高效液相色谱-2.ppt

1、高效液相色谱 (2)（High Performance Liquid Chromatography, HPLC）仪器与分离模式,许 旭分析室色谱组 Tel: 3426 Email: ,3.4检测系统,HPLC检测器分类、性能指标 几种常用的检测器,通用型检测器： 示差折光 介电常数 电导 蒸发光散射检测器 专用型检测器： 紫外 荧光 电化学 放射性检测器,A HPLC检测器分类、性能指标,性能指标：,噪声(Noise, No)和漂移(Draft)： 高频噪音（毛刺）、短周期噪音（通常与泵、流动相有关）上漂、下漂 灵敏度：S=响应值/样品量或浓度 检测限：两倍噪声时的样品量 检测器线性范围：应尽

2、可能大 检测器死体积：要求小于组分峰体积的1/10。目前都小于8微升 检测器响应时间：要求/3，目前使用的仪器一般都在0.5-1秒,B 几种常用的检测器,a 紫外吸收检测器与二极管阵列检测器（最常用） b 示差折光检测器 c 荧光检测器 d 电化学与电导检测器 e 其它检测器 蒸发光散射检测器,a 紫外吸收检测器与二极管阵列检测器,使用最多 工作原理：朗伯-比尔定律 A = lg(I0/I) = -lgT = bc 组成：检测池、光学系统和电路系统。,光电接收元件：一般用光电倍增管、光电池或光电二极管阵列 光源：氘灯（紫外200-360nm）和钨灯（360-800nm）,结构：检测池内径约1m

3、m, 光程长10mm，结构有H形、Z形和U形,单波长 光路：单流路双光路 检测光路与参比光路,双波长、多波长 停流扫描与快速扫描,二极管阵列检测,b 示差折光检测器,通用性检测器。 原理：溶液的折光指数 n = n1C1+n2C2 其中n1和n2分别为溶质和溶剂的折光指数，C1和C2分别代表溶质和溶剂的摩尔百分浓度。 因为 C1+C2 = 1 所以 n= n - n2 = (n1 - n2) C1 因此，若n1 n2，则溶液与溶剂折光指数的差值n与溶质浓度成线性关系。而n1与n2的相对大小则决定了峰的正反。,常用的示差折光检测器有两种： 偏转式 反射式 其它类型还有： 干涉式 克里斯琴效应式,

4、c 荧光检测器,化合物产生的荧光强度，在浓度很低时，与入射光强度、荧光效率和化合物浓度成正比。 即： F = 2.3I0bc 荧光检测器的检测限比紫外吸收检测器低一个数量级以上，选择性也好,仪器： 激发光源：汞灯 (254nm) 氙灯 (250-600nm) 激光 (固定波长) 单色器： 滤光片（多波长型） 光栅（光栅型）,滤光片型 固定波长,光栅型 可变波长,d 电化学与电导检测器,电化学检测器 安培检测器 极谱检测器 库仑检测器,安培检测器,极谱检测器,库仑检测器,选择性检测器，检测具有电活性的化合物，灵敏度高，线性范围宽、设备简单，能和反相系统匹配；但对温度和流动相流速敏感，最大问题是电

5、极表面可能会发生吸附和催化氧化还原等现象，电极表面需要经常再生，而目前还没有一种通用和可靠的方法使表面获得完全的再生。因此存在重现性的问题。 通常在生化、医药和环境分析中用于测定大量非电活性物质中痕量的电活性化合物。 几种检测原理类似，其中安培检测器的应用较多，安培检测器在流速恒定时，产生电流与组分浓度成正比。,电导检测器,主要用于离子色谱 在溶质浓度很低，离子的当量电导接近其极限当量电导时，溶液的电导与溶质的浓度成正比。,e 其它检测器,蒸发光散射检测器 图 柱后反应检测器 介电常数检测器 放射性同位素检测器 离子选择性电极检测器 旋光检测器 圆二色谱检测器 等等,3.5 记录与色谱工作站,

6、A 记录仪、色谱数据处理机与色谱工作站 早期的HPLC只配有记录仪记录谱图，然后人工计算峰面积或峰高，十分麻烦。后来专用的积分仪（色谱数据处理机），可以自动打印峰高、峰面积和保留时间，还可以做一些简单的定量计算，但不能存储数据。 色谱工作站则是包括色谱控制、数据采集处理和存储的计算机系统。,B 色谱工作站的一般功能,色谱参数的选择和设定；自动化操作仪器；色谱数据的采集、“实时”处理和存储；对采集和储存的数据进行后处理；给出一套完整的色谱分析数据并打印出来 值得注意的是，色谱数据处理参数的选择和设定非常重要，只有在正确选择参数的前提下才能得到正确的结果。一般情况下，工作站得到的结果与人工计算的结

7、果没有明显差别。,3.6 制备型液相色谱,分析型柱容量在几十到几百微克。 用于提取标准物质、纯化天然产物和合成产物时，需要大的柱容量。近年来发展的制备型HPLC，一次进样可以制备克级以上的样品。工业级制备HPLC制备量更大，可以提供各种色谱纯的样品。,A 色谱柱、输液泵,色谱柱如下所述 ， 分析柱： 内径2 - 4.6mm 长度10-25cm 粒径3-10um 柱容量ug级 半制备柱： 5 10 10-25cm 5-10um 5-50mg级 制备柱： 10 (通常20mm) 25cm 20-30um mg-g级， 采用粗颗粒填料，制备柱柱效明显低于分析柱，但样品处理量大、成本低，并可降低对大流

8、量泵的要求。 输液泵：分析型一般最大10ml/min，制备型一般需要100ml/min, 最大1000ml/min 由于颗粒大，柱压降小，对工作压力要求不高，一般达10MPa。有些厂家提供半制备泵，流量22.5ml/min。可以满足不同的需要。,B 检测器、进样器与组分收集器,检测器： 进样量大，对灵敏度要求不高，常用示差折光检测器，但要求线性范围宽，流量大需要大体积检测池，或分流。一般不用电化学检测器（会破坏样品）。 进样器：可以用六通阀或单独的进样泵进样，尽量采用低浓度、大体积进样 组分收集器：手动收集、自动收集（定时间或定体积）、或由工作站控制全自动收集。,C 再循环技术与模拟流动床技术

9、,再循环技术：利用柱切换技术再循环提高纯度 模拟流动床技术：工业化制备技术，在精确过程模拟的基础上，采用计算机控制电磁阀切换流路，最大限度利用固定相，降低成本，提高产量。,3.7 阀切换技术,样品的净化与富集,多维色谱,再循环,反向冲洗,4. 基本分离模式,液液色谱 液固色谱 离子交换色谱 分子排阻色谱,1.1 液液分配色谱,组分在固定相与流动相之间存在分配平衡，利用平衡常数的差异实现分离。 正相色谱 流动相极性小于固定相极性的方法 反相色谱 流动相极性大于固定相极性的方法,正相色谱流动相极性小于固定相极性的方法,例如 以含水硅胶为固定相，烷烃为流动相。 前面介绍过。1941年 英国生物化学家

10、Martin（诺贝尔奖）与英国化学家Synge创立分配色谱。以水份饱和的硅胶为固定相，以含有乙醇的氯仿为流动相分离乙酰氨基酸,反相色谱流动相极性大于固定相极性的方法,例如：以正辛烷为固定相，水为流动相。 1950年 Howard 和 Martin分离石蜡油,液液分配色谱由于固定液易流失，逐渐被键合相色谱法和不要载体的逆流色谱取代，目前使用很少。,4.2 液固吸附色谱,类似普通柱层析的方法 组分在固定相与流动相之间存在吸附平衡，利用平衡常数的差异实现分离。,A 常用吸附剂,主要为硅胶， 氧化铝因为有催化性能，目前不太使用。 硅胶：表面硅醇基是吸附活性点。 吸附能力和含水量有关。 活化（加热脱水，

11、建立吸附活性）与 去活（加水平衡，钝化强活性点，减 少拖尾） 活化方法：加热脱水，但不能破坏硅醇基 见参考书,B 流动相,常用溶剂为 正己烷 二氯甲烷 乙腈 甲醇,吸附顶替模型样品S与流动相M分子在吸附剂A表面上的竞争吸附,Sm + nMa Sa + nMm 式中下标m 和a 分别代表流动相和固定相吸附剂 n=As/Am As 为组分分子吸附在表面上所需要的吸附剂面积；Am为流动相分子所需面积,净吸附能 Ea S - As,式中，S为组分分子的吸附能；为溶剂分子在单位面积标准吸附剂上的吸附能。规定，戊烷在氧化铝吸附剂上的吸附能 0，则与组分无关，称为称为溶剂强度参数。 溶剂在硅胶上与在氧化铝吸

12、附剂上的洗脱能力有近似关系：硅胶 = 0.77氧化铝 从看k， 越大，k越小。对于给定组分和吸附剂： lgk 。 根据大小调节溶质保留。但使用不同流动相时，各组分的k不一定一样，所以分离结果不同。可以在相近的值选择流动相来改善分离。,硅胶上一些溶剂的洗脱能力序列见（溶剂强度表）,C 样品分子结构对保留的影响,样品分子结构决定着组分的流出次序。组分的保留受分子中官能团的类型和数目的影响。官能团的吸附强度大致如下： 不吸附： 烷烃 弱吸附： 烯烃，硫醇（醚），单环、双环或卤代芳烃 中等吸附：多核芳烃、醚、腈、硝基化合物、大多数羰基化合物 强吸附： 酚、醇、胺、酰胺、亚砜、酸和多功能团化合物,一般地

13、，含弱吸附与部分中等吸附官能团组分的分离，可以用烃类作洗脱液 含羰基化合物，用二氯甲烷作洗脱液 其余组分的分离，则在洗脱液中添加乙腈或甲醇,D 液固色谱的优势,分离位置异构体,4.3 离子交换色谱(ion exchange chromatography, IEC)与离子色谱 (ion chromatography, IC),4.3.1 离子交换色谱,主要用于分离离子。 包括可转化为离子的中性有机物 如：在不同pH的氨基酸，与硼酸络合的糖。,A 原理,样品离子A在离子交换固定相上与洗脱液同种离子E的离子交换 xAmy+ + yEsx+ xAsy+ + yEmx+ lgk = 常数 - (y/x)

14、lgEx+m,B 离子交换剂固定相,根据键合的官能团性质分为： 阳离子交换剂强酸性（磺酸型）、弱酸性（羧酸型） 阴离子交换剂强碱性（季铵型）、弱碱性（胺基型） 强酸性(pH2)和强碱性(pH8)和弱碱性(pH6)宽得多。所以前者使用较多。 交换剂基质有： 苯乙烯二乙烯基苯共聚物，薄壳型和表面多孔型硅胶，全多孔硅胶,C 流动相,主要是缓冲液。有时加入少量甲醇或乙腈。洗脱能力主要取决于缓冲液的离子强度和pH。 提高离子强度可以加快洗脱，但不影响柱的选择性。缓冲液离子类型对保留有影响。,强酸性阳离子交换剂上一些金属离子洗脱能力的大小顺序为： Fe3+ Ba2+ Pb2+ Cd2+ Co2+ Zn2+

15、 Mg2+ Tl+ Ag+ K+ NH4+ Na+ H+ Li+ 强碱性阴离子交换剂上一些阴离子的洗脱顺序为： 柠檬酸根 草酸根 I- HSO4- NO3- Br- Cl- HCOO- CH3COO- OH- F-,使用不同的离子交换剂，顺序稍有不同。对弱酸、弱碱性离子交换剂，顺序基本不变。 但仅是一般规律。在高温、高浓度、存在络合剂、非水介质中，顺序会发生改变。 pH变化，影响弱酸、弱碱性离子交换剂的容量；影响离子形式的组分浓度,常用缓冲液,阳离子交换：醋酸、甲酸的钾、钠盐 阴离子交换：氨、吡啶 甲醇、乙腈主要用于增加溶解度（对分子量较大、不易洗脱的有机酸碱，可减少k，改善分离）,4.3.2

16、 离子色谱,在离子交换色谱基础上，通过降低本底电导，采用电导检测器进行检测的方法。是阴离子分析的一大突破。,离子色谱分类,根据仪器结构，分为双柱法和单柱法两种 根据分离原理，可分为高效离子色谱法、高效离子排斥色谱、和可动相离子色谱法。,A. 抑制型离子色谱法双柱法,在分离柱和检测器之间接上一只抑制柱，以抑制或消除洗脱液的本底电导，同时将待测的样品离子转变成相应的酸或碱。 由于耐腐蚀（洗脱与再生液为酸或碱）等问题，系统压力通常不能超过10MPa，实际上是低压高效液相色谱。 a 高效离子色谱法 b 高效离子排斥色谱法 c 可动相离子色谱,a 高效离子色谱法,使用离子交换树脂为苯乙烯二乙烯基苯共聚物

17、，部分磺化后用于阳离子交换，在磺化表面上依靠静电力聚集一薄层氨化乳胶用于阴离子交换。 分离柱交换容量低，抑制柱交换容量高,用于阴离子交换的洗脱液：NaHCO3, Na2CO3, NaOH, Na2B4O7 用于阳离子交换的洗脱液：稀盐酸、间苯二胺二盐酸盐 缺点：抑制柱引起区带展宽，需要再生； 一些重金属离子在抑制柱会水解 改进：纤维抑制柱、薄膜型抑制器,b 高效离子排斥色谱法,Donnan（道南）膜平衡原理。离子交换剂骨架和官能团可看作是不可扩散的聚合物，表面液膜可看作“半透膜”。 主要用于有机酸的分离。 分离柱使用高交换容量全多孔型阴离子交换树脂，抑制柱填以银型阳离子交换剂，后接氢型阳离子交换后置柱。 用于阴离子交换的洗脱液：0.001 M HCl 弱酸的保留与其离解常数、浓度、洗脱液pH等有关，也与树脂性质有关。,c 可动相离子色谱,使用疏水的中性苯乙烯二乙烯基苯共聚物为固定相，以含有离子对试剂的乙腈（或甲醇）水溶液为流动相。 分离机理与离子对色谱相似。 抑制柱与高效离子色法相同（高交换容量） 分离亲水性阴离子，采用洗脱液为疏水性的碱 分离疏水性阳离子，采用洗脱液为亲水性的酸 用于分析多种疏水离子，如脂肪胺类，脂肪族或芳香族硫酸盐或磺酸盐,B. 非抑制型离子色谱法单柱法,采用低电导的洗脱液，不需要使用抑制柱。但检测限要差些。 采用大孔苯乙烯二乙烯基苯共聚物交换树脂