实验三 果蝇唾液腺染色体

1、实验五果蝇唾腺染色体的观察实验目的 练习分离果蝇幼虫唾腺的技术，学习唾腺染色体的制片方法 观察果蝇唾腺巨大染色体的结构特点 了解果蝇唾腺染色体在遗传学研究中的意义实验原理上世纪初，D. Kostoff用压片法首先在D. melanogaster 果蝇幼虫的唾液腺细胞核中发现了特别巨大的染色体唾液腺染色体（salivary gland chromosome）。事实上， 双翅目昆虫（如摇蚊、果蝇等）的幼虫期都具有很大的唾腺细胞，其中的染色体就是巨大的唾液腺染色体。这些巨大的唾液腺染色体具有许多重要特征，为遗传学研究的许多方面，如染色体结构、化学组成、基因差别表达等提供了独特的研究材料。唾腺染色体形

2、成原理双翅目昆虫的整个消化道细胞（从唾液腺一直到直肠） 发育到一定阶段之后就不再进行有丝分裂而停止在分裂间期。此时唾液腺细胞的数量不再增加，仅体积增大，其核内染色体连续不断地复制，但着丝点不分裂形成由上千条螺旋状的染色线构成一条多线染色体。多线染色体螺旋化程度低、异常松弛，并且同源染色体常处于紧密配对状态“体细胞联会”。因此多线染色体比细胞分裂中期的染色体长100200倍，宽10002000倍，相当于普通染色体的100150倍，因而又称为多线染色体（polytene chromosome)或巨大染色体（giant chromosome), 显微镜下计数比一般体细胞染色体数少一半。v 多线染色体

3、：果蝇的唾腺细胞停止在分裂间期（永久间期），染色体白纤维不断复制，平行排列形成巨大而伸展的多线染色体. 唾腺染色体经过多次复制而并不分开，每条染色体大约有10004000根染色体丝的拷贝，所以又称多线染色体(polytene chromosome)v 事实上，双翅目昆虫（如摇蚊、果蝇等）的幼虫期都具有很大的唾腺细胞，其中的染色体就是巨大的唾液腺染色体。这些巨大的唾液腺染色体具有许多重要特征，为遗传学研究的许多方面，如染色体结构、化学组成、基因差别表达等提供了独特的研究材料。v 体细胞联会somatic synapsis另一特点是体细胞中同源染色体处于紧密配对状态，这种状态称为“体细胞联会”。在

4、以后不断的复制中仍不分开，由此成千上万条白纤维丝结合在一起，紧密盘绕。所以细胞中染色体呈单倍数。v 横纹结构由于每条染色体的染色线在不同的区段螺旋化 程度不一，因而出现一系列宽窄不同、染色深浅不一或明暗相间的横纹。不同染色体的横纹 数量、形状和排列顺序是恒定的。利用这些特征不仅可以鉴定不同的染色体，还可以结合遗 传实验结果进行基因定位。此外，由于其体细胞同源染色体的配对，故易于进行染色体的缺失、重复、倒位和易位的细胞学观察和研究。有膨突（puff)Puff结构：幼虫的不同发育期，浓缩的染色质纤维会成群解旋、松开，形成泡状松散结构，使相应的基因得以表达，这种泡状结构称Puff结构，亦称染色体的疏

5、松。实验原理黑腹果蝇的染色体数为2n=24，其中第II、第III染色体为中部着丝粒染色体，第IV和第I（X染色体）染色体为端着丝粒染色体。而唾液腺染色体形成时，染色体着丝粒和近着丝粒的异染色质区聚于一起形成一染色中心（chromocenter），所以在光学显微镜下可见从染色体中心处伸出6条染色体臂， 其5条为长臂，1条为紧靠染色中心的很短的臂。果蝇染色体模式图粒 2LX 4 2R 3L染色中心3R2R3L 4 着丝X 2L3R图2果蝇唾腺染色体模式图图1果蝇唾腺染色体核型图实验器材与试剂1.材料：野生型果蝇的三龄幼虫2.药品：0.7%生理盐水红1NHCl改良苯酚品3.用具：显微镜片解剖针吸水纸

6、载玻片 盖玻方法与步骤三龄幼虫的饲养：通过控制成虫的时间来控制幼虫密度，以保证幼虫发育良好，一般标准培养瓶以10对成虫交 配后12h所产卵为宜，这样可使培养基表面幼虫密度为20-40条。采用较低的温度培育有利于幼虫发育良好，一般采用15-18为宜。三龄幼虫必须十分肥大，以保证唾液腺发育良好。幼虫的雌雄鉴别用雌虫效果较好。幼虫置于滴有一滴生理盐水的载玻片 上，在解剖镜下观 察，幼虫体后1/3处，气管两侧有一个大果蝇的唾液腺是位于口器后端神经节两侧的一对透明而微白的类似香蕉形的长形否则为雌性。实验步骤1 .选材取培养好的充分发育的幼虫，通常取爬到瓶壁上即将化蛹的大幼虫即是三龄幼虫。2.唾腺剖取在载

7、玻片上滴一滴0.7NaCl溶液（或无菌水），选择行动迟缓、肥大、爬在管壁上即将化蛹的三龄幼虫，或者选择经低温处理的果蝇三龄幼虫置于其中。由于果蝇的唾液腺位于幼虫体前1314处（有一黑色口器）， 所以在解剖镜下左手持解剖针按压住幼虫后端13处。固定幼虫，右手持解剖针扎住幼虫头部口器处， 适当用力向后拉，把头部与身体拉开，唾液腺腺体随之而出。把载玻片移到显微镜下查找唾液腺。 可见一对微白，半透明的长形，即为唾腺，其侧面常带有少量泡沫状、颜色稍深的脂肪体，注意区别，并用解剖针将其拨离。如唾腺未被拉出，可用针自虫体前1/3处轻轻向前挤压，可将其挤出。唾腺脂肪带实验步骤3. 解离把载玻片上的幼虫其它部分

8、除去，用吸水纸小心吸去生理盐水（注意吸水纸应离唾腺远些，以免吸附唾腺），加1滴1N HCl，浸23分钟，使组织疏松，以便压片时细胞分散，染色体散开。4. 洗涤吸去盐酸，在解离后的腺体上滴一滴水洗去残余的盐酸，吸去多余的水。反复2-3次。5. 染色滴加改良苯酚品红染液染色15分钟(解剖和染色过程勿使腺体干燥)。实验步骤6. 压片盖上盖玻片, 盖玻片上盖一滤纸，左手指按压住, 同时用右手大拇指指肚稍用力摁压盖玻片,并横向揉几次（不要使盖玻片移动），然后用铅笔头轻敲盖片，使唾腺细胞核破裂,核中的染色体舒展开来，最后用吸水纸吸尽多余染液。7. 观察先将压好的玻片标本放在低倍镜下观察,找到清楚的染色体物

9、像后,将观察目标移到视野中心,再用高倍镜观察。注意事项1. 一定要加水，否则唾腺易干。2. 水不可太多，否则幼虫会漂浮而且活跃。如水多了，在剥离唾腺前吸走一些，唾腺剥离后请勿将唾腺和水一起吸走。3. 清除脂肪组织时要量力而行。4. 染色液勿过多，否则压片时唾腺易随染色液漂走。如染色时间到后，染色液已干，应再少加些染色液，再盖上盖玻片，避免气泡产生。5. 压片时要均匀用力，轻敲盖片。横纹结构：染色质凝缩染色粒DNA深染种的特异性：横纹的宽窄、疏密、顺序、数目2.腺体剖取1、选取行动迟缓，身体肥大的三龄幼虫，载片1滴0.7%的生理盐水中，左手持一支解剖针按住幼虫尾部1/3处，右手持另一支解剖针按住幼虫头部口器部位稍后（唾液腺基部位置处） 并往外拉，将头部从身体拉开，此时一对透明的棒状腺体-唾液腺随之而出。2、用解剖针剥离唾液腺上附着的白色（或灰色）脂肪体，先小心吸去生理盐水，再加入1滴1N HCl处理2-3 m，小心吸去HCl，用dH2O浸洗次，小心吸去水分。、加入滴改良的苯酚品红，染色-15分左右，当腺体被