鸡胚原代细胞培养

1、.鸡胚原代细胞培养 实验材料910日龄鸡胚，hanks液50ml，05水解乳蛋白液或mem培养液20ml(内含犊牛血清1ml，双抗02ml，ph72)，o25胰蛋白酶5ml、7nahc031ml，手术剪，镊子，灭菌的培养皿，50ml三角瓶，滴管若干，链霉素小空瓶若干(加入细胞悬液培养用)，高压灭菌塞子若干，培养盘，蛋座，95酒精，水浴锅。实验内容及操作程序1配液制备细胞前先在hnaks液中加青、链霉素，使其含量为青霉素100iu/ml，链霉素100g/ml，用7nahc03调整ph至7274，将胰蛋白酶调整ph76(玫瑰红色)。置37水浴锅中预热备用。2. 取胚及剪碎将胚蛋气室端向上直立于蛋座

2、上，用碘酊消毒气室，以镊子击破卵壳并弃之，撕破卵膜揭之，继撕破绒尿膜、羊膜，取出胚胎于灭菌平皿中。剪去头部、翅爪及内脏，用hanks液(简称h液)洗去体表血液，移人灭菌三角瓶中，用灭菌剪刀剪碎鸡胚，使成为约1mm3大小的碎块，加5ml h液轻摇，静止12min，使其组织块下沉。吸去上层悬液，依同法再洗2次，至上悬液不混浊为止，吸干h液留组织。3消化自水浴锅内取出预热的胰酶，按组织块量约35倍加入三角瓶中，1个鸡胚约需5ml胰酶，三角瓶上加塞，以免co2挥发及污染。37水浴约20min左右，每隔5min轻轻摇动1次，由于胰酶作用，使细胞与细胞之间的氨基和羧基游离，待液体变混而稍稠，此是再轻摇可见

3、组织块悬浮在液体内而不易下沉时，则需中止消化，如再继续消化下去可破坏细胞膜而不易贴壁生长，如果消化不够，则细胞不易分散。精品.4洗涤取出三角瓶后静置1min，让组织块下沉后，吸去胰酶液，用10ml hanks液反复轻洗3次，以洗去胰酶，吸干上清液，留组织块。5吹打加2ml含血清的05水解乳蛋白营养液或：mem培养液，以粗口吸管反复吹吸数次，使细胞分散，此时可见营养液混浊即为细胞悬液。静置1min，使未冲散的组织块下沉后，小心地将细胞悬液吸出1ml于20ml营养液中，此液细胞数约50万70万/ml。如需大量细胞，可继续加营养液冲打，一个鸡胚约可做100ml细胞悬液。6细胞计数取上述细胞悬液05m

4、l加入01结晶紫一柠檬酸(0.1mol/l)溶液2ml，置室温或37温箱中510min，充分振动混合后，用毛细管吸取滴人血细胞计数板内，在显微镜下计数。计数方法按白细胞计数法，计算四角大格内完整细胞的总数。如35个聚集在一起，则按1个计算，然后将细胞总数按下法换算成每毫升中的细胞数。细胞数/ml=4大格细胞总数/410 000稀释倍数例如：4大格的细胞总数为284个，而稀释倍数为5(05ml染色液)，则每毫升细胞悬液的细胞数为284/410 0005=35104个。7稀释按照每毫升50万70万个细胞密度的标准，将细胞悬液用营养液稀释之。精品.(计数时，可见到大部分细胞完整分散，35个细胞成堆，

5、且细胞碎片很少，说明消化适度；如分散细胞少，则消化不够；如细胞碎片多，则消化过度。)活细胞计数法取2台盼蓝溶液1滴，细胞悬液1滴，混合计数，活细胞不着色，死细胞呈蓝色。8分装培养分装于链霉素瓶中，每瓶约1ml，瓶口橡皮塞要塞紧。不合适者弃去，以免漏气造成污染或c02跑掉而营养液变碱。将细胞瓶横卧于培养盘中，于瓶上面划一直线，以表示直线的对侧面为细胞在瓶内的生长位置。瓶上注明组别、日期，置37温箱培养，4h后细胞即可贴附于瓶壁，2436h生长成单层细胞，此时可吸去培养液，更换维持液，并接种病毒。附：细胞培养所需的常用培养基与试剂1hanks液配制原液甲nacl 8gkcl 2gmgso47h20

6、 2gmgcl26h20 2g28cacl2 100ml双蒸水 加至1 000ml精品.先将固体成分加于800ml双蒸水中，加温到5060加速溶解，再加入cacl2溶液，最后加双蒸水补足到1 000ml。加氯仿2ml，摇匀后于4贮存。原液乙na2hpo42h20 1.2gkh2po42h20 1.2g葡萄糖 20g04酚红 looml双蒸水 加：1 000ml将上列各物混合后使其溶解，加氯仿2ml，摇匀后于4贮存。hanks工作液原液甲 1份原液乙 1份双蒸水 18份工作液分装100ml，或500ml盐水瓶中，115c灭菌10min，使用前以7nahco3调节ph至0 7276。204酚红溶液

7、配制酚红 0.4g精品.01naoh溶液 11.28ml将酚红置于研钵中，加磨边缓缓加naoh溶液，直到所有颗粒完全溶解，置于至looml量杯中，最后加双蒸水至looml，摇匀后，保存于4冰箱内备用。3. 0.5乳蛋白水解物溶液配制乳蛋白水解物 5ghanks液 l 000ml将乳蛋白水解物放入1 000ml hanks液中，待完全溶解后，摇匀分装于looml的盐水瓶中，每瓶95ml，115 lomin灭菌，4贮存备用。4营养液(生长液)配制o5乳蛋白水解物 95ml犊牛血清 5ml青霉素、链霉素 lml将上述溶液混合后，以7nahco3适量调节ph到7.27.4。维持液按上述方法，加犊牛血清

8、2.5ml即成。5mem培养液mem培养基一袋，加1 000ml双蒸水，过滤除菌或高压灭菌，分装于100ml盐水瓶中，每瓶90ml，用前以 7nahc03调ph到7.27.4，并加10犊牛血精品.清。6双抗配制青霉素 100万iu链霉素 1ghanks液 100ml将青、链霉素溶解于：100ml hanks溶液中，此为双抗溶液，无菌操作，分装小瓶，每瓶：lml，内含有青霉素iiu，链霉素10000g，低温冻结保存。使用时每100ml营养液中加双抗lml，即每ml营养液中含青霉素100iu，链霉素100gg。7. 7 nahco3溶液配制nahco3 7g双蒸水 100ml将nahc03溶于双蒸水中，置水浴锅中加热溶解，115 10min灭菌后，无菌操作分装小瓶，每瓶lml，4保存。8. 0.25胰蛋白酶配制胰蛋白