抗禽流感病毒剂及含有抗禽流感病毒剂的产品

1、 (19)人民国家知识产权局*CN102170890A*(12)发明专利申请(10)申请公布号 CN 102170890 A(43)申请公布日 2011.08.31 (21)申请号 200980140338.4(74)专利机构 上海金盛协力知识产权 31242 人 段迎春 (22)申请日 2009.10.08(30)优先权数据2008-262199 2008.10.08(51)Int.Cl.JPA61KA61K A61P36/18 (2006.01)36/00 (2006.01)31/16 (2006.01)(85)PCT申请进入国家阶段日2011.04.06 (86)PCT申请的申请数据PC

2、T/JP2009/067533 2009.10.08(87)PCT申请的公布数据WO2010/041702 JA 2010.04.15(71)申请人 百佳株式会社地址 日本国爱知县 (72)发明人 福本修一 熊谷贤治 铃木康夫农鲁克斯利伟赖贾鲁恩 权利要求书 1 页说明书 8 页附图 5 页(54) 发明名称抗病毒剂及含有抗病毒剂的产 品 (57) 摘要一种抗病毒剂，含有作为活性成分的组分，所述组分使用主要由水和亲水性有机溶剂的至少一种的组成的萃取溶剂从番石榴中萃取的番石榴提取物经过高效液相色谱 (HPLC) 在特定条件下分离而获得。所述特定条件包括使用 ODS 柱，所述番石榴提取物施加至 O

3、DS 柱后的 15 分钟内以甲醇的浓度为 20的水- 甲醇混合物作为流动相洗脱， 随后的15 到30 分钟期间使用甲醇浓度为 40的水 - 甲醇混合物作为流动相。供选地， 特定条件还包括所述番石榴提取物施加至 ODS 柱后的第 30 到 45 分钟时间内使用甲醇浓度为 60 的水 - 甲醇混合物作为流动相。包含在抗病毒剂中的组分在番石榴提取物施加到 ODS 柱后第 20 分钟内或在随后的第 20 到 35 分钟期间内从该柱洗脱。 CN 102170890 A 权利要求书CN 1021708960 A1/1 页1. 一种抗病毒剂，其特征为含有作为活性成分的组分，所述组分是将使用主要由水和亲水性有

4、机溶剂中的至少一种组成的萃取溶剂从番石榴中提取的番石榴提取物经过高效液相色谱在特定条件下分离而获得的，其中所述特定条件包括使用内径 20mm 和长度250mm 的ODS 柱，所述番石榴提取物施加至 ODS 柱后的 15 分钟内使用甲醇浓度为 20的水- 甲醇混合物作为流动相，随后的 15 到 30 分钟期间使用甲醇浓度为 40的水- 甲醇混合物作为流动相，所述流动相的流速为 10mL/ 分钟，其中包含在所述抗病毒剂中的所述组分在所述番石榴提取物施加至 ODS 柱后至第 20 分钟的时期内从 ODS 柱中洗脱。 2. 根据权利要求 1 所述的抗病毒剂，其中在所述番石榴提取物施加至 ODS 柱后至

5、第 20 分钟的时期内从 ODS 柱洗脱的包含在所述抗聚吡咯烷酮处理的。 病毒剂中的所述组分是经聚乙烯3. 一种抗病毒剂，其特征为含有作为活性成分的组分，所述组分是将使用主要由水和亲水性有机溶剂中的至少一种组成的萃取溶剂从番石榴中提取的番石榴提取物经过高效液相色谱在特定条件下分离而获得的，其中所述特定条件包括使用内径 20mm 和长度250mm 的ODS 柱，所述番石榴提取物施加至 ODS 柱后的 15 分钟内使用甲醇浓度为 20的水- 甲醇混合物作为流动相，随后的 15 到 30 分钟使用甲醇浓度为 40的水- 甲醇混合物作为流动相，随后的第30 到第45 分钟使用甲醇浓度为60的水- 甲醇

6、混合物作为流动相， 所述流动相的流速为 10mL/min，其中包含在所述抗病毒剂中的所述组分在所述番石榴提取物施加至 ODS 柱后第 20 到第 35 分钟内从 ODS 柱中洗脱。 4. 根据权利要求 3 所述的抗病毒剂，其中在所述番石榴提取物施加至 ODS 柱后的第 20 到第 35 分钟内从ODS 柱洗脱的包含在所述抗聚吡咯烷酮处理的。 5. 根据权利要求 1 到 4 中的任一项所述的抗剂。 病毒剂中的所述组分是经聚乙烯病毒剂，其是预防或治疗的 6. 根据权利要求 5 的所述抗病毒剂，其中为 H5N3 或 H5N1 株。 7. 权利要求1 到4 中的任一项权所述的抗中的用途。 病毒剂在制备

7、预防或治疗的制剂8. 一种含有抗病毒剂的产品，其特征在于含有根据权利要求 1 到 4 中的任一项 所述的抗病毒剂。 2 说明书CN 1021708960 A1/8 页抗病毒剂及含有抗病毒剂的产品技术领域本发明涉及抗病毒剂和含有抗病毒剂的产品。0001背景技术0002病毒为流感病毒A 的通用名，主要感染鸟类，野生水鸟为其天然的宿主。一些病毒感染家禽，例如鸡、鹌鹑和火鸡，导致高致病病毒的全球性威胁。 染。养鸡业正面临着来自这些高致病性0003尽管已经开展了对预防病毒感染的疫苗的开发和研究 ( 见例如，专利文献1)，目前尚没有能完全预防病毒感染的疫苗。所以当病毒感染实际爆发时，实际采取的措施是立即消

8、灭爆发点几公里半径内家禽。H5N1 亚型病毒是一种病毒的亚型，已经有报导人在与大量病毒接触或由于宿主的易感染的体质而出现 H5N1 亚型病毒的感染。 0004 现有技术文献 0005专利文献 1 ：日本国家阶段专利特许公开号 ：2008-515906 发明内容0006 本发明要解决的技术问题 抗0008病毒剂和含有该抗解决该技术问题的手段 病毒剂的产品。 0009 为实现上述目的，本发明的一个方面提供了抗病毒剂，其含有作为活性成分的组分，所述组分使用主要由水和亲水性有机溶剂的至少一种的组成的萃取溶剂从番石榴中提取的番石榴提取物经过高效液相色谱 (HPLC) 在特定条件下分离而获得。特定条件包括

9、使用内径20mm 和长度250mm 的ODS 柱，在番石榴提取物施加至ODS 柱后的15 分钟内以甲醇浓度为20的水- 甲醇混合物作为流动相，随后的 15 到 30 分钟使用甲醇浓度为 40 的水和甲醇混合物为流动相，流动相的流速为 10mL/min。包含在抗提取物施加至 ODS 柱后的第 20 分钟内从 ODS 柱中洗脱。 病毒剂中的该组分在番石榴0010 本发明的另一方面提供了抗病毒剂，其含有作为活性成分的组分，所述组分在番石榴提取物施加至ODS 柱后的第20 到35 分钟时间内从ODS 柱洗脱，其中特定条件还包括在番石榴提取物施加至ODS 柱后的第 30 到 45 分钟使用含有甲醇浓度为

10、 60的水- 甲醇混合物作为流动相。 0011本发明的又一方面提供了包含抗病毒剂的产品，该产品含有上述抗病毒剂。 0012 本发明的技术效果 0013 本发明提供具有良好的抗病毒作用的抗病毒剂和含有抗病 3 说明书CN 1021708960 A2/8 页毒剂的产品。附图说明001400150016图 ； 00170018001900200021002200230024图 1(a) 显示用于分离番石榴提取物的高效液相色谱的流动相的梯度曲线图 ； 图 1(b) 为番石榴提取物的高效液相色谱分离获得的 HPLC 图谱 ； 图 2(a) 为用于样品A 到F 和样品Mx 的高效液相色谱分析中的流动相的梯

11、度曲线 图 2(b) 为样品 Mx 的高效液相色谱分析获得的 HPLC 图 ； 图 2(c) 为样品 A 的高效液相色谱分析获得的 HPLC 图 ； 图 2(d) 为样品 B 的高效液相色谱分析获得的 HPLC 图 ； 图 3(a) 为样品 C 的高效液相色谱分析获得的 HPLC 图 ； 图 3(b) 为样品 D 的高效液相色谱分析获得的 HPLC 图 ； 图 3(c) 为样品 E 的高效液相色谱分析获得的 HPLC 图 ； 图 3(d) 为样品 F 的高效液相色谱分析获得的 HPLC 图 ；和 图 4(a) 和 4(b) 为显示病毒样品混合物中番石榴提取物的组分浓度与测量的荧光 强度之间的关

12、系的图。具体实施方式0025 将在下文中详细描述本发明的一个实施方式。 0026 根据该实施方式的抗病毒剂含有作为活性成分的组分，使用特定的萃取溶剂从番石榴 (Psidium Guajava Linn) 提取的番石榴提取物在特定的条件下通过高效液相色谱分离时，经特定的洗脱时间而获得该组分。 0027番石榴，在日本也称 banjiro 或banzakuro，是一种原产于热带地区的桃金娘科的番石榴属常绿小乔木。番石榴自然生长在，例如，加勒比海沿岸、种植在温暖的地方，例如日本的冲绳岛。 洲、南美洲北部和东南亚，0028可使用番石榴的任何器官或任何器官的组分作为用于番石榴提取物的提取原料。提取原料可以

13、是番石榴的单个器官或其组分或番石榴的两种或更多种器官或其组分的组合物。为获得具有良好的抗榴的叶或茎。 病毒作用的番石榴提取物，提取原料优选至少含有番石0029 用于提取的原料在如下状态时进行提取操作 ：收获后状态，收获后破碎、粉碎、或研磨状态，收获后干燥状态，收获干燥后破碎、粉碎、或研磨状态，收获后破碎、粉碎、或研磨再干燥的状态。为有效进行萃取，用于提取的原料优选是破碎的。为获得具有良好的抗石榴提取物，用于提取的原料优选为原叶。 病毒作用的番用于从原材料中提取番石榴提取物的萃取溶剂主要由水和亲水性有机溶剂的至0030少一种组成。即萃取溶剂中的水和亲水性有机溶剂的至少一种以最高比例存在( 体积

14、)。萃取溶剂中水或亲水性有机溶剂的含量优选为 50 体积或更高，更优选为 70 体积或更高。当萃取溶剂同时含有水和亲水性有机溶剂时，水和亲水性有机溶剂的总含量优选为 50 体积或更高，更优选为 70 体积或更高。 0031萃取溶剂中亲水性有机溶剂的实例包括低级醇 ( 例如甲醇和乙醇 )、和乙酸 4 说明书CN 1021708960 A3/8 页乙酯。萃取溶剂可仅含有一种亲水性有机溶剂或两种或更多种亲水性有机溶剂。萃取溶剂可包含少量的除了水和亲水性有机溶剂外的溶剂。可在萃取溶剂中溶解有，例如，有机盐、无机盐、缓冲剂或乳化剂。 0032通过将用于提取的原料浸入到萃取溶剂中预定的时间进行番石榴提取物

15、的萃取。此时若有必要，可搅拌、加热或加压提取溶剂。总的说来，当提取温度升高，萃取需要的时间就减 少。例如，当在室温、1 到 2 个大气压下，萃取时间长达 10 天，在 50 到 130下萃取仅 需 0.05 到 2 小时或者 0.1 到 0.3 小时。萃取条件可根据用于提取的原料的状况或萃取溶剂的种类做适当改变。 0033从原料萃取的番石榴提取物经过固 - 液分离以分离和除去提取用的原料的残余物。例如，可通过已知的方法例如过滤或离心进行固 - 液分离。 0034 通过固 - 液分离除去固体，随后番石榴提取物经过高效液相色谱在特定条件下分离。在高效液相色谱分离中使用内径为 20mm 和长度为 2

16、50mm 的 ODS 柱。ODS 柱用固相填充， 例如，表面用含有 18 个碳原子的十八烷基硅烷基团修饰的化学键合多孔球形硅胶。ODS 柱可为，例如，YMC Co.，Ltd. 生产的SH-343-5( 硅胶颗粒大小为 5m，缝直径为 12nm)。使用水和甲醇的混合溶剂作为流动相。当番石榴提取物施加至 ODS 柱后，混合溶剂中的甲醇浓度随着预定时间按照图 1(a) 所示的梯度曲线分步改变。具体地，在番石榴提取物施加至ODS 柱后 15 分钟时间内(0 到 15 分钟) 混合溶剂的甲醇浓度为 20，接下来的 15 到 30分钟时间内为 40，再接下来的 30 到 45 分钟时间内为 60。流动相的

17、流速设定为 10mL/ min，柱温优选为室温 (25 )。 0035本实施方式的抗病毒剂含有作为活性成分的组分，该组分在番石榴提取物施加至ODS 柱后 20 分钟(0 到 20 分钟) 的第一个时间段内从ODS 柱洗脱的组分，或在接下来的 20 到 35 分钟的第二个时间段内从ODS 柱洗脱的组分。抗病毒剂可以是在第一个时间段或第二个时间段从 ODS 柱洗脱的洗脱液，或是通过已知的干燥处理例如冷冻干燥将洗脱液粉末化获得的产物。粉末化第一个时间段的洗脱液获得的产物为棕红色，微粘，而粉末化第二个时间段的洗脱液获得的产物为棕红色，粉末状。 抗病毒剂可施加到用于抗病毒作用的产品中。这种包含抗病毒00

18、36剂的产品的实例包括医疗剂 ( 包括药品 )、清洁剂、化妆品、医疗器械、卫生材料、卫生用品、食品和饮料。医药剂的示例包括药品。清洁剂的实例包括衣物软化剂、衣物漂白剂、香皂、沐浴剂、洗涤剂、洗发水和牙膏。化妆品的实例包括洗脸香皂，洗手香皂、手霜、香水、洗剂、乳状洗剂、美容精华液 (beauty essence)、美容霜、唇膏、唇油、和粉饼。医疗器械的示例包括口罩、绷带、纱布、手套、胶布、棉签、诊断仪器及器械、手术仪器及器械、治疗仪器及器械、医院仪器及器械、牙科仪器及器械、辅助医疗器械、和矫形器。卫生材料的实例包括纱布、脱脂棉、无纺布面料、棉签棒。卫生用品的实例包括加湿器、空调、空气清洁器。食品

19、和饮料的实例包括健康医疗和健康食品。医药剂和化妆品也包括类似药物例如漱口水、润喉糖、润喉喷剂、医疗肥皂和防腐剂。 0037 含有抗病毒剂的药物和类药物可以任何方法给药，例如口服给药、血管内给药、经皮给药。药物和类药物的剂型可以是，但不限于例如，粉末、粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、丸剂、栓剂、溶液、注射或搽剂。在不妨碍实现本发明的目的的前提下，药物和类药物 可含有添加剂例如辅料、基质、乳化剂、溶剂和稳定剂。 5 说明书CN 1021708960 A4/8 页0038含有抗病毒剂的食物和饮料通过将抗病毒剂加入到任意食品原料 或饮料原料制备。食品和饮料的制备形式，例如，粉末、片剂、颗粒、液体 ( 饮用

20、制剂等)、胶囊、糖浆、糖可用于健康食品和饮食补充食品。食品和饮料的具体实例包括运动饮料、从茶叶、草药、及类似物中提取的茶饮料、饮食产品例如牛奶和酸奶、含有胶凝剂的食品例如果胶和卡拉胶、糖例如硬糖、软糖和橡皮糖、口香糖，含有糖的食品和饮料例如葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖、和糊精、调味剂、甜味剂例如甜菊、阿司帕坦、和糖醇、和油脂例如植物油和脂肪和动物油和脂肪。在不妨碍实现本发明的目的的前提下，食品和饮料可含有添加剂例如基质、赋形剂、添加剂、子材料 (sub material) 和膨胀剂。 病毒根据血凝素和神经氨酸酶的类型分为亚型例如 H5N3、H5N1、H5N7、0039H5N2、和 H7N3，本实施

21、方式的抗病毒剂可用于抗任何病毒。 根据本实施方式，可获得以下优点 ： 00400041本实施方式的抗病毒剂具有良好的抗病毒作用。因此抗病毒剂可用于治疗感染病毒的家畜( 包括家禽)，以及感染了病毒的人，还可用于预防病毒剂用作预防和治疗健康家畜 ( 包括家禽 ) 以及人被病毒的制剂。 病毒感染。即，抗由于本实施方式的抗病毒剂提取自天然植物番石榴，本实施方式的抗0042病毒剂具有高度的安全性。 0043上述实施方式可如下改变。 0044 抗病毒剂可以是用聚乙烯聚吡咯烷酮 (PVPP) 处理在第一个时间段内 ( 番石榴提取物施加到ODS 柱后 20 分钟内) 洗脱自ODS 柱的洗脱液而获得产品，或用聚

22、乙烯聚吡咯烷酮处理在第二个时间段内( 接下来的 20 到 35 分钟的时间段内) 洗脱自ODS 柱的洗脱液而获得的产品。在这种情况下，可除去吸附到聚乙烯聚吡咯烷酮的组分。 在下文中，将参照实施例更加具体地说明本发明。 实施例 004500460047 0048 1kg 番石榴原叶 (raw leaves) 切成大约 1 平方厘米的片，在室温下浸入到 10L 含有乙醇和水比例为 3 7 乙醇水溶液中 10 天。然后，将通过过滤该溶液得到的滤液浓缩和干燥以得到 65.1g 粉末状番石榴提取物。将 6.5g 该番石榴提取物溶解到 50mL 含有乙醇和水的比例为 2 1 的乙醇水溶液中。获得的溶液在

23、3000rpm 离心 15 分钟。然后，上清液通过Advantec MFS Inc. 生产的孔径为0.80m的醋酸纤维素过滤器(DISMIC-25CS080AN) 过滤，收集滤液作为分离用的样品。然后，该分离用样品用高效液相色谱在以下条件下分离 ：0049 ( 高效液相色谱分离条件 ) 柱 ：YMC Co.，Ltd. 生产的 SH-343-5( 柱的内径和长度分别为 20mm 和 250mm，硅胶0050颗粒大小为 5m，缝直径为 12nm)。 0051流动相 ：水 - 甲醇混合物为流动相，其中在番石榴提取物施加到该色谱柱后的 15 分钟内(0 到 15 分钟) 使用甲醇的浓度为 20的水和甲

24、醇混合物为流动相，然后在接下来的 15 到 30 分钟使用甲醇浓度为 40的水和甲醇混合物为流动相，接下来的 30 到 45 分钟 时间内使用甲醇浓度为 60的水和甲醇混合物为流动相，再接下来的 45 到 50 分钟内甲醇浓度为 100的水和甲醇混合物为流动相 ( 见图 1(a)。 6 说明书CN 1021708960 A5/8 页0052流动相流速 ：10mL/min 0053柱温 ：室温 (25 ) 0054检测波长 ：255nm 在该时间内获得的HPLC 图如图 1(b) 所示。分离用的样品施加至色谱柱后在不同0055的时间，即不同的洗脱时间，得到了 6 个级分。更具体地，洗脱液在分离用

25、的样品施加至色谱柱后的 20 分钟的时间内(0 到 20 分钟)、在接下来的 20 到 35 分钟时间内、在接下来的 35 到 39 分钟时间内、在接下来的 39 到 41 分钟时间内、在接下来的 41 到 43 分钟时间内、在接下来的 43 到 50 分钟时间内分别收集，并将获得的该 6 个级分浓缩和干燥以得到如表 1 所示的 6 个粉末 A 到 F。 0056表 1 00570058粉末 A 到 F 溶解在乙醇水溶液 (10 到 90 ) 中，浓度为 0.5 w/v，以制备样品 A 到F。类似地，前述得到的粉末状番石榴提取物溶解到乙醇水溶液 (10 到 90 ) 中，浓度为0.5 w/v，

26、以制备样品 Mx。样品 A 到 F 和样品 Mx 用高效液相色谱在以下条件下分析 ： 0059( 高效液相色谱分析条件 ) 柱 ：Imtakt 公司生产的 Cadenza CD-C18(CD006 ：内径 4.6mm，长度 250mm，粒径 00603m)。 0061流动相 ：当样品施加到该色谱柱后 10 分钟(0 到 10 分钟) 流动相为甲醇浓度 10 及乙酸浓度为 5的水- 乙酸- 甲醇混合物，在接下来的 10 到 20 分钟时间内水- 乙酸- 甲醇混合物中甲醇浓度从 10线性逐渐增加到 35，在接下来的 20 到 40 分钟内为甲醇浓度 35和乙酸浓度 5的水 - 乙酸 - 甲醇混合物

27、，在接下来的 40 到 50 分钟时间内水 - 乙酸 - 甲醇混合物中甲醇浓度从 35线性逐渐增加到 100，且在接下来的 50 到 60 分钟为 100甲醇 ( 见图 2(a)。 0062006300640065流动相流速 ：0.6mL/min 柱温 ：40 检测波长 ：MaxPlot(190to 800nm)，250nm，280nm 本分析中获得的 HPLC 图如图 2(b) 到 2(d) 和 3(a) 到 3(d) 所示。更具体地，图 2(b) 显示样品Mx 的HPLC 图，图 2(c) 显示样品A 的HPLC 图，图 2(d) 显示样品B 的HPLC 图， 7 粉末 洗脱时间 (min

28、) 收率 (mg) A 0-20 2796 B 20-35 780 C 35-39 11 D 39-41 135 E 41-43 157 F 43-50 33 说明书CN 1021708960 A6/8 页图 3(a) 显示样品C 的HPLC 图，图 3(b) 显示样品D 的HPLC 图，图 3(c) 显示样品E 的HPLC 图，图 3(d) 显示样品 F 的 HPLC 图。 0066 0067上述样品 A 到 F 和样品 Mx 的抗病毒作用通过下述过程评价。 首先，MDCK 细胞 ( 犬肾上皮细胞 ) 在 96- 孔培养皿中用含有 7 FBS 的 MEM 培养液0068在CO2 培养箱中培养

29、，温度为 37，培养 2 天以形成单层MDCK 细胞。病毒(H5N3 ： A/鸭 /313/4/78 病毒 ) 的病毒原液用无血清培养液 (SF-MEM) 稀释以制备 0.7HAU 的病毒液。病毒液与等体积的各稀释液混合，该稀释液由无血清培养液 (SF-MEM) 将每个样品A F 和样品 Mx 稀释 25 倍、100 倍、400 倍、1600 倍、6400 倍、和 25600 倍 ( 接种浓度成倍 ) 获得，并将混合液在4下静置1 小时以制备病毒样品混合物。将各个病毒样品混合物100L 接种到在96 孔培养板中生长的单层MDCK 细胞中，在 34下 CO2 培养箱中进行感染处理。1 小时后移去

30、病毒样品混合物，用无血清培养液 (SF-MEM) 洗涤培养板中的培养细胞。 0069 然后，各个样品 A 到 F 和样品 Mx 用含有 2.5L 的乙酰胰蛋白酶的无血清培养液 (SF-MEM) 稀释 50 倍、200 倍、800 倍、3200 倍、12800 倍和 51200 倍。将各个获得的稀释液 100L 加入到用含有与上述浓度相同的番石榴提取物组分的病毒样品混合物接种后的MDCK 细胞中，培养板置于为 34的 CO2 培养箱中。在 18 小时，加入 50L 甲醇到每个孔中，并将培养皿置于室温 1 分钟以固定化 (immobilize)MDCK 细胞。然后，用无血清培养液(SF-MEM)

31、洗涤该细胞。然后，加入抗 -白- 单克隆抗体 (4E6) 到每个孔中，培养板在室温下静置 45 分钟，再用无血清培养液 (SF-MEM) 洗涤该细胞。然后，加入抗 - 鼠 IgG 抗体标记的 - 半乳糖苷酶 (0.1 Block Ace) 到每个孔中，并将培养板在室温下静置 45 分钟。0070然 后，加 入 40M- 甲 基 -7- 羟 基 重 豆 素 (MU)-Gal(4-methyumbelliferone (MU)-Gal)( 含有 50M MgCl2) 到每个孔中，培养板在 37下保持 45 分钟。在这个时间内， 抗- 鼠 IgG 抗体标记的- 半乳糖苷酶使用 MU-Gal 作为底物

32、产生荧光 4- 甲基-7- 羟基重豆素 (MU)。然后，将 100mM 碳酸钠缓冲液 (pH 10.6) 加入到各个孔中以终止反应，感染病毒的细胞的数量通过测定产生的 MU 数量间接测定。产生的 MU 的量使用荧光检测器在 355nm 激发波长和 460nm 荧光波长( 检测波长) 下测定。图 4(a) 和 4(b) 显示病毒样品混合物中得自番石榴提取物的组分的浓度与基于该测量获得的荧光强度之间的关系。计算每个样品的半有效浓度 (EC50)。结果见表 2。 表 2 007100728样品 EC50( w/v) A 3.2810-5 B 3.5210-5 C 26.2210-5 D 33.521

33、0-5 说明书CN 1021708960 A7/8 页如表2 所示，证实含有番石榴提取物的样品Mx 具有高抗流感病毒作用。进一步地， 0073在样品A 到F 中，样品 A 和B 显示了特别高的抗流感病毒作用，证实粉末 A 和B 在显示番石榴提取物的抗流感病毒作用中起到了关键作用。 0074 检测了聚乙烯聚吡咯烷酮 (PVPP) 处理后的样品 A 和 B 的抗病毒作用的变 0075化。PVPP 具有吸附聚合多酚例如鞣酸的作用，样品 A 和B 中含有的大多数多酚通过PVPP 处 理后除去。 首先，5.0g/L 的 PVPP 加入到 1mL 每个样品 A 和 B 中，搅拌该混合物。混合物在 007610000rpm 下离心 5 分钟，上清液经过 Advantec MFS Inc. 生产的孔径为 0.80m 的醋酸纤维素过滤器(DISMIC-25CS080AN) 过滤以收集滤液。上述获得的PVPP 处理后的样品A 和B 和未经 PVPP 处理的样品 A 和 B 通过如下方法比较抗流感病毒作用。 首先，MDCK 细胞 ( 犬肾上皮细胞 ) 在 24-