Axin过表达下调_catenin和TCF_4表达并抑制肺癌BE1细胞的增殖和侵

1、中国肺癌杂志 2 0 0 9 年 4 月第 1 2 卷第 4 期 Chin J Lung Cancer, April 2009, Vol.12, No.4277 基础研究 Axin过表达下调-catenin和TCF-4表达并抑制肺癌BE1细胞的增殖和侵袭刘树立徐洪涛杨连赫李庆昌韦强王恩华【摘要】 背景与目的 Axin是Wnt通路的重要负性调节因子，其低表达和-catenin、TCF-4的高表达与多种肿瘤有关。本研究旨在探讨axin在肺癌细胞中的表达与-catenin和TCF-4的关系，及其对肺癌细胞增殖、凋亡和侵袭能力的影响。方法 将axin基因转染入axin低表达的肺癌BE1细胞系，应用免疫

2、荧光方法观察转染组和对照组细胞中axin的表达对-catenin和TCF-4的影响；采用RT-PCR方法检测axin和-catenin、TCF-4 mRNA表达的变化；采用流式细胞术、MTT和Transwell检测肺癌细胞凋亡、增殖和侵袭能力的变化。结果 肺癌BE1细胞转染axin基因后（BE1-axin），axin的mRNA和蛋白水平均明显增加，-catenin蛋白表达明显减少，TCF-4的蛋白和mRNA表达均明显下降。同时，BE1-axin细胞的凋亡率增加，增殖和侵袭能力明显下降。结论 Axin过表达能下调-catenin的蛋白表达和TCF-4的转录，抑制肺癌细胞的增殖和侵袭能力，并诱导肺

3、癌细胞凋亡。【关键词】 Axin；Beta Catenin；TCF-4；肺肿瘤；增殖【中图分类号】 R361DOI:10.3779/j.issn.1009-3419.2009.04.04Transfection of Axin Gene Down-regulates Expressions of -catenin and TCF-4 and Inhibits the Proliferation and Invasive Ability of Lung Cancer CellsShuli LIU, Hongtao XU, Lianhe YANG, Qingchang LI, Qiang WEI,

4、 Enhua WANGDepartment of Pathology, College of Basic Medical Sciences, China Medical University, Shenyang 110001, China; Department of Pathology, The First Affiliated Hospital of China Medical University, Shenyang 110001, ChinaCorresponding author: Enhua WANG, E-mail: 【Abstract】 Bac

5、kground and objective Axin is an important negative regulator of Wnt signaling pathway. It can induce the phosphorylation and degradation of -catenin. The reduced expression of axin or high expression of -catenin and TCF-4 were associated with malignant proliferation in many tumors. The aim of this

6、study is to examine the relationships among the expressions and locations of axin, -catenin and other relevant molecules, and the roles of axin on proliferation, invasive ability and apoptosis of lung cancer cells. Methods The axin cDNA was transfected into lung cancer BE1 cell line which has very l

7、ow axin expression. The levels of expression and location of axin, -catenin and TCF-4 before and after transfection were detected using immunofluorescence. The mRNA levels of expression of axin, -catenin and TCF-4 were examined using reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR). The apop

8、tosis, proliferation and invasive ability of lung cancer cells before and after transfection were examined with flow cytometry, MTT and transwell methods. Results After transfection of axin gene into BE1 cells (BE1-axin cells), axin mRNA and protein were overexpressed significantly. Meanwhile, the p

9、rotein expression of -catenin and mRNA expression of TCF-4 were decreased significantly in BE1-axin cells than that in BE1 or vector control cells. The flow cytometry revealed that the apoptosis rate of BE1-axin cells was enhanced, but MTT and Transwell assay indicated that the proliferation and inv

10、asive ability were decreased significantly in BE1-axin cells than those in BE1 or vector control cells. Conclusion The overexpression of axin could down-regulate the protein expression of -catenin and the transcription of TCF-4, and inhibit the proliferation and invasive ability of lung cancer cells

11、.【Key words】 Axin protein; Beta Catenin; T cell factor 4; Lung neoplasms; Cell proliferation This study was supported by grants from the National Natural Science Foundation of China (to Enhua WANG)(No.30670917) and the National Natural Science Foundation of China (to Hongtao XU)(No.30801135).本研究受国家自

12、然科学基金（No.30670917；No.30801135）项目资助作者单位：110001 沈阳，中国医科大学基础医学院病理学教研室，中国医科大学附属第一医院病理科（通讯作者：王恩华，E-mail: wangeh ）278中国肺癌杂志 2 0 0 9 年 4 月第 1 2 卷第 4 期Chin J Lung Cancer, April 2009, Vol.12, No.4Wnt信号传导通路通过抑制-catenin降解，使其在细胞浆内蓄积并进入细胞核与TCF-4结合，进而启动cyclin D1、c-myc、VEGF、MMP-7等靶基因转录，与多种恶性肿瘤的发生、发展关系密切

13、1-4。Axin是细胞内重要的架构蛋白（scaffold），其重要功能之一就是负性调节Wnt信号通路的活性。它能够与大肠腺瘤息肉样蛋白（APC）、糖原合成酶激酶-3（GSK-3）形成复合体，介导-catenin磷酸化和降解，从而保证正常细胞中Wnt通路的低活性状态。而当某些原因引起axin表达下调或降解加速时，就会导致axin复合体功能异常，-catenin不能被有效磷酸化和降解，而在细胞浆（或核）内异常蓄积，并与TCF-4形成复合体，启动癌基因转录5,6。有研究表明axin在肿瘤中表达明显降低，并与肿瘤的低分化相关7，而axin的表达增加能诱导细胞凋亡8,9。我们以往的研究4也发现，在肺癌中

14、axin的表达明显减少，并与肺癌的低分化相关。为深入探讨axin的表达对-catenin及TCF-4等分子和肺癌细胞增殖、侵袭能力的影响，本研究将axin 基因导入axin低表达的肺癌BE1细胞系，采用免疫荧光、RT-PCR、MTT溴化-3（4，5-二甲基噻唑基-2）-2，5-二苯基四唑、流式细胞术和Transwell检测axin表达量的变化对-catenin、TCF-4等蛋白分布和功能以及肺癌细胞增殖、凋亡和侵袭能力的影响。1材料和方法1.1 材料 肺巨细胞肺癌PG细胞系亚系BE1细胞系由北京大学医学部郑杰教授惠赠，为高转移能力的axin低表达细胞系。含鼠axin1 cDNA的pFLAG-C

15、MV-5b质粒由Perrella教授（Brigham & Womens Hospital，Boston， MA ， USA ）惠赠 1 0 ，经大连宝生物公司（TaKaRa）测序验证。RPMI-1640培养液和小牛血清购自美国GIBCO公司，转染所用试剂为Lipofectamine 2000，购自美国Invitrogen公司。FLAG鼠单抗购自美国Sigma公司；axin及TCF-4兔抗人多抗购自美国Santa Cruz公司；-catenin鼠抗人单抗购自美国UPSTATE公司。DAPI购自Sigma公司。RT-PCR实验所用引物如表1所示，均由大连宝生物（TaKaRa）公司合成。Trizol

16、总RNA提取试剂购自Invitrogen公司，逆转录试剂盒、PCR试剂盒和100 bp DNA标准购自大连宝生物（TaKaRa）公司。1.2 方法1.2.1 细胞培养 使用含10%小牛血清的RPMI-1640培养液，在37 、含5%CO2的培养箱内培养肺癌BE1细胞系。1.2.2 Axin 基因转染 在35 mm培养皿中接种2105BE1细胞，培养24 h，待细胞数达到90%左右后开始转染。首先，将4 g pFLAG-axin质粒与250 L RPMI-1640培养液室温下混匀备用，同时取10 L Lipofectamine 2000与250 L RPMI 1640培养液混匀，室温孵育5 mi

17、n。（质粒：转染试剂1:2.5）。将稀释后的质粒与Lipofectamine 2000稀释液混匀（30 min内完成），室温孵育20 min。然后，将质粒与 Lipofectamine 2000的混合液加入培养皿，培养6 h后换液。继续培养，每24 h换液1次。以未转染（BE1）和转染pFLAG空质粒的细胞（BE1-FLAG）为对照。1.2.3 免疫荧光 于转染后48 h取出细胞爬片，丙酮固定15 min。PBS清洗，0.1%TritonX-100室温下孵育细胞10 min。血清封闭，37 湿盒内孵育30 min。分别滴加FLAG（1:200）、axin（1:50）、-catenin（1:20

18、0）和TCF-4（1:50）一抗，4 湿盒内孵育过夜。PBS清洗后，避光加罗丹明（TRITC）标记羊抗鼠二抗或FITC标记羊抗兔二抗（1:200），37 湿盒内孵育30 min，100 ng/mL DAPI复染细胞核，37 、10 min，最后50%甘油封片，荧光显微镜以相同曝光时间观察成像。按同样步骤重复实验3次。1.2.4 RT-PCR 转染48 h后，分别收集转染axin 基因细胞（BE1-axin）和对照组BE1、BE1-FLAG细胞，使用Trizol表 1PCR引物、复性温度及产物长度Tab 1 The PCR primers, anealing temperatures and t

19、he products lengthsItemPrimerssequenceserutareProductpmeg nlengthia AaxinSence: 5-ACCGAAAGTACATTCTTGATAAC-3452 bp52Antisence: 5-TCCATACCTGAACTCTCTGC-3-cateninSence: 5-GCCAAGTGGGTGGTATAGAG-3330 bp49 Antisence: 5-GCTGGGTATCCTGATGTGC-3TCF-4Sence: 5-CGAGGGTGATGAGAACCTGC-3444 bp52Antisence: 5-CCCATGTGATT

20、CGATGCGT-3-actinSence: 5-AGAGCTACGAGCTGCCTGAC-3308 bp55Antisence: 5-AGTACTTGCGCTCAGGAGGA-3中国肺癌杂志 2 0 0 9 年 4 月第 1 2 卷第 4 期 Chin J Lung Cancer, April 2009, Vol.12, No.4279试剂分别提取各组细胞总R N A，逆转录获得cDN A，按说明书操作。以反转录获得的cDNA为模板，分别扩增axin、-catenin和TCF-4，以-actin为内参，循环数均为30，复性温度和产物长度见表1。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳（100 V、3

21、0 min）后，用BioImaging system观察成像，用 NIH image software分析产物带灰度，以产物带与-actin条带的灰度比值为该mRNA的相对表达量，实验重复3次。1.2.5 细胞凋亡检测 转染axin 基因48 h后，0.25%胰酶消化，收集BE1-axin细胞及BE1和BE1-FLAG对照细胞，95%乙醇固定。2 000 rpm离心，弃上清，PBS冲洗2次后，用PBS吹散细胞。细胞计数，将细胞密度调至1106/mL。避光，加1 mL PI溶液（0.05 g/L PI、0.02 g/L RNA酶、0.01 g/L Triton X-100、1 g/L柠檬酸钠、5

22、.85 g/L NaCl）室温作用 30 min。PBS冲洗后流式细胞仪检测，用Modfit LT V 3.0软件分析结果，实验重复3次。1.2.6 细胞增殖检测 于转染axin基因6 h后，分别消化、收集BE1-axin、BE1和BE1-FLAG细胞，调整细胞悬液浓度，加入96孔板，每种细胞32孔，细胞数为1104/孔，继续于37 、5%CO2孵箱中培养。检测前4 h加入MTT溶液（180 L 无血清1640培养液，20 L MTT），于24 h、48 h、72 h和96 h吸去培养液，加200 L 0.04 mol/L酸化异丙醇，15 min后摇匀，用酶联免疫检测仪在570 nm波长处测定

23、其光吸收值（反映细胞的增殖水平）。每种细胞每个时段检测8孔，以其平均值为该时段光吸收值，实验重复3次。1.2.7 细胞侵袭能力检测 使用Transwell（Corning Inc.，USA）检测转染axin组及对照组细胞的侵袭能力变化。首先，将Matrigel置于4 过夜使其融化，用预冷的无血清1640以1:3稀释Matrigel，每个上室加入稀释后的Matrigel100 L，室温2 h使其凝固。然后，于转染后24 h，收集BE1-axin、BE1和BE1-FLAG细胞，用无血清1640液重悬细胞，细胞记数并调整细胞浓度为5105个/mL。每个上室中加入100 L细胞悬液，下室加入含10%小

24、牛血清的1640培养液，每种细胞做3孔。继续培养48 h后，取出滤膜，甲醇固定，常规HE染色。显微镜下计数迁移至滤膜外表面的细胞数，每张滤膜随机计数10个视野（200），取平均值，实验重复3次。1.3 统计学处理 采用SPSS 13.0统计分析软件，使用Mann-Whitney U检验和Kruskal-Wallis test分析RT-PCR、流式细胞术、MTT和Transwell结果，P0.05为差异有统计学意义。2结果2.1 免疫荧光结果免疫荧光可见BE1细胞中无报告基因FLAG的表达，axin表达很弱，-catenin和TCF-4为细胞浆或核强表达；转染48 h后，BE1-FLAG细胞中出

25、现报告基因FLAG的强表达，axin、-catenin和TCF-4的表达与BE1基本一致；而BE1-axin细胞中出现axin和FLAG的强表达，定位于细胞浆和细胞核，-catenin的表达明显减弱，TCF-4的表达也有所下降（图1）。2.2 RT-PCR结果 转染axin 基因48 h后，BE1-axin细胞中axin mRNA的表达明显增加（P 0.05），而第2天-第4天，BE1-axin细胞的增殖率明显低于BE1-FLAG（P=0.001）和BE1细胞（P=0.001）（图4）。2.5 细胞侵袭力检测结果 将细胞接种至Transwell上室并培养48 h后，穿透Matrigel到达滤膜

26、的BE1-axin细胞数（3.700.98）明显少于BE1（23.803.27）和BE1-FLAG细胞（24.203.77）（P=0.008）（图5）。3讨论-catenin是经典的cadherin-catenin复合体和Wnt通路的重要成员，与E-cadherin结合参与细胞粘附，又可在细胞核内与TCF-4结合参与信号传导，所以其异常蓄积对肿瘤的恶性增殖和侵袭转移有重要作用1,2,11。Axin作为调控-catenin蛋白降解的关键分子，对保持Wnt通路的低活性状态，调节细胞的增殖和凋亡具有重要作用。Nakajima等7研究认为axin的表达减少与肿瘤的TNM分期和淋巴结转移相关，并是食管鳞

27、癌进展的重要原因之一。我们以往的研究也表明非小细胞肺癌中存在着axin的表达减少，并且axin的表达减少与-catenin的核蓄积和肺癌的低分化明显相关4。以上研究都说明axin在诱导-catenin降解和分布，抑制肿瘤发生、发展和侵袭方面发挥重要作用。有研究12,13发现axin具有独立的核定位信号（NLS）和出核信号（NES），能够在胞浆、胞核间往返穿梭，而-catenin本身没有出入核信号，不能独立出入细胞核，所以它的膜、浆、核分布和定位是由axin或APC等分子伴侣蛋白的转运和穿梭机制调节的。本研究在肺癌BE1细280中国肺癌杂志 2 0 0 9 年 4 月第 1 2 卷第 4 期Ch

28、in J Lung Cancer, April 2009, Vol.12, No.4图 1Axin、-catenin和TCF-4在BE1-axin、BE1-FLAG和未转染的BE1细胞中表达的变化A：转染48 h后，BE1-axin细胞中axin的表达明显高于BE1-FLAG和BE1细胞，定位于细胞浆和细胞核；B：报告基因FLAG在未转染的BE1细胞中表达极弱，而在BE1-FLAG和BE1-axin细胞中明显增强；C，D：-catenin和TCF-4的表达在BE1-axin中的表达明显少于BE1-FLAG和BE1细胞。Fig 1Expression of axin, -catenin and

29、TCF-4in BE1-axin, BE1-FLAG andnontransfected BE1 cellsA: Forty-eight hours after transfection in BE1-axin cells, the expression of axin was remark-ably enhanced in cytoplasm and nucleus;B: The reporter FLAG expressed outstandinglyin BE1-axin and BE1-FLAG cells but not inBE1 cells;C, D: The expressio

30、ns of -catenin andTCF-4 were reduced obviously in BE1-axincells than in BE1-FLAG and nontransfectedBE1 cells.图 2 转染组及对照组细胞中axin、-catenin和TCF-4的mRNA表达变化A：BE1-axin及对照组BE1-FLAG和BE1细胞中，axin、-catenin和TCF-4经RT-PCR扩增后的电泳结果，以-actin为内对照；B：直方图显示转染后BE1-axin细胞中axin mRNA表达明显增加，-catenin mRNA表达没有明显变化，而TCF-4 mRNA的表

31、达明显减少。 * P0.01.Fig 2Changes of axin, -catenin and TCF-4 mRNA levels in BE1-axin, BE1-FLAG and BE1 cellsA: The electrophoresis images of axin, -catenin and TCF-4 mRNA in BE1-axin, BE1-FLAG and nontransfected BE1 cells after RT-PCR. -actin served as an internal control;B: The relative expression rate

32、of axin mRNA was significantly enhanced, the mRNA of -catenin had not marked change, but the mRNA of TCF-4 was significantly reduced in BE1-axin cells than that in BE1-FLAG and BE1 cells。* P0.01.中国肺癌杂志 2 0 0 9 年 4 月第 1 2 卷第 4 期 Chin J Lung Cancer, April 2009, Vol.12, No.4281图 3 BE1-axin、BE1-FLAG和BE1

33、的细胞凋亡检测A：转染48 h后，BE1-axin、BE1-FLAG和BE1细胞的流式细胞术凋亡检测结果；B：BE1-axin细胞的凋亡率（14.05%）明显高于BE1-FLAG（0.12%）和* P0.01.BE1细胞（0.01%）。Fig 3Changes in the level of cell apoptosis in BE1-axin, BE1-FLAG and BE1 cellsA: The flow cytometry results showed the apoptosis of BE1-axin, BE1-FLAG and BE1; B: The apoptosis rate

34、 of BE1-axin cells (14.05%) was significantly higher than that of BE1-FLAG (0.12%) and BE1 cells (0.01%). * P0.01.图 4BE1-axin、BE1-FLAG和BE1细胞的MTT增殖曲线波长570 nm的吸光度值可以代表细胞的增殖水平。MTT增殖曲线表明：转染后的第1天，3种细胞的增殖率没有明显差别，而第2天第4天，BE1-axin细胞的增殖率明显低于BE1-FLAG# P0.01.和BE1细胞。Fig 4MTT Cell proliferation assay in BE1-axin

35、, BE1-FLAG and BE1 cellsThe absorbance at 570 nm represents cell viability at each time point and is a measure of cell proliferation. The growth curves indicated that the growth rates had not marked difference among BE1-axin, BE1-FLAG and BE1 cells in the first day after transfection, but in each da

36、y of the latter three days, the growth rate was significantly lower in BE1-axin cells than that in BE1-FLAG and BE1 cells. # P0.01.图 5 BE1-axin、BE1-FLAG和BE1的细胞侵袭能力检测A、B、C：分别为BE1-axin、BE1-FLAG和BE1细胞侵袭实验所观察的一个有代表性的视野（200）；D：直方图显示BE1-axin细胞的侵袭能力明显低* P0.05.于BE1-FLAG和BE1细胞。Fig 5Invasive ability of BE1-ax

37、in, BE1-FLAG and BE1 cellsA, B, or C showed a representative microscope field of filters under the Matrigel from BE1-axin, BE1-FLAG and BE1 cells respectively (200); D: The histogram showed that the number of invasive cell was significantly less in BE1-axin cells than that in BE1-FLAG and BE1 cells.

38、 * P0.05.282中国肺癌杂志 2 0 0 9 年 4 月第 1 2 卷第 4 期Chin J Lung Cancer, April 2009, Vol.12, No.4胞中过表达axin后，发现-catenin的蛋白含量明显减少，而mRNA水平无明显变化，证实axin虽然不影响-catenin的转录，但通过诱导其降解可以显著下调-catenin在细胞内的含量。另外，我们观察到过表达的axin蛋白出现在细胞核内，证实axin能够穿梭于细胞浆、核，但其调节的具体机制有待进一步研究。由此，我们认为，转染axin 基因能促进-catenin降解，一方面是因为axin表达上调促进了axin-AP

39、C-GSK-3降解复合体的形成和功能；另一方面，axin的过表达也使其大量进入细胞核，并且与-catenin的结合率增加，更有效地发挥分子伴侣的作用，转运更多的-catenin至胞浆中降解。那么，除了诱导-catenin降解，axin是否也能调节其他Wnt通路成员？出乎预料并且有重要意义的是，本研究发现过表达的axin能够明显抑制肺癌细胞中TCF-4的转录和表达，说明axin不仅诱导-catenin降解，还能调节Wnt通路其他下游分子的表达，从多方面下调Wnt通路活性，发挥其抑制肿瘤细胞增殖的作用。Furuhashi等14观察到-catenin和TCF-4能够诱导Xtwn-lux启动子的表达，

40、而大剂量的axin能够抑制-catenin和TCF-4的这种作用，但没有检测TCF-4表达量的变化和axin是否影响TCF-4的表达。而我们的发现提示axin能够同时通过诱导-catenin降解和减少TCF-4转录来抑制其诱导的启动子表达。Axin抑制TCF-4的具体机制目前还未见相关报道，有重要意义的线索是，有研究15,16发现-catenin能够与p300结合促进TCF-4转录，而高表达的p53能够抑制TCF-4的转录。据此，我们推测axin可能通过促进p53功能或诱导-catenin降解而间接抑制TCF-4的转录，其具体机制有待进一步深入研究。有报道2,9认为axin可能通过诱导-cat

41、enin降解、促进p53功能和激活JNK通路等途径发挥其诱导凋亡、抑制肿瘤细胞增殖的作用。本研究也发现转染axin 基因后，肺癌BE1细胞的增殖减少，凋亡率增加。另外，转染axin 基因能够明显抑制肺癌BE1细胞的侵袭能力，这可能是因为axin抑制了-catenin和TCF-4的表达和Wnt通路活性，进而使MMP-7等与侵袭相关的靶基因表达减少1。综上所述，axin过表达能下调-catenin和TCF-4的表达，抑制肺癌BE1细胞的增殖和侵袭能力，并诱导肺癌BE1细胞凋亡。Axin能通过多条途径，从多个方面抑制肿瘤的恶性表型。深入研究axin的抑癌机制，探索充分发挥axin抑癌作用的可行方法对

42、揭示肿瘤的发生、发展机制和寻找新的肿瘤治疗策略有重要意义。参 考 文 献1 Huang H, He X. Wnt/beta-catenin signaling: new (and old) players and new insights. Curr Opin Cell Biol, 2008, 20(2): 119-125.2 Lustig B, Behrens J. The Wnt signaling pathway and its role in tumor development. J Cancer Res Clin Oncol, 2003, 129(4): 199-221.3 Kiku

43、chi A, Yamamoto H. Tumor formation due to abnormalities in the beta-catenin-independent pathway of Wnt signaling. Cancer Sci, 2008, 99(2): 202-208.4 Xu HT, Wang L, Lin D, et al. Both abnormal -catenin and reduced axin expression are associated with poor differentiation and progression in non-small c

44、ell lung cancer. Am J Clin Pathol, 2006, 125(4): 534-541.5 Polakis P. The many ways of Wnt in cancer. Curr Opin Genet Dev, 2007, 17(1): 45-51.6 Salahshor S, Woodgett JR. The links between axin and carcinogenesis. J Clin Pathol, 2005, 58(3): 225-236.7 Nakajima M, Fukuchi M, Miyazaki T, et al. Reduced

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