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1、实验二 DNA的酶解,一、原理,所谓DNA酶解就是DNA被限制性内切酶切成大小不等的片段。可用于Southern分析或DNA体外重组等实验,限制性内切酶：共有三类，但只有第类识别位点和切点在相同部位，因而是实用的，这类内切酶通常识别DNA中46个核苷酸的顺序，识别的顺序为二重对称。酶解产生的DNA片段末尾可以是平齐末端(如Hae )或粘性末端（如EcoR I）。,限制性内切酶（restriction endonuclease),HpaI 5GTTAAC 3 3CAATTG 5 5GTT AAC 3 3CAA TTG 5,e.g. Hind I Hind II Hind III (流感嗜血杆菌中

2、三个酶 Haemophilus influenzaed)第一个字母（大写、斜体） 该酶的微生物属名第二、三个字母（小写、斜体） 代表微生物种名第四个字母（斜体） 代表寄主菌的株或型用罗马数码I、II、III等区分同一株具 有不同特异性的酶,命名:,应用:外源基因与载体的连接 （DNA连接酶）,（1）互补粘端DNA或切口间的连接 5 ACGOH pAATTCGT 3 3 TGCTTAAp HOGCA 5 ATP、Mg2+ T4连接酶 5 ACGAATTCGT 3 3 TGCTTAAGCA 5,反应例解：,（2）平端连接5 C G AOH pC G T A 33 G C Tp OHG C A T

3、5 ATP、Mg2+ T4连接酶 5 CGACGTA 3 3 GCTGCAT 5,酶单位定义：在最适温度，最适pH条件下，一小时完全水解1g噬菌体DNA所需的酶量定为1个单位(u)。,二、方法,1取0.1glDNA溶液10l于一干净的0.5ml Eppendorf管中。 2加10Hind酶解缓冲液2l，0.4u/l Hind 5l，双蒸水3l，使反应总体积20l, 充分混匀。 3在37水浴中保温2hr，保温结束后加2l终止液，混匀。 4电泳观察酶解结果。,酶解体系,三、注意事项,1限制性内切酶较昂贵，且极易失活，要特别注意酶活力的保存，酶保存缓冲液一般有10mmol/LTris-HCl (pH7.4)，50100mmol/L NaCl或KCl，lmmol/L DTT，100200gml BSA (保持蛋白浓度，使酶稳定)，50甘油(存于-20不结冰，结冰反复解冻使酶失活) 2限制性内切酶用量极少，必须严格注意吸样量的准确性及全部放入反应体系中 3注意酶切时加样次序：水、缓冲液、DNA、最后才加酶 取液时，Tip要从溶液表面吸，以防Tip沾去过多酶，待用的内切酶要放在冰浴内，用后盖紧盖子，立即放回20冰箱，防止限制性

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