实验十、十一 动物细胞培养

1、动物细胞体外培养Animal cells cultured in vitro一、基本概念动物体内取出组织，分离出单细胞，在体外模拟机体内的生理条件，建立无菌、适温和一定的营养条件，使之生长和生存，并维持其结构和功能的技术，称动物细胞体外培养。是动物细胞工程的重要技术基础：细胞融合、组织工程、胚胎工程、干细胞工程、动物克隆、动物细胞产品的大规模制备技术等等都离不开。（1） 原代培养 ( Primary Culture ) ：亦称初代培养，指直接从机体取出的细胞或组织进 行培养的过程。（2） 继代培养（ Secondary Culture ）：亦称传代培养，从原代培养的细胞继续转接培养称 继代培养

2、。（3） 细胞系（cell line）：由原代细胞培养后经初步纯化，获得的以一种细胞 为主、能在体外长期生存的不均一的细胞群体，能保 持一致的二倍体核型。（4） 细胞株 ( cell strain ) ：细胞系经过克隆或其他方法而得的单一类型的细胞 群体。二、动物细胞体外培养特性组成人及哺乳类动物体的细胞具有极其复杂的结构和功能，细胞在机体内生长时相互依赖、相互制约，在神经体液的调解下形成了一种天然的内环境，体外生长时脱离了这些内平衡系统，与体内细胞相比是完全不相同的。体外生长时，细胞形态上也发生了变化。1.与体内主要不同相对孤立、相对单一，缺乏体内的系统作用、失去神经体液的调节和细胞相互间的

3、影响；2.主要表现：失去原有组织结构和细胞形态，分化减弱或不显，细胞趋向单一化；3.提示：要正确认识体外培养细胞是一种特定条件下生长的细胞群体。三、体外培养细胞的生长与增殖过程培养的细胞持续生长的时间有限，最终自行停止生长。细胞的种类、性状、原供体的年龄决定其生存时间长短。如：人胚成纤维细胞存活一年、传30-50代相当于150-300个细胞周期；供体是成体或衰老个体时 则存活更短；肝、肾细胞仅能传几代或十几代。获永生性或恶性转化（遗传性改变）生存期则发生变化。（一）细胞系的生长过程1、原代培养期（primary culture phage) 为新鲜组织自体内取出接种培养至第一次传代的阶段,一般

4、持续14周。细胞的代数=转接的次数。每一代 中细胞分裂3-6次。2、传代期 （passage phase）：当细胞持续生长增殖一段时间，达到一定的细胞密度后，就应当将细胞分离成两部分（或更多）至新的培 养器皿中，并补充更新培养液，此即为传代。3、衰退期（senescence phase）：此期细胞虽仍存活，但不增殖或增殖很慢，细胞 形态轮廓增强，进而细胞发生衰退、死亡。期”(crisis)，获细胞通过所谓“得不死性而具有持久或无限增殖的能力。失去接触抑制。每代细胞（群体）要经过四个生长阶段：1、潜伏期（latent phase）：接种悬浮贴附不马上分裂（潜伏）。 潜伏期特点：长短与细胞接种密度

5、、种类、使用培养基性质有关。2、对数生长期（logarthmic growth phase）：分裂旺盛、分裂相增多（其数量标志分裂的旺盛程度）。细胞分裂指数（mitoticindex, MI）:MI=(分裂相个数1000个细胞) 100% 。3、稳定期（stationary phase）：因培养空间和营养物质有限，特别是代谢废物的累积，细胞进入： 新分裂的细胞数与死亡的细胞数相等的动态平衡时期。细胞数不增加，但代谢还是活跃的。4、衰亡期（senescence）：营养物的耗尽和有害 物质的作用，细胞死亡数大于细胞分裂数。最高分裂次数限制：正常细胞都有，肿瘤（癌）细胞没有。每代（群体）细胞生长的四

6、个时期对数生长期细胞浓度的对数潜伏期稳定期衰亡期024487296120h四、动物细胞培养基本技术（一）动物细胞培养的设备条件无菌条件：净化工作室，风淋室，传递窗，高效过滤器， 洁净层流罩，生物安全柜，超净工作台，紫外灯，电热干燥箱，滤器，高压灭菌器，抗生素细胞生长条件：纯水蒸馏器，纯水仪，培养板，培养瓶，CO2培养箱，培养基，血清细胞检测条件：倒置显微镜，酶标仪速离心机，移液器细胞保存条件：液氮罐，微孔板震荡器，高净化工作室- 我国药品生产洁净室（区）空气洁净度标准 -尘粒最大允许数/立方尘粒最大允许数 米洁净度级别0.5um5um浮游菌/立方沉降菌/皿1003,50005110,00035

7、0,0002,0001003100,00020,000500103,500,000300,00060,000NA1510,500,000风淋室:风淋室是生物洁净室的理想配套设备，它不仅可以清除人体和物品表面附着的尘埃，减少带入洁净室的灰尘量，而且兼有气闸室的功能，可防止非洁净空气的侵入。风淋时间可在30-99秒间的调淋室可以配合加热器，冬天可以加热，温度可调，一般控制温度在30-35较为适宜。传递窗:该装置是一种洁净室的辅助设备，主要用于洁净区与洁净区，洁净区与非洁净区之间小件物品的传递，以减少洁净室的开门次数，把对洁净区的污染降低到最低程度。超净工作台超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气

8、遁过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。紫外灯 ：紫外线消毒。 主要用于培养室空气、操作台、塑料培养皿和培养板等表面消毒全自动手提式灭菌器大容量高压灭菌器电热干燥箱：干热消毒（160 干玻璃器皿消毒 ，2小时）。主要用滤器滤器：过滤除菌：大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、酶液等均采用滤过法除菌。自动三重纯水蒸馏器纯水仪培养皿、培养板培养瓶CO2培养箱CO2培养箱设定的条件为37 ，5CO2 。使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题：n 用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。n 保持培养箱内空气干净。定期消毒（90 ，1

9、4 h)。n 箱内灭菌蒸馏水3000毫升蒸馏水槽中以保持箱内湿度，避免培养液蒸发。移液器离心机酶标仪微孔板震荡器液氮罐（二）动物细胞的体外培养一般条件1、恒定的温度: 37 2、pH：最适为7.27.43、气体：需要O2、CO2 （95%空气、5% CO2）4、营养：要求高，需要氨基酸、维生素、辅酶、核酸、嘌 呤、嘧啶、激素和生长因子等。（1）基础培养基（essential medium）：人工合成的只能使体外培养细胞短暂生存（添加天然培养基后细胞才能繁殖）的培养基。也称通用培养基（可用于许多细胞）。低限量基础培养基主要含：无机盐、微量元素、氨基酸、维生素、碳水化合物等。现已有几十种，用途不同

10、。基础培养液：目前已设计出许多种培养基，如TC199、MEM、RPMI-1640、 HamF12和DMEM等。（2）血清：主要为牛（胎牛、新生牛、小牛）、马、鸡、兔、羊、人血清，各有特点。含各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、激素、生长因子及无机物等。在生理平衡下促进或抑制细胞生长。成分复杂，不同种类、不同厂家、不同批号作用均有差异。血清提供细胞生存、生长和增殖必需的激素与生长因子：胰岛素、肾上腺皮质激素、类固醇激素（雌二醇、孕酮、睾酮）、成纤维细胞生长因（FGF）、表皮生长因子（EGF）、血小板生长因子（PDGF）。血清质量好坏是实验成败的关键。常用血清有胎牛血洁、新生牛血清、小牛血情、兔

11、血 清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。血清的灭活（消除补体活性）：56 ，30 分钟血清的消毒：过滤除菌(三) 体外培养的一般过程 体外细胞培养一般过程：组织获得 组织消化 接种培养传代及细胞冻存复苏等动物细胞培养的基本过程过程组织取材机械法消化法组织细胞的分离培养取材取鼠胚组织原代培养与传代培养技术（1） 原代培养分为两种：1） 组织块培养2） 组织消化培养1）组织块培养基本步骤：无菌取出目的组织 用利刀无菌切割成12mm小块以Hanks液漂洗干净,低速离心，弃上清移入培养瓶，加入适当培养基浸润。 培养瓶翻转1800，置1

12、530分，使其贴壁 培养瓶翻回，置于37培养组织块培养法2) 组织消化培养取材分离和组织消化无菌取出目的组织 用利刀无菌切割成细块 加入30-50倍体积0.25%浓度胰蛋白酶溶液胰蛋白酶液消化 37消化30-60min，每5-10min摇动一次Hanks液漂洗两次，低速离心弃上清吸管吹打分散细胞 移入培养瓶薄层培养相关酶类包括：胰蛋白酶、胶原酶、链霉蛋白酶、黏蛋白酶、蜗牛酶等，需根据酶及组织成分的特点选择使用机械分散组织法原代培养与检查接种、培养 常规检查（检查细胞形态及活力、检查营养液pH及污染）（2）传代培养技术传代：当原代培养成功后，细胞分裂增殖成片时，需要对其分离重新培养，这一操作过程

13、成为传代。 第一次传代时间：有80-90%或刚刚全部汇合的细胞 是传代的理想时期。过早产量不足，过晚细胞状态不佳。1）贴壁生长细胞传代基本步骤：吸出培养瓶内旧培养液 加入胰蛋白酶和EDTA混和液 (以能覆盖整个瓶底为准）吸出消化液，加入培养液终止消化 吸管轻轻吹打使细胞分散成悬液，计数 重新接种于新的培养瓶内 培养2）悬浮生长细胞传代离心法传代离心法传代：离心（800-1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。直接传代法直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除l2一23，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。5、细胞的冻存复苏细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。（1） 冻

14、存意义：1） 长期保存细胞；2） 防止细胞老化；3） 减少人力、经费，减少污染。（2）冻存和复苏的原则：慢冻快融当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水， 细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。在细胞冻存时要尽可能均匀地减少细胞内水分，减少细胞 内冰晶的形成是减少细胞损伤的关键。如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反结晶就大，大结晶会造成细胞膜、细胞器 的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。（3）保存细胞三要素：营养、保护剂和低温低温保护剂的应用在细胞冻存时加入保护剂，能大大提高冻存效果。常用的低温保护剂是甘油或DMSO

15、，渗透性保护剂，可 迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延 缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在 胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的 损伤。保护剂的浓度在515%之间，常用10%。细胞冻存方法1）预先配制冻存液： 90%培养基（含10%小牛血清）+10%DMSO。2 ）取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液, 用吸管吹打制成细胞悬液（1106 5 106细胞/ml)。3 ）分装：每瓶1ml，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。4 ）冻存a. 传统方法：冷存管置于410分钟 -2030分钟 - 801618小时(或隔夜)液氮槽长期储存。-20不可超过1

16、小时，以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80冰箱中，惟存活率稍微降低一些。b. 程序降温：将冻存管放于盛有异丙醇的程序降温冻存盒中。然后将冻存盒放入-70 冰箱内。24h后，把-70 保存的冻存管转移至液氮中。记录细胞在液氮罐中冻存的位置。冷冻管程序降温冻存盒（4）细胞复苏方法与快速融化的手段，以保证细胞外结晶在很短的 时间内融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞 内形成胞内再结晶对细胞造成损害 。程序：l）从液氮中取出冷冻管，迅速投入3738水浴中，使其融化（1分钟左右）。2）5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上。3） 低速离心10分钟。4） 去上清，加新鲜培养液培

17、养刚复苏的细胞。六、培养细胞的检测和特性鉴定（一）培养细胞的常规检查细胞接种或传代以后，在生存期间，实验者每天或至多间隔1-2天，要对细胞做常规性检查。观察的结果是：污染与否，细胞生长和pH等情况， 随时掌握细胞动态变化，以便做换液或传代处理，如发现异常情况应及时采取措施。1、细胞形态细胞的细微结构。细胞机能不良时，轮廓增强，胞质中常出现空泡、脂滴和其他颗粒状物，细胞之间 空隙加大，细胞形态可变得不规则甚至失去原有特点，如上皮细胞变成类纤维细胞等。2、细胞生长情况很多情况下，开始从组织最先“长”出的为游走细胞，它们单独活动，形态不规则。在游走细胞之后，接着出现的 是成纤维细胞或上皮细胞。说细胞

18、“生长”不如说移动更 为恰当，因这时尚很少见细胞分裂，仅有细胞运动而已。 只有当细胞开始分裂后，细胞数量逐渐增多，形成较大的 生长晕或连接成片时，才真正进入了生长状态。一般发现细胞覆盖瓶底的80%就应及时传代，否则会影响细 胞生长甚至导致细胞脱落。当发现悬浮细胞生长显著、密度增大、分布稠密、培养基变黄也应及时传代。3、培养液在正常情况下，培养液呈桃红色。用一般温箱培养时， 随细胞生长时间的延长，CO2积累增多，在超越缓冲范围后，营养液酸化变黄，如不及时调节PH，对细胞会发生不利影响，严重时细胞脱落死亡。培养液中加Hepes或用CO2温箱培养可使PH维持稳定。用磷酸盐缓冲系统时， 可因瓶口漏气，

19、CO2溢出，也可能由于培养瓶和瓶塞洗刷残留碱性物，使之变碱发红。更换营养液时间，可依 营养物的消耗而定，细胞生长旺盛时-天换一次，生长缓慢时，-天亦可。4、微生物污染细胞接种、传代、换液加药后经常观察，密切注意是否有微生物污染发生。一旦发现培养基浑浊、 液体内漂浮着菌丝或细菌，或生长明显变缓，胞质 内颗粒增多，有中毒表现等应怀疑是否有微生物污染，进一步观察检查并及时处理。按现代的观念，凡是混入培养环境中对细胞生存有害的成分和造成细胞不纯的异物都应该视为污染。根据这一概 念，组织培养污染物应包括生物（真菌、细菌、病毒和支原体）化学物质（影响细胞生存、非细胞所需的化学成分）细胞（非同种的其他细胞）

20、。其中以微生物最为多见。另外，随着使用细胞种类增多，不同细胞交叉污染，尤其是Hela细胞的污染也时有发生， 从而造成细胞不纯。污染的途径1） 空气：空气是微生物及尘埃颗粒传播的主要途径。因此， 培养设施不能设在通风场所。无菌操作应在净化台内进行， 工作时要带口罩，以免因讲话、咳嗽等使外界污染进入操 作面，造成污染。2 ）器材：各种培养器皿、器械消毒不彻底和洗刷不干净导致污染，另外需要对培养箱进行定期消毒，防止形成污染 。3 ）操作：实验操作无菌观念不强，培养两种细胞以上时， 交叉使用吸管或培养液、瓶等有可能导致细胞交叉污染。4 ）血清：有些血清在生产时就已经被支原体或病毒等污染， 变成了污染。

21、5 ）组织样本污染对培养细胞的影响培养细胞一旦发生污染多数将无法挽回。细胞污染早期或污染程度较轻时，如果能及时去除 污染物，部分细胞有可能恢复。污染物持续存在培养环境中，轻者细胞生长缓慢，分裂相减少，细胞变得粗糙，轮廓增强细胞浆出现 颗粒；污染较严重，细胞增值停止，分裂相消失， 细胞质中出现大量堆积物，细胞变圆、脱壁。1）细菌的污染及检测（肉眼直接观察法、培养检查法、显微镜观察法）多数培养细胞在遭到细菌的污染后，培养液短期内颜色变黄，产生大量酸性物质，出现明显混浊现象，可见培 养液中有大量圆球状颗粒漂浮。培养检测，可以取少量培养液涂布在无菌琼脂培养基上， 过夜查看。防止方法：通常在严格的实验操

22、作之外，培养基中加入 青霉素、链霉素能够有效的防止细菌污染。污染的预防培养前培养操作时，必要的细胞备份。对新引进或构建的细胞株应加强观察， 并做必要的支原体和病毒的检查。定期消毒培养箱。培养物的污染及防止如果有价值的细胞被污染，并且污染程度较轻，可以通过及时排除污染物挽救细胞，常用的排除微生物污染的方法有以下几种：抗生素排除法：采用510倍于常用量的冲击法，加入高浓度抗生素后作用2448小时，再换入常规的培养液，有时可以奏效。加温除菌：根据支原体耐热性能差的特点。将受支原体污染的细胞置于41 度中作用510小时（最长可以达18小时）杀灭支原体。但是41度对细动物体内接种：细胞可以接种到同种动物

23、皮下或腹腔，借动物体内免疫系统消灭掉微生物。与巨噬细胞共培养：巨噬细胞在体外条件下仍然可以吞噬微生物并将其消化。利用96孔板将极少培养细胞与巨噬细胞共培养，本方法与抗生素联 合应用效果更佳。（二）培养细胞的生物学鉴定1、细胞形态观察内容：细胞形态、核质比例、染色质、核仁大小及 多少、微丝微管排列状态等。方法：倒置相差显微镜、电镜。2、细胞生长情况细胞生长曲线测定1）细胞计数法血细胞计数器：人工计数细胞Counter计数仪步骤取生长良好接近汇合的细胞，用胰酶消化，用新培养基制成细胞悬液后计数。如是非贴壁细胞，则离心弃旧培养 基后，换上一定量的新鲜培养基然后制成细胞悬液计数。 根据细胞计数结果按每个小方瓶5104mL作传代培养接种细胞，共接种21瓶细胞。24 h后开始计数细胞，以后每隔24 h计数一次，每次取3 瓶细胞，分别进行计数。计算平均值。连续计数7 d。根据细胞计数结果，以单位细胞数(细胞数mL)为纵坐标，以时间为横坐标绘制生长曲线。2）四唑盐（MTT）比色法四唑盐（MTT）商品名为噻唑蓝，四唑盐比色法的原理：活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水的蓝紫色产物（formazan)，并沉淀在细胞