血脂及血浆脂蛋白检验.ppt

1、第十一章 血脂及血浆脂蛋白检验,第一节 概 述 第二节 血脂、血浆 脂蛋白测定,学习目标,掌握胆固醇、三酰甘油、高密度脂蛋白-胆固醇、低密度脂蛋白-胆固醇的常用测定方法和临床意义。 熟悉脂质、脂蛋白的分类与组成，高脂蛋白血症的定义、分型、生化诊断要点。 了解脂蛋白代谢紊乱与动脉粥样硬化的关系。,血脂是血液中脂质（脂类）物质的总称，包括脂肪（fat）和类脂（lipiod）及其衍生物。 脂肪是一分子甘油和三分子的脂肪酸组成的酯，即甘油三酯（TG）。 类脂包括磷脂（PL）、糖脂（GL）、胆固醇（Ch）及胆固醇酯（CE）等。 脂类不溶于水而溶于有机溶剂。,脂肪的主要生理 功能 1. 储能供能；正常17

2、%25%由脂肪供给。 2. 缓冲机械撞击，保护固定内脏。 3. 保温作用。 4. 促进脂溶性Vit的吸收。 类脂的主要生理功能 1. 构成生物膜的成分。 2. 形成脂蛋白，参与脂类运输。 3. 能激活凝血酶原，参与血液凝固。 4. 转变成多种生理活性物质。,第一节 概 述,一、血脂和血浆脂蛋白 脂类不溶于水，血液中脂类常与蛋白质结合而运输，血浆脂蛋白是脂类在血液中的运输形式。 脂蛋白=Apo + TG + Ch + PL （一）血浆脂蛋白的分类 1. 密度分类法 分成：CM、VLDL、LDL、 HDL。 2. 电泳分类法 分成：CM、-LP、 pre-LP、-LP。,（二）血浆脂蛋白的组成特征

3、 各类血浆脂蛋白都含有蛋白质、甘油三酯、磷脂、胆固醇，但不同的脂蛋白其蛋白质的种类和脂类的组成比例不同。 血浆脂蛋白的组成,分 类 CM VLDL LDL HDL 密度 0.95 0.951.006 1.0061.063 1.0631.210 颗粒直径（nm）80500 2580 2025 7.510 组成（%） 蛋白质 0.52 510 2025 50 三脂酰甘油 8095 5070 10 5 胆固醇 45 1519 4850 2022 磷脂 57 15 20 25,（三）载脂蛋白 载脂蛋白（Apo）主要由肝脏和小肠黏膜细胞合成。目前已发现的有20多种，结构与功能研究比较清楚的有A、B、C、

4、D、E五类。每一类又分为不同亚类。 不同脂蛋白含不同的Apo。 HDL主要含Apo A、Apo A； LDL只含Apo B100； VLDL含Apo B100， Apo C、C、C、E CM含Apo B48， Apo C、C、C,载脂蛋白的主要功能： 1. 构成并稳定血浆脂蛋白的结构，脂类的运输载体。 2. 调节脂蛋白代谢关键酶的活性，如Apo A激活LCAT，Apo C激活LPL。 3. 作为脂蛋白受体的配体，参与对脂蛋白受体的识别、结合和代谢过程。,（四）脂蛋白受体 存在于细胞膜表面能与相应脂蛋白特异结合的一类糖蛋白。主要的有： 1. LDL受体（Apo B、E受体） 分布于肝细胞、动脉平

5、滑肌细胞膜表面，含Apo B100、E的脂蛋白均能与LDL受体结合，通过内吞作用使细胞获得脂质。 2. VLDL受体（Apo E受体） 分布于心肌、骨骼肌和脂肪组织细胞膜，能识别、结合含 Apo E的脂蛋白，清除血液中CM、VLDL残粒。,3. 清道夫受体（SR） 主要存在巨噬细胞及血管内皮细胞表面，介导对修饰型LDL（如氧化型LDL，oxLDL；乙酰化LDL，acLDL）从血液循环中清除，而oxLDL可导致脂质沉积，促使巨噬细胞转变成泡沫细胞，具有强烈的致动脉粥样硬化作用。另一方面，也推测巨噬细胞通过清道夫受体清除细胞外液中的修饰型LDL，尤其是oxLDL，是机体的一种防御功能。,二、脂蛋白

6、代谢 （一）乳糜微粒 小肠黏膜细胞合成，并分泌入淋巴管。CM含有Apo A，A和B48，CM从胸导管移行入血液过程中，其载脂蛋白的组份迅速改变。进入血中的CM获得Apo C， Apo C激活末梢血管内皮细胞表面的LPL， LPL作用于CM中TG，分解成脂肪酸和单脂酰甘油，再进入肌肉、脂肪组织及心肌组织贮存或利用。CM转变为CM残粒。,（二）极低密度脂蛋白 VLDL主要由肝脏合成，肝合成的VLDL分泌后进入血液，再由VLDL内Apo C激活LPL，并水解其内的TG。由HDL的LCAT作用生成的胆固醇酯转给VLDL进行交换，而VLDL中余下的PL、Apo E、C转移给HDL，VLDL转变成VLDL

7、残粒即IDL，而后大部分通过VLDL受体摄入肝，小部分则转变成LDL继续进行代谢。,（三）低密度脂蛋白 主要由VLDL代谢转变而来，LDL的降解是经LDL受体途径进行，LDL中的ApoB100被受体识别，将LDL结合到受体上陷窝内，然后与膜分离形成内吞泡，LDL与受体分离并与溶酶体融合。血浆中6570的LDL是依赖LDL受体清除，一旦LDL受体缺陷，VLDL残粒由正常时大部分经肝LDL受体识别，而改为大部分转变成LDL，使血浆中LDL浓度增加。,（四）高密度脂蛋白 HDL主要由肝和小肠合成。肝合成的新生HDL以磷脂和Apo A为主。HDL可将蓄积于末梢组织的游离胆固醇与血液循环中脂蛋白或与某些

8、大分子结合而运送到肝脏。实际上是胆固醇逆转运（RCT），RCT促进组织细胞内胆固醇的清除，维持细胞内胆固醇量的相对衡定，从而限制动脉粥样硬化的发生发展，起到抗动脉粥样硬化作用。,三、脂蛋白代谢紊乱 （一）高脂蛋白血症 血脂含量超过正常称为高脂血症，由于血脂均以血浆脂蛋白的形式存在，故也称为高脂蛋白血症。按发病原因分为两大类。 1970 年WHO建议将高脂蛋白血症，根据血清TC、TG、外观和脂蛋白电泳图谱，将其分为五型六类。,1.型高脂蛋白血症 又称高乳糜微粒血症。是一种常染色体隐性遗传病。由于LPL缺损或LPL活化因子（Apo C）缺损所致。婴儿期即可发生，但罕见。其生化检查特征： 4冷置试验

9、，血清上层为奶油状，下层清亮。 血清TG，达11mmol/L以上，血清TC正常或轻度。 血清LPL活性。 血清脂蛋白电泳，CM。,2. a高脂蛋白血症 又称高-脂蛋白血症或高胆固醇血症。属常染色体显性遗传，有明显的家族史。病因LDL受体缺损，其生化检查特征： 4冷置试验，血清外观清亮透明。 血清TC，15.6mmol/L，尤其是LDL-C，TG正常。 血清脂蛋白电泳，-LP。 临床表现，中青年常伴有冠状动脉硬化，结局为心肌梗死。,3. b型高脂蛋白血症 在a型基础上伴有VLDL（高LDL+VLDL血症），病因不明。其生化检查特征： 4冷置试验，血清外观清亮或微混。 血清TC，TG。 血清脂蛋白

10、电泳，-LP，pre-LP。,4. 型高脂蛋白血症 又称宽-脂蛋白血症。属常染色体显性遗传病，病因，ApoE异常，与相应受体结合率。其生化检查特征： 4冷置试验，血清外观混浊，后形成蜡样黄色薄膜。 血清TC，TG。 血清脂蛋白电泳，-LP，pre-LP，IDL。融合形成宽区带。 临床表现，早期易发生动脉粥样硬化和冠心病。,5. 型高脂蛋白血症 又称高前-脂蛋白血症或家族性高甘油三脂血症。属常染色体显性遗传病，较常见，我国原发性高脂蛋白血症中一半属于此型。病因，ApoA异常。其生化检查特征： 4冷置试验，血清外观混浊。 血清TG，TC正常或稍。 血清脂蛋白电泳，pre-LP。 临床表现，多见于中

11、年人易发生冠心病。,6. 型高脂蛋白血症 属常染色体显性遗传病，病因不详，可能由几种遗传缺陷所致，较罕见。生化检查特征： 4冷置试验，血清上层为奶油状，下层混浊。 血清TG，TC。 血清脂蛋白电泳，CM，pre-LP。,（二）低脂蛋白血症 临床上将血清TC3.3mmol/L，或TG0.45mmol/L，或LDL2.1mmol/L者，称为低脂蛋白血症。主要有四种类型 1.低LDL血症 一种常染色体显性遗传病，病因ApoB100低下，血浆LDL减少，TC。 2.无LDL血症 （棘形红细胞症）罕见的常染色体隐性遗传病，病因ApoB100、B48缺损，血浆中无LDL，TC，以棘形红细胞增多（红细胞膜上

12、有尖的突出），视网膜无色素，运动失调和智能障碍为特征。,3.低HDL血症 病因不详，但肥胖，少运动的生活方式，吸烟，糖尿病，尿毒症和肾病综合征及一些药物等因素会引起HDL水平的下降。血清TG，动脉粥样硬化、冠心病的发病率高。 4.无HDL血症（Tangier病）罕见的常染色体隐性遗传病，ApoA、A缺损，血浆TC，HDL-C。在成人期出现肝脾肿大或复发性多神经病的临床症状。,（三）高脂血症与动脉粥样硬化 动脉粥样硬化（AS）是指动脉内膜的脂质、血液成分的沉积形成粥样硬化斑块，使血管壁纤维化增厚和狭窄的一种病理过程。 1. 致动脉粥样硬化脂蛋白 LDL经化学修饰成oxLDL，损伤血管壁内皮细胞，

13、使管壁通透性增加，导致脂质沉积，促使巨噬细胞形成泡沫细胞。LP（a）是促进AS的独立危险因子。主要是干扰纤溶系统，促进血栓形成。,2. 代谢综合征 代谢综合征（MS）是多种代谢成分异常聚集的病理状态，是一组复杂的代谢紊乱症候群， 主要特点是高血脂、高血压、高血糖和肥胖。 3. 抗动脉粥样硬化脂蛋白 HDL水平与动脉粥样硬化呈负相关，HDL能逆转运胆固醇；保护内皮细胞免受LDL的损伤；防止血小板聚集； HDL能抑制LDL氧化，抑制泡沫细胞脂肪斑块形成 。HDL-C小于1.03mmol/L被认为是早发冠心病的独立危险因素。,四、临床血脂分析项目 血脂和血浆脂蛋白测定的临床意义包括： 1. 早期发现

14、和诊断高脂血症； 2. 协助诊断动脉粥样硬化； 3. 评估冠心病的危险程度； 4. 监测与评价高脂血症、AS或冠心病的疗效。,（一）血脂测定项目的合理选择 血脂测定方法很多，目前临床实验室基本检验项目有：血清外观分析，TC，TG，HDL-C，LDL-C测定。有条件的实验室可进一步检测HDL亚组分，IDL，Apo（如ApoA、ApoB100），Lp(a)及脂蛋白电泳，LPL，LCAT测定，为保证分析结果的可靠性，标本的采集应在餐后12h以上。,（二）减少分析前变异对血脂测定结果的影响 1. 影响血脂测定的因素 （1）生物学因素 性别、年龄、种族等； （2）生活方式 饮食、吸烟、饮酒、饮咖啡和锻炼

15、； （3）临床因素 疾病（内分泌疾病、代谢性疾病、肾脏疾病、肝胆疾病等），药物（抗高血压药、免疫抑制剂、雌激素等） （4）样本收集与处理 禁食状态、采血方式、样本储存等。,2. 减少分析前变异的措施 （1）采血前数天或数周停止使用影响血脂的药物（血脂调节药、降压药、激素、避孕药等）。 （2）至少2周内保持一般饮食习惯和维持体重稳定。 （3）3天内避免高脂饮食，24 h内不饮酒。 （4）抽血前受试者坐位休息5 min以上，静脉穿刺中止血带使用不超过1 min. （5）样本应及时测定，24h不能完成测定，应置4冰箱中保存。,第二节血脂、脂蛋白及 载脂蛋白测定,一、血清外观分析（血清冷置试验）,二、

16、血清总胆固醇测定 胆固醇是人体重要的脂类成分，具有重要的生理功能，如合成类固醇激素，维生素D3和胆汁酸，并构成细胞膜成分，TC包括FC（1/3）和CE（2/3），胆固醇与动脉粥样硬化有密切关系，故胆固醇测定是最常用的实验室检测项目之一。 TC测定方法很多，约200多种，分为化学法、酶法、气相色谱法、高效液相色谱法、核素稀释质谱法（决定性方法）。,（一）化学测定法 主要有两类 1.Liberman-Burchard反应 简称L-B反应，胆固醇经冰醋酸，浓硫酸脱水生成3,5-胆烷二烯阳离子，然后被醋酐，浓硫酸氧化生成绿色的胆烷六烯磺酸。呈色稳定性差。 2.Zak反应 胆固醇经冰醋酸，浓硫酸脱水生成

17、3,5-胆烷二烯阳离子，然后在Fe3+存在下氧化生成紫红色胆烷四烯阳离子，灵敏度较L-B反应高7倍，且呈色稳定性好，但试剂腐蚀性极大，不能用于自动化分析。,（二）酶法 胆固醇酯 胆固醇 脂肪酸 胆固醇 O2 胆烷-4-烯-3酮 H2O2 H2O2 4AAP 酚 红色亚胺醌 H2O,CEH,ChOD,POD,试剂中除上述三种酶外，还有胆酸钠和表面活性剂及稳定剂，胆酸钠用于激活CEH，表面活性剂促进胆固醇从脂蛋白中释放。 酶法操作简便，快速，试剂无腐蚀性，适合于自动化分析。,【参考范围】2.855.17mmol/L 【临床意义】血清TC含量受年龄、性别、饮食和运动等因素的影响。20岁以上随年龄而，

18、70岁以后则有下降趋势。2040岁阶段男性高于女性，但女性绝经后则高于男性。城市人群高于农村人群，与饮食和运动有关。脑力劳动者高于体力劳动者。 病理性高胆固醇血症 原发性高胆固醇血症，糖尿病、胆道阻塞、肾病综合症、甲状腺功能减退。 病理性低胆固醇血症 严重贫血、甲亢、营养不良。,【方法评价】 1. 线性范围 可达19.38 mmol/L（750mg/dl）。 2. 变异系数 批内CV1.5%，批间CV 2.5%。 3. 特异性 特异性好，灵敏度高，既可手工操作，也可自动化分析，既可用终点法检测，也可用速率法检测。 4. 还原性物质（胆红素、维生素C）增多时，可使结果出现负偏差。,三、血清甘油三

19、脂测定 TG是由一分子甘油与三分子脂肪酸组成的化合物，主要存在于VLDL和CM中，临床化学中往往以测定甘油代表TG的含量。TG的测定方法很多，如气相色谱法、高效液相色谱法、红外分光光度法。但上述方法需特殊的仪器设备和技术，故一般只用于研究工作中。临床实验室主要用化学法和酶法。,（一）化学法 基本步骤可归纳为四步 1.抽提：甘油三脂的抽提是采用合适的溶剂，使脂蛋白变性将TG提取，同时去除干扰物质（磷脂、游离甘油、葡萄糖等）常用方法有： （1）异丙醇抽提，沸石合剂（沸石、高岭土）吸附。 （2）异丙醇抽提，氧化铝吸附磷脂。 （3）正壬烷、异丙醇、稀硫酸分溶抽提，免去吸附磷脂的操作，后用价廉的正庚烷代

20、替正壬烷。应用较广。,2.皂化：甘油三脂的水解 一般都采用KOH乙醇或KOH异丙醇溶液，60，515min可使TG完全水解。 3.氧化：甘油的氧化 最常用的氧化剂是HIO4，甘油在酸性条件下被氧化成甲醛、甲酸。反应受-磷酸甘油、葡萄糖、丝氨酸的干扰，故抽提时应尽量除去此类物质的干扰。,4.显色：显色测定甲醛。常用方法有： （1）甲醛与变色酸（4,5-二羟-2,7-萘二磺酸）在硫酸溶液中加热生成紫红色化合物。（570nm） （2）甲醛与乙酰丙酮在氨的存在下缩合成黄色的3,5-二乙酰-1,4-二氢-2,6-二甲基吡啶。（420nm）,【方法评价】 1. 操纵步骤繁多、技术要求高而不适于常规工作应用

21、。 2. 变色酸显色灵敏度高、显色稳定，至今仍是美国疾病预防控制中心（CDC）的内部参考方法。,（二）酶法 常用的有： 1.磷酸甘油氧化酶法（GK-GPOD-POD法） TG H2O 甘油 FA 甘油 ATP 3-磷酸甘油 ADP 3-磷酸甘油 O2 磷酸二羟丙酮 H2O2 H2O2 4-AAP 酚 红色亚胺醌 H2O 试剂较稳定，灵敏度高，线性范围宽，胆红素、维生素C可消耗H2O2使结果偏低。,LPL,GK,GPOD,POD,2.乳酸脱氢酶法（GK-PK-LDH 法） TG H2O 甘油 FA 甘油 ATP 3-磷酸甘油 ADP ADP 磷酸烯醇式丙酮酸 ATP 丙酮酸 丙酮酸 NADHH+

22、 乳酸 NAD+,LPL,GPOD,PK,LDH,【参考范围】0.451.69mmol/L 【临床意义】血清TG一般随年龄增长而升高，体重超标者往往偏高。 1.病理性增高 原发性高脂蛋白血症、肥胖症、糖尿病、肾病综合症、脂肪肝、妊娠后期。 2.病理性降低 甲亢、肾上腺皮质功能减退、严重肝功能损伤。,【方法评价】 1. 线性范围 可达11.4 mmol/L（1000 mg/dl）。 2. 变异系数 批内CV3%，批间CV 5%。 3. 特异性 LPL既能水解TG，也能水解DG和MG，故测定结果也包括DG和MG 。 4. 还原性物质（胆红素、维生素C）增多时，同样影响Trinder反应，可使结果出

23、现负偏差。,四、血清（浆）脂蛋白测定 （一）血清高密度脂蛋白测定 常以测定HDL-C含量代表HDL水平。测定方法分为间接法和直接法。 1. 间接法 间接法测定步骤包括： （1）HDL的分离； （2）测定HDL中胆固醇。,HDL的分离方法有：超速离心法、凝胶过滤法、免疫化学法、电泳法、沉淀法。临床实验室常用沉淀法。沉淀剂一般为二价阴离子和多价阴离子。如：肝素-Mg2+、硫酸葡聚糖- Mg2+、磷钨酸- Mg2+、聚乙二醇（PEG）等。,如：磷钨酸-Mg2+选择性地沉淀血清中的LDL和VLDL，经离心上清液中保留HDL，然后用酶法测定上清液中的胆固醇含量，即代表HDL中的胆固醇。 【参考范围】男

24、1.161.42mmol/L 女 1.291.55mmol/L 【临床意义】HDL-C与冠心病发病呈负相关，HDL-C低于0.9mmol/L是冠心病危险因素。,【方法评价】 1. 标本用量少，操作简便，结果稳定，沉淀效果好，不影响酶学分析。 2. 变异系数 批内CV1.87%，批间CV 2.93%。 3. 对温度和pH的变化非常敏感，一般温度控制在2030，pH为6.15。离心后放置不宜过长，否则结果偏高。,2. 直接法 包括选择性抑制法、清除法、PEG修饰法和免疫分离法。 其中选择性抑制法是目前国内应用最多的直接法。基本原理是用多聚阴离子及分散型表面活性剂与VLDL、LDL发生凝聚形成遮蔽圈

25、，但不发生沉淀，抑制这类脂蛋白中的胆固醇与酶试剂反应，然后用对HDL有亲和力的表面活性剂与HDL结合形成可溶性复合体，酶试剂直接与HDL-C反应。,（二）低密度脂蛋白测定 低密度脂蛋白水平通常以LDL-C含量表示。LDL-C测定方法很多，常用的有： 1. Friedewald公式法 LDL-C TCHDL-C 式中的浓度单位是mmol/L，在一般情况下能得到可被临床接受的近似结果，但TG4.25mmol/L时不能应用此公式计算，否则结果偏差太大。,2.化学沉淀法 聚乙烯硫酸（PVS）能选择性沉淀血清中LDL，再以血清TC减去上清液（含HDL和VLDL）胆固醇，即得LDL-C值。试剂中加入EDT

26、A去除两价阳离子，避免VLDL共沉。 TG4.25mmol/L时，沉淀不完全，使结果偏低。 3.直接测定法 匀相的LDL-C直接测定法是以不同的表面活性剂的双试剂使非LDL-C与LDL-C分两步水解，因先消除非LDL-C，故也称为消除法。是目前临床测定LDL-C的常规方法。,【参考范围】LDL-C3.12mmol/L 【临床意义】 1. 血清LDL-C水平随年龄增加而升高，高脂、高热量饮食、精神紧张也可导致LDL-C水平升高。 2. LDL-C增高是动脉粥样硬化发生发展的主要危险因素。 LDL-C水平与冠心病的发病率呈正相关。,五、血清载脂蛋白A及B100测定 脂蛋白中的蛋白质部分称为载脂蛋白（apolipoprotein，Apo），目前研究得较多的有A、B、C、D、E五类，其中ApoA，B，C还有亚类。 ApoA是HDL的主要蛋白质，占HDL蛋白质的85%左右，它的血清浓度可代表HDL水平，ApoB100是LDL的主要蛋白质，占LDL蛋白质的97%左右，ApoB100浓度主要反映LDL水平。,Apo的测定方法主要有三类：层析分离，然后再按一般蛋白质定量；电泳分离后经染色光密度扫描定量；各种免疫分析法。 层析