1887,chromatolysis,1965,Programmed cell death, PCD,History,Apoptosis,Apoptosis,Cancer with p53 mutations hormone-dependent tumors Breast cancer Prostate cancer Ovarian cancer Autoimmune disorders SLE glomerulonephritis,Viral infections AIDS Neurodegenerative disorders Alzheimers diseas

9、e Parkinsons disease Cerebullar degeneration Ischemic injury Myocardial infarction Stroke Reperfusion injury Toxin-induced liver disease Alcohol,Apoptosis signal pathway,Two Apoptosis Signaling Pathways: membrane death Receptor pathway and mitochondrial pathway,（一）死亡域的信号转导（细胞凋亡的引发）,The Fas receptor

10、is a major trigger for apoptosis,Cell Death Receptors and Ligands,Receptors LigandsOutcomes,TNFR1TNFa Apotosis/Anti-apoptosis TNFR2TNFa Anti-apoptosis Fas/CD95/Apo1 FasL Apotosis DR3/Apo3/Wsl-1Apo3L Apotosis/Anti-apoptosis DR4Apo2L/TRAIL Apotosis DR5/Apo2/TRAIL-R2Apo2L/TRAIL Apotosis,TRAIL: TNF-rela

11、ted apoptosis-inducing ligand,FADD(Fas-associated death domain),DED (death effector domain),DD (death domain),1-6富含cys结构域,First identified in 1993,family of cysteine proteases( ced-3,ICE) A milestone in apoptosis study Inactive precursors(proenzymes)that are activated either by autocatalyic cleavage

12、 or by other proteases: cascade of casepases Total 14 members (11 in human), and caspase-2, 3, 6, 7, 8, 9, and 10 are known to be involved in apoptosis,Caspases,(cystein containing , aspartate-specific proteases) 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶：特异性断开天冬氨酸残基后的肽键,Activation of Caspases,Caspase的活化是有顺序的多步水解的过程，虽然分子各异，但是它们活化

13、的过程相似。首先在caspase前体的N-端前肽和大亚基之间的特定位点被水解去除N-端前肽，然后再在大小亚基之间切割释放大小亚基，并进而形成两两组成的有活性的四聚体,活化的效应Caspase引起细胞凋亡的机制,（）灭活细胞凋亡抑制蛋白,无活性,CAD, caspase-activated deoxyribonuclease,（）剪切细胞结构蛋白 （）剪切细胞的效应蛋白： 的劈切,Caspase,核纤层蛋白,核板塌陷和染色质浓缩,肌动蛋白、apha-Fodrin等,PARP与DNA修复、基因完整性监护有关,Important Substrates of Caspases,Structural/t

14、rafficking proteins,Actin Fodrin Gelsolin Nuclear lamins A, B, C,Regulatory/signaling proteins,Pro-caspases Bcl-xL Bcl-2 BID,Transcription factors/regulators,MDM2 RB Sp1 IkB-a,DNA/RNA damage and repair mechanisms,PARP DFF-45/ICAD DNA-PKCS,MEKK-1 PKC and PAK2/hPAK65 p21WAF1/CIP1 FAK,Caspase Inhibitor

15、s,1. Viral inhibitors, CrmA（牛痘抑制蛋白）: Caspase-1, 8 p35:Caspase-1, 3, 6, 7, 8, 10,2. Cellular inhibitors, XIAP:Caspase-3, 7, 9 cIAP1:Caspase-9 cIAP2:Caspase-3, 7, 9 Livin: Caspase-3, 7, 9 Survivin:Caspase-3, 7 Bcl-2:Caspase-3, 7, 8, 9,3. Synthetic inhibitors, General inhibitors Reversible inhibitors S

16、pecific inhibitors Irreversible inhibitors,Regulators of Apoptosis,1 . Bcl-2家族 （B cell lymphoma/leukemia-2）B细胞淋巴瘤/白血病-2的缩写 Bc1-2是一种原癌基因，是ced-9在哺乳类中的同源物。和一般的癌基因不同，Bc1-2延长细胞的生存，能抑制细胞凋亡,而不是促进细胞的增殖 。 Bcl-2可分为两个亚族抗凋亡亚族（ Bcl-2 ，Bcl-XL）和促凋亡亚族( Bcl-Xs Bid Bad Bim Bax Bak 等) 。 Bcl-2蛋白含有4个Bcl-2同源结构域，依次命 名为BHl

17、、BH2、BH3和BH4。所有Bcl-2家族成员均含有1个或多个BH结构域。通过BHl和BH2形成各种同源和异源二聚体，从而对细胞凋亡调节。,Bid 位于细胞质中。当细胞表面的凋亡受体被活化后，活化caspase8,后者切割Bid，转变为tBid并从细胞质转位于线粒体，诱导cytc释放。 因此Bid是细胞凋亡信号的通用放大器。 Bad Bcl-2家族蛋白，Bad受磷酸化、去磷酸化的调节。 Bim Bim在正常细胞中通过与微管动蛋白轻链LC8的结合而与微管复合物相联。在细胞凋亡过程中， Bim/LC8可从微管复合物中解离出来转位于线粒体诱导cytc释放。,2. P53与细胞凋亡 P53是肿瘤抑制

18、基因，其产物主要存在于细胞核内。P53基因是人类肿瘤有关基因中突变频率最高的基因。在依赖P53蛋白的细胞凋亡中，P53基因是通过调节Bc1-2和Bax基因的表达来影响细胞凋亡的。P53蛋白能特异地抑制Bc1-2的表达，相反对Bax的表达则有明显的促进作用。研究表明，P53蛋白是Bax基因的直接的转录活化因子。在这些细胞中，P53蛋白的积累和活动引起了细胞凋亡。,3. IAP（inhibitor of apoptosis protein） IAP超家族的成员较多，如c-IAP1, c-IAP2 ,XIAP, NIAP ,Livin和Survivin，新的成员在不断的被发现。IAP家族成员有一个共

19、同的特征，含有一个或多个个氨基酸杆状病毒IAP重复序列（baculoviral IAP repeats,BIR），羧基端的zinc指环状结构。c-IAP1、 c-IAP2和 XIAP含有环指状结构。BIR功能域和之间的连接区域介导对caspase的抑制作用，而环指状结构则具有泛素化蛋白连接酶的作用，介导caspase和的泛素化降解作用。,Detection methods for apoptosis,Mitochondrial events: ：CMXRos,TMRM Cyt.c releasing： Cyt.c antibody (western blot),Mem.eventPS flip

20、ping：AnnexinV-FITC ( EGFP, Cy3, Cy5,PE,biotin ),Nuclear event DNA fragmentation： DNA ladder, TUNEL, nucleosome antibody,Caspases cascade： antibody,substrates,inhibitors,Other apoptosis events：death receptors/ligands / adaptors, regulators(Bcl-2 families),caspases cleavage substrates(PARP,lamins.etc)

21、,ps,细胞凋亡的测定,Cell membrane eventPS flipping： （Annexin V）,磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细胞膜的内侧，在凋亡早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin-V是一种分子量为3536KD的Ca2+依赖性磷脂丝氨酸结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素（FITC、R-PE）或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪、荧光显微镜以及共聚焦激光扫描显微镜检测细胞凋亡的发生。,Annexin V,Annexin V-

22、FITC EGFP Cy3,Mitochondrial events: 1. 线粒体跨膜电位（mt）的检测,Rhodamine 123、 tetramethylrhodamine methyl ester（TMRM）或chloromethyl X-rosamine （CMXRos）等是一类阳离子染料分子,对线粒体膜电位非常敏感。在正常细胞中，它在线粒体中形成聚集体，发出强烈的红色荧光；凋亡细胞中，因线粒体膜电位下降或消失，它以单体形式存在于细胞液中，发出绿色荧光。,healthy: multimeric, red punctate,apoptotic: monomeric green diff

23、used,用检测线粒体膜电位荧光分子标记细胞后，流式细胞仪观测结果。由camptothecin诱导jurkat细胞不同时间后的检测结果,Anti-Holocytochrome C Anti-apocytochrome C,Western , ELASA, Immunoprecipitation,2. Detection of Cytochrome C release,3. Bcl-2 Family,Anti-Bax,Anti-Bcl-2,Anti-Bcl-XL,Anti-Bid,Anti-Bim,Anti-Mcl-1,Western , ELASA, Immunoprecipitation,I

24、mmunohistochemistry,Nuclear event ： DNA fragmentation 细胞凋亡时主要生物化学特征是其染色质发生浓缩, 染色质DNA在核小体单位之间的连接处断裂, 形成180200bp整数倍的寡核苷酸片段, 检测方法：琼脂糖梯形电泳图谱(DNA ladder)、TUNEL法、LM-PCR Ladder （连接介导的PCR检测）,由camptothecin诱导jurkat细胞不同时间（泳道1，0小时；泳道2，6小时；泳道3，12小时）核DNA的琼脂糖凝胶电泳,1 2 3,DNA ladder assayed with the Apoptotic DNA Lad

25、der Kit TNF （50、100、150 IU/ml）induced L929 for 14h,DNA Fragmentation（Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end-labeling ） Labeling Principle:,通过DNA末端转移酶(TDT)将带标记的 dNTP （多为dUTP）接到DNA片段的3-OH端，通过直接荧光标记，地高辛介导荧光标记或过氧化物酶联显色定量分析结果，可做细胞悬液、福尔马林固定或石蜡处理的组织、细胞培养物等多种样本的检测。,Cytoplasmic events -Caspases cascade：,antibody: anti-Caspases, anti-procaspases Substrates: DEVD-AFC,DEVD-pNA inhibitors: FITC-DEVD-FMK,Jurkat 细胞用camptothecin诱导 6 h (B)，或不诱导 (A) 后加入FITC-DEVD-FMK, 反应 20 minutes 后用流式细胞仪测定结果,Caspases