广西地方标准《鸭圆环病毒的鉴别检测聚合酶链式反应法》（征求意见稿）编制说明

1广西地方标准鸭圆环病毒的检测聚合酶链式反应法2（征求意见稿）编制说明一、项目背景、来源及目的1、项目背景鸭圆环病毒（DUCKCIRCOVIRUS，DUCV）是圆环病毒科圆环病毒属的新成员，该病毒无囊膜，二十面体对称，基因组为单股环型DNA。近年来研究表明DUCV侵害宿主的免疫系统，导致宿主免疫力低下甚至免疫失败，进而引发二重或多重感染，给养殖业造成极大经济损失。自2003年德国学者HATTERMAN等首次报道以来，DUCV已经在德国、美国、匈牙利、韩国和我国台湾等多个国家和地区被发现。近年来在中国大陆各养鸭业较为发达的省市也报道了该病毒的流行。DUCV由于损害机体淋巴组织，造成免疫低下，进而增大了感染其他疾病的几率。DUCV经常以亚临床感染的形式出现，常被人们所忽视，因此更应给予特别的关注。由于目前尚无法对鸭圆环病毒进行体外增殖培养，不能进行传统的病毒分离鉴定。目前对鸭圆环病毒的病原学检测方法主要为PCR、荧光PCR、核酸探针法、LAMP环介导等温扩增法和免疫荧光法，抗体检测方法主要是ELISA法。其中普通PCR具有特异性好、灵敏度高、价格低廉、简便快速等优点，因此使用广泛。目前，我国尚无应用鸭圆环病毒的PCR检测相关地方标准、行业标准或国家标准。2013年以来，本单位根据我区动物疫病监测、检测、诊断的需要，研制、开发了鸭圆环病毒的PCR检测方法，并应用于临床检测，效果显著。这些方法已经实验室及临床反复应用，证明具有特异性强、敏感性高、准确、快速、高效的特点，值得制定成广西地方标准，作为检测依据在全区推广应用。2、项目来源本标准为自治区质量技术监督局下达给广西动物疫病预防控制中心承担的2017年第六批广西地方标准制定（修订）计划任务项目（桂质监函2017242号）。3、项目目的目前对鸭圆环病毒的病原学检测方法主要为PCR、荧光PCR、核酸探针法、LAMP环介导等温扩增法和免疫荧光法，抗体检测方法主要是ELISA法。其中普通PCR具有特异性好、灵敏度高、价格低廉、简便快速等优点，因此使用广泛。因此本项目尝试编写检测DUCV的3推荐性地方标准，内容涵盖应用聚合酶链反应法检测DUCV的材料准备、操作方法及结果判定等。二、工作概况从2012年以来，我单位承担了广西自然科学基金项目（2012GXNSFAA053073）水禽新发疫病分子流行病学与快速检测技术研究。课题组在DUCV的PCR检测上做了大量研究，并建立了DUCV的PCR检测方法。鉴于国内DUCV的PCR检测方法尚无地方标准、行业标准或国家标准的实际，课题组开展了相关资料的收集整理工作，确定标准编写目标和依据，同时起草制（修）订广西地方标准项目建议书，积极开展标准的申报。2017年7月接到自治区质量技术监督局下达的地方标准制定（修订）项目计划的通知后，迅速成立标准编制课题组，确定标准起草编写方案及时间进度表，并积极组织实施。本标准编制课题组人员包括粟艳琼、郑敏、尹彦文、张步娴、莫胜兰、屈素洁、邹联斌、胡杰、施开创、李军。具体分工如下粟艳琼全面负责标准起草、修改、送审、报批。郑敏负责标准起草。尹彦文负责平行试验。张步娴负责比对试验。莫胜兰负责比对试验。屈素洁负责比对试验。邹联斌负责平行试验。胡杰负责标准检验。施开创负责标准稿审核。李军负责标准稿审核。三、标准编制原则1、政策性原则本标准编写过程遵循国家相关法律、法规和国家标准。2、先进性原则以国内外相关文献资料为参考，力求反映最新的科技成果；以国内同类标准的编写方法为基础，对本标准进行规范、充实和创新，使之具有先进性。3、经济性原则本项目为自筹经费项目，因此在本标准编制过程，从获取信息、起草、实验室和临床验证到形成征求意见稿的每一个环节，在确保质量的前提下均厉行节约，利用有限的经费圆满完成各阶段编写任务。4、适用性原则本标准集国内外DUCV聚合酶链反应法检测技术的成功经验，并经实验室4和临床验证，且完全按照国家标准的要求编写，内容全面，形式规范，可操作和实用性强。5、协调统一性原则本标准参照国内相关标准的编写形式和表达方法，力求与国内相关标准的协调统一。本标准通过持续查新，确保内容不与已有的国家标准、行业标准和地方标准重复或相矛盾。6、规范化原则本标准是严格按照GB/T112009的要求来编写的。四、标准主要内容及依据本标准是动物疫病防控地方标准，标准编写的重点是疫病的检测。标准的主要依据是借鉴国内先进的标准和技术内容，参考国内外有关文献资料，结合我国国情，进行实践研究，并通过试验和验证后，并参考其他资料经室内、室间验证提出。标准编写的主要内容包括样品的采集、样品的处理、PCR操作过程以及结果的判定，适合于DUCV的检测。标准的建立过程主要进行了以下试验1、试剂和设备（1）主要试剂DNA提取试剂MINIBESTVIRALPNA/DNAEXTRACTIONKITVER40；异丙醇；无水乙醇。琼脂糖凝胶电泳相关试剂琼脂粉；10TEA缓冲液，；DL2000DNAMARKER；（2）设备PCR扩增仪、TANONGIS2008凝胶成像系统。（3）引物序列分别见表1。表1引物序列及扩增片段长度引物名称特异性引物的核苷酸序列（53）扩增片段长度（BP）DUCKAF5MGAGCTGCCGCCCTTGAG3DUCKAR5TCCCGAGTAACCGTCCCACCAC3408（4）样品广西动物疫病预防控制中心从2010年2012年间在广西9市（南宁、柳州、桂林、5防城港、钦州、百色、凭祥、贵港、玉林）鸭群中所采集的2569份鸭组织样品（包括肝、肾、脾、肺、法氏囊等组织脏器）。2、方法（1）待检样品处理无菌采取待检鸭的肝、肾、脾、肺、法氏囊等器官组织样品约2克，置于洁净、灭菌并烘干的乳钵或玻璃研磨器中，充分研磨后，按14的比例加入灭菌的1MOL/LPBS（PH72）混匀，反复冻融3次；然后以3000R/MIN4离心5MIN，收集上清，用于总RNA抽提，或置于20保存备用。（2）待检样品DNA提取取200L待检样品置于无RNA酶的15ML离心管中，加入200LSOLUTIONA，剧烈震荡混匀，室温放置5MIN；加入75LSOLUTIONB，轻柔混匀后，12000R/MIN4离心5MIN。将上述操作的上清液转移至新的离心管中，加入250L含1冰乙酸的异丙醇，混匀。将试剂盒中的SPINCOLUMN安置于2ML的离心管中。将混合液转移至SPINCOLUMN中，12000R/MIN4离心1MIN，弃滤液。将500L的RINSEA加入到SPINCOLUMN中，12000R/MIN4离心1MIN，弃滤液。再将800L的RINSEB，加入到SPINCOLUMN中，12000R/MIN4离心1MIN，弃滤液。重复用RINSEB再洗涤一次SPINCOLUMN。将SPINCOLUMN安置于新的15ML的离心管上，在SPINCOLUMN膜的中央处加入30L的ELUTIONBUFFER，室温静置1MIN。12000R/MIN4离心1MIN洗脱病毒DNA。（3）PCR的建立在冰浴条件下，在PCR反应管中按下表用量分别加入各成分组分体积（L）终浓度2TAQPCRMASTERMIX125DUCKAF051PMOL/LDUCKAR051PMOL/LDNA模板55灭菌双蒸水补足至总体积25L加完试剂后瞬时离心混匀，将PCR反应管置于PCR仪内，按如下程序进行反应94预变性3MIN；9440，6030，722MIN，共35个循环；72延伸7MIN。6（4）PCR产物测序用胶回收试剂盒,从琼脂糖凝胶中回收PCR产物，将回收产物与PMD18T载体连接,转化DH5感受态细胞后,送上大连宝生物工程有限公司进行序列测定。（5）PCR的特异性试验分别用该方法对里氏杆菌（RA）、鸭肝炎病毒（DHV）、副粘病毒（AMPV）、鸭坦布苏病毒（DTUMV）等临床阳性病料提取RNA或DNA并反转录后再用建立的PCR进行扩增，以检验该方法的特异性。（6）PCR的敏感性试验取DUCV模板进行10倍系列稀释，使其浓度梯度为1011011拷贝/UL。取5L为模板进行PCR，根据其能检测的最大稀释度判定PCR的最小检出量。（7）PCR法对临床样品的检测应用所建立的PCR方法对2569份鸭组织样品（包括肝、肾、脾、肺、法氏囊等组织脏器）进行PCR检测。3、结果（1）PCR的检测结果以抽提的DUCV为模板，经过反应条件的优化，成功建立了检测DUCV的PCR检测方法。结果见图1。图1DUCV聚合酶链反应图7MDL2000DNAMARKER；1DUCV；2阴性对照（2）测序鉴定分别将测得的DUCV序列同GENBANK登录号为HM162350、EU344806、EU344807、GU168779、NC005053等5株序列进行同源性比较，结果都大于80，证明PCR所扩出的片段为DUCV的目的片段。（3）PCR的特异性试验结果以DUCV阳性样品和RA、DHV、AMPV、DTUMV的DNA作为模板，进行PCR。结果只有DUCV阳性样品反应呈阳性，而RA、DHV、AMPV、DTUMV均为阴性，没有交叉反应（图2）。图2PCR的特异性试验MDL2000DNAMARKER1DUCV2RA3DHV；4AMPV；5DTUMV；6阴性对照（4）PCR的敏感性试验敏感性试验分别以10倍系列稀释的DNA模板进行PCR。结果显示，检出下限均为101010拷贝/L；图3。8图3PCR的敏感性试验MDL2000DNAMARKER11211011010拷贝/L13阴性对照（5）PCR对临床样品的检测应用所建立的PCR方法对2569份鸭组织样品进行检测，结果检测出阳性样品194份，阳性率为755。对部分阳性样品PCR产物进行回收、测序，结果表明均为DUCV。部分阳性样品检测结果见图4。图4部分临床阳性样品的检测结果MDL2000DNAMARKER1阳性对照2阴性对照；38检验样品五、与现行法律、法规和有关标准的关系目前，国内尚无PCR检测和诊断DUCV相关的国家、行业或地方标准。本标准制订的条款未与现行的法律、法规以及有关的国家标准、行业标准中任何条款相矛盾。六、采用国际标准或国外先进标准的情况9以国内同类标准的