GCMS法比较铁皮石斛试管苗不同部位中挥发油的成分

2015年10月 第37卷第10期 中成药 Chinese Traditional Patent Medicine October 2015 Vo137 No10 GCMS法比较铁皮石斛试管苗不同部位中挥发油的成分 付 涛， 王志龙 ， 林立， 何月秋 (宁波城市职业技术学院，浙江宁波315502) 摘要：目的建立GCMS法比较铁皮石斛试管苗不同部位中挥发油的成分。方法 正己烷一水蒸气蒸馏法提取铁皮石斛 试管苗根、茎和叶中的挥发油，再利用GCMS联用仪分析鉴定其化学成分和含有量。结果共鉴定出54种化学成分， 其中根中16种、茎中45种、叶中10种，而且均以有机酸(亚油酸、棕榈酸等)为主，分别占挥发油总成分的 6440、5348和9604。其中，根中依次为酯类(1248)、萜烯类(431)、烷烃类(413)和醇类 (241)，其他占1218；茎中依次为醇类(2066)、萜烯类(1227)、酯类(607)和烷烃类(226)， 其他占525；叶中其他类成分仅占602。结论根和茎有9种共有成分，根和叶有7种共有成分，茎和叶有5种共 有成分，但根、茎和叶仅有4种共有成分。而且，茎中存在多种根、叶中不含有的成分，主要为萜烯类和烯醇类化 合物。 关键词：铁皮石斛；试管苗；挥发油；根；茎；叶；GCMS 中图分类号：R2841 文献标志码：A 文章编号：1001-1528(2015)10-2233-06 doi：103969iissn10011528201510029 Comparison of volatile oils in different parts of Dendrobium officinale tube seed- lings by GC-MS FU Tao， WANG Zhilong ，LIN Li，HE Yueqiu (Ningbo City College of Vocational Technology，Ningbo 315502，China) ABSTRACT：AIM To establish a method to compare volatile oils in different parts of Dendrobium officinale tube seedlings by GCMSMETHODS The volatile oils in roots，stems and leaves of Dofficinale tube seedlings were obtained by nhexanedistillationwhose chemical constituents and contents were then analyzed by gas chro matographymass spectrum(GC-MS)RESULTS A total of 54 chemical constituents were identified，45 of which were found in stems，16 of which were found in roots，10 of which were found in leavesAnd most of them were organic acids such as inoleic acid and hexadecanoic acid，accounting for 6440，5348and 9604in roots，stems and leaves，respectivelyAmong them，roots were followed by esters(1248)，terpenes (431)，alkanes(413)，alcohols(241)and others(1218)，stems were followed by alcohols (2066)，terpenes(1227)，esters(607)，alkanes(226)and others(525)，while other chem ical constituents only accounted for 602in leavesCONCLUSION There are 9 common constituents in roots and stemsSeven constituents exist in roots and leavesThere are 5 constituents in stems and leavesOnly 4 con stituents exist in roots，stems and leavesIn addition，many constituents exist in stems that dont exist in roots and leavesThey are mainly terpene and enol compounds KEY WORDS：Dendrobium officinale；tube seedlings；volatile oils；roots；stems；leaves；GCMS 铁皮石斛Dendrobium officinale Kimura et Migo 为兰科石斛属多年生草本植物，又名“黑节草”、 “耳环石斛”，为我国名贵中药材，在道家养生经 典道臧中被列为中华九大仙草之首，在民间 收稿日期：2015-0119 基金项目：宁波市林业科技项目(甬林计2013160) 作者简介：付涛(1988一)，男，硕士，从事园林园艺植物育种研究。TelEmail：819969334qqcon 通信作者：王志龙(1971)，男，教授，从事植物资源保护教学与研究。Tel：(0574)88861001，E-mail：wangzhl01163con 2233 2015年l0月 第37卷第10期 中成药 Chinese Traditional Patent Medicine October 2015 Vo137 No10 也有“仙草”之美誉 J。近年来研究发现，铁皮 石斛含有多糖、生物碱、黄酮、菲、氨基酸、微量 元素等众多营养成分，具有抗肿瘤、抗氧化、降血 糖、抗衰老、抗菌等作用 j。目前，其全基因组 已被云南有关科研组测序完成，并且绘制了相关精 细图谱，发现48 200个蛋白质编码基因，在目前 所有已测序的植物中最多，可见铁皮石斛化学成分 的多样性和复杂性。 野生铁皮石斛药用价值极高，但其生长条件十 分苛刻，通常只开花难结果，结果率仅为173， 繁殖极为困难，因此产量稀少，更因民间长期无限 制、掠夺性和毁灭性采挖，致使该植物资源濒临绝 种 J，1987年被国务院列为珍稀野生药用植物加 以保护。物以稀为贵，铁皮石斛因资源的极度匮乏 和法律的严格限制而价格奇高，为了满足市场上对 其日益高涨的需求，目前利用无性繁殖组培快繁 技术等对铁皮石斛进行繁殖，模拟最适宜其生长的 基质、温度、光照和湿度等环境条件进行人工栽 培，也可根据当地特色进行仿野生种植，这均大大 提高了铁皮石斛的产量，极大地弥补了市场上供不 应求的状态。 铁皮石斛全身都是宝，但一直以茎段为药用材 料，叶、根或花应用较少。目前，已有人将叶、花 做成叶茶、花茶，但加工不易，产量不高；根在传 统上有较高评价，以外观“龙头凤尾”者为优， 其中“头”为茎，而“尾”则为根，但迄今鲜见 单独对根进行研究。目前，对铁皮石斛挥发油成分 的研究相对滞后，尤其是针对其试管苗不同部位 (根、茎和叶)，未见有国内外文献报道。因此， 本实验通过研究铁皮石斛试管苗不同部位的挥发油 成分，对有效利用该植物资源和开发其试管苗具有 重要的意义。 1材料与方法 11 材料铁皮石斛试管苗来自宁波城市职业技 术学院重点实验室组培室(经度12140、纬度 2965)，以道地铁皮石斛2年生茎尖(节)为繁 殖材料，组培时选择健壮、无病虫害者，以MS为 活性炭和花宝一号(N：P：K=7：6：19)适量， 进行接种培养。当苗长3 em、叶色正常且有45 片、根有45条且长3 ClTl以上时，即可炼苗转 移，进行挥发油成分的分析。 12 主要试剂与仪器 正己烷为色谱纯(德国 Merck公司)；无水硫酸钠为分析纯(国药集团化 学试剂有限公司)；液氮。HP7890B GC system 5977A MSD GCMS联用仪(美国Agilent Technolo gies公司)；电子天平(瑞士MettlerToledo公司)； MLLIQ-超纯水仪(美国Millipore公司)；水蒸气 蒸馏装置、15 mL进样瓶、一次性注射器和液氮 罐等。 13 方法 131铁皮石斛试管苗茎、根和叶挥发油的提取 参考霍听等 报道的方法，分别称取新鲜铁皮 石斛试管苗的根、茎和叶100 g，液氮研磨成粉末 状，置于烧瓶中，加纯净水800 mL、正己烷3 mL、 沸石数粒充分摇匀，2 h后常压水蒸气蒸馏，提取 5 h，冷却静置1 h，排出水层，接收油层，用无水 硫酸钠除水2次，分别得到油状物07、08和10 mL用于进样，即得。 132 GC条件 Agilent 19091S-433色谱柱 (30 m025 mm，025 Ixm)；柱温50；进样口 温度250；柱内载气体积流量10 mLmin；载 气为高纯氦气(99999)；汽化室温度250； 柱前压762 kPa；升温程序为从50开始保持 1 min，以4Cmin速率升温至280，保持2 min； 进样量1 ；分流比10：1。 133 MS条件EI离子源；离子源温度230 qC； 接口温度250；电子能量7O eV；MS四级杆温 度150 oC；调谐EMV为1 149；溶剂延时26 min； 扫描范围15500 Amu。 14数据处理通过HP chemstation检索Nist 05 标准质谱图库和wiley 275质谱图库，同时参考相 关文献，确认铁皮石斛试管苗茎、根和叶的挥发性 成分。然后，应用HP chemstation数据处理系统， 按峰面积归一化法计算出各化学成分的相对含有 基本培养基，添加l mgL 6一BA、01 mgL NAA、 量，结果见表1和表2。 表1铁皮石斛试管苗不同部位中挥发油的种类及含有量 Tab1 Varieties and contents of volatile oils in different parts of Dendrobium officinale tube seedlings 注：表中括号内数字为具体成分的种类数 2234 2015年1O月 第37卷第10期 中成药 Chinese Traditional Patent Medicine October 2015 Vo137 No10 Linalool芳樟醇 三OtBomyl acetate L一0【一乙酸龙脑酯 Methyleugenol甲基丁子香酚 一Elemene 31-榄香烯 一Muurolene 一衣兰油烯 BCubebene 3-毕澄茄烯 dMuurolene d-衣兰油烯 Cadinene 一杜松萜烯 BCadinene 3-杜松萜烯 Elemol榄香醇 Dodecanoic acid月桂酸 Isoshyobunone异水菖蒲酮 vHimachalene,y-雪松烯 一Eudesmol 一桉叶油醇 T-Cadinol松烷醇 8-Cedrol 8一柏木醇 pEudesmol B-桉叶油醇 OLCadinol毕橙茄醇 Caryophyllene oxide环氧石竹烯 tertHexadecanethiol叔十六硫醇 Tetradecane，2，6，10一tfimethyl-2，6，10一三甲基十四烷 1-Heptatriacotanol正三十七烷醇 Tetradecanoic acid肉豆蔻酸 3-Deoxyestradiol 3-脱氧雌二醇 7-Methy1Ztetradecen1一ol acetate 7-甲基一z 十四碳烯醇乙酸酯 E8 Methyl-9一tetradecen一1ol acetate E-8一甲基-9一十四碳烯醇乙酸酯 Tetradeeanoic acid十四烷酸 Pentadecanoic acid十五烷酸 Octadecanoic acid硬脂酸 Oleic acid油酸 9-Hexadecenoic acid 9-棕榈油酸 Androst-5en4一one雄甾-5一烯_4一酮 Hexadecanoic acid棕榈酸 Abieta一8(14)，9(11)，12一triene-18一oic acid脱氢松香酸 Cembrene松柏烯 l一(+)Ascorbic acid 2，6-dihexadecanoate 1(+)一抗坏血酸_2，6 二棕榈酸酯 Linoleic acid亚油酸 CtGlyceryl linolenate d一甘油亚油酸酯 6，9，12，15Docosatetraenoic acid，methyl ester 6，9，12，15一二十二碳三烯酸甲酯 Linoleic acid ethyl ester亚油酸乙酯 E，E，Z一1，3，12一Nonadecatriene-5，14diol E，E，Z一1，3，12一十九碳三烯-5，14一二醇 9一csRetinal 9-顺式一视黄醛 Totarol桃柘酚 9(11)一Dehydrotestosterone 9(11)一去氢睾酮 Cholest-22一ene-21一ol，3，5-dehydro-6-methoxy一，pivalate 胆甾-22烯-21，醇3 5-脱氢_6一甲基氧新戊酸 Heptacosane二十七烷 Squalene鲨烯 Octacosane二十八烷 T-Muurolol T-依兰油醇 BKF 2，2 一亚甲基双一(4一甲基6-叔丁基苯酚) 17P 17三十五碳烯 Nonacosane二十九碳烷 1一Hexacosene二十六碳烯 Tetrapentacontane，1，54一dibromo一1，54-二溴-五十四碳烷 C10H18O C12H2o02 C1l Hl402 Cl5H24 C15H24 Cl5H24 Cl5HEn Cl5H2602 Cl5H2602 C15H260 C12H24O2 Cl5H240 C15H24 C10Hl80 C13H280 Cl5H260 Cl0H180 Cl5H24 Cl5H24 C16H34S C17H36 C37H760 C14H2802 Cl 8H240 Cl7H3202 Cl7H3202 Cl 4H2802 C15H3O02 C18H3602 C18H3402 C16H3002 C21 H3004 C16H3202 C20H2802 C20H32 C38H6808 Cl8H3202 C21 H3 604 C23H3 802 Cz0H36O2 C19H34O2 C2o H28 0 C20H300 Cl9H26O2 C33H54O3 C27H56 C30H50 C28H58 C1 5H260 C23H3202 C35H7o C29H6o C26H52 C54H1o8Br2 046 043 076 O73 146 799 2572 l248 2923 O77 O4 03 032 035 047 161 154 372 27 136 12 08 072 42 067 114 504 O51 O26 022 026 286 464 O27 O65 74 051 041 O88 1651 107 227 261 2275 142 045 O27 026 036 257 251 一 O61 354 085 119 049 138 一 1O2 059 283 108 一 _ _ _ _ _ _ 。 _ 139 1104 067 _ 。 374 _ 4554 。 _ 054 _ _ 143 059 _ 049 。 _ 089 2235 2 3 4 5 6 7 8 9 B M：2 “ 加 如 卯勰 加甜铊钙 钉钙 2015年10月 第37卷第10期 中成药 Chinese Traditional Patent Medicine October 2015 Vo137 No10 2结果与分析 铁皮石斛试管苗中共检测出54种挥发油成分， 分别为酯类(7种)、醇类(12种)、有机酸类 (11种)、萜烯类(13种)、烷烃类(4种)以及 其他类(7种)，具体见表1，其根、茎和叶挥发 油的总离子流色谱图见图1。 一一一 L 拦L 虹二 +TIC扫描 53 234 49 513 I 56 632 一 L 4 6 8 10 12 l4 16 18 2O 22 24 26 28 3O 32 34 36 38 40 42 44 46 48 5O 52 54 56 58 tmin C叶 图1铁皮石斛试管苗根、茎和叶挥发油的总离子流色谱图 Fig1 Total ion current chromatograms of volatile oils in roots，stems and leaves of Dendrobium officinale tube seedlings 另外，根中共检测到16种挥发油成分，其中 有机酸类含有量最高(6440)，其次是酯类 (1248)、烯萜类(431)、烷烃类(413) 和醇类(241)，其它类占1218。而且，亚 油酸和棕榈酸所占比例最高，分别为2923和 2572，其次是l一(+)一抗坏血酸一2，6一二棕榈 酸酯、1，54二溴一五十四碳烷和十五烷酸，分别 为1248、108和799；茎中共检测到45 种，其中有机酸类含有量最高(5348)，其次 是醇类(2066)、烯萜类(1227)、酯类 (607)和烷烃类(226)，其它类占525。 而且，亚油酸和棕榈酸所占比例最高，分别为 2236 2275和1651；叶中共检测到10种，其中有 机酸类含有量最高，达9604，主要是亚油酸 (4554)、棕榈酸(374)和十五烷酸 (1104)，但其他类仅占602，包括烷烃类 (143)、烯萜类(108)、醇类(054)， 其他占089，并且不含酯类。 由表2可知，根和茎有9种共有成分，分别为 B杜松萜烯、榄香醇、毕橙茄醇、正三十七烷醇、 十五烷酸、棕榈酸、l一(+)一抗坏血酸一2，6一二棕 榈酸酯、亚油酸和二十七烷；茎和叶有5种，分别 为亚油酸、棕榈酸、十五烷酸、二十七烷和E，E， Z1，3，12一十九碳三烯-5，l4一二醇；根和叶有7 0 8 6 4 2 O l 1 O O O O 00窖 j 璐 月 1J 1 4 ” O 8 6 4 2 0 0 l O O O O oug口目q、 8 6 4 2 O o0g口 = 2015年1O月 第37卷第1O期 中成药 Chinese Traditional Patent Medicine October 2015 Vo137 No10 种，分别为亚油酸、棕榈酸、十五烷酸、二十七 烷、十四烷酸、17一三十五碳烯和1，54一二溴一五十 四碳烷；根、茎和叶中也有4种，分别为亚油酸、 棕榈酸、十五烷酸和二十七烷。综上所述，茎中挥 发油的种类远多于根和叶，存在两者中不含有的成 分，虽然茎中醇类和萜烯类的相对含有量低于有机 酸类，但种类比有机酸(9种)多，分别有11种 和10种，表明茎中除有机酸类以外，醇类和萜烯 类也是其挥发油的重要组成部分；根中醇类和萜烯 类分别有4种和3种，与有机酸类相当，但相对含 有量较低，酯类虽仅有1种，但相对含有量较高 (1248)，为l一(+)一抗坏血酸一2，6-二棕榈酸 酯，并且卤代烃含有量也较高(108)，为1， 54一二溴一五十四碳烷，表明根中除有机酸类以外， 酯类、烃类、烃类衍生物也是其挥发油的重要组成 部分；叶中无论是在相对含有量还是在种类数量 上，有机酸类都占绝大多数，表明它是叶中挥发油 的最主要成分。 3讨论 邵进明等 采用固相微萃取法分析得出，2 年生铁皮石斛的茎、叶中均含有柠檬油精、壬醛、 顺3一已烯醇等成分。康联伟等 采用相同方法发 现，铁皮石斛的挥发性成分主要为醛类、醇类、酮 类、烯烃类和酯烃类化合物，另外还指出 ，愈 伤组织挥发性成分主要为烯烃类物质，而试管苗以 醛类物质为主。霍昕等 采用有机溶剂一水蒸气蒸 馏法分析显示，铁皮石斛花中挥发油的成分主要为 醛类、酯类、醇类和酮类等物质。杨柳等 采用 正己烷蒸馏法发现，铁皮石斛茎中挥发油的成分包 括烷烃、酸、烯烃、酯、甾醇、二萜、蒽醌等。然 而，本实验在铁皮石斛根、茎和叶的挥发油中均未 发现醛类成分，可能与实验方法(邵进明、康联 伟等采用固相微萃取法)和试验材料(霍昕等采 用花)的差异有关，但与杨柳等(试验方法和部 分取材部位均一致)报道一致，均不含醛类等低 沸点成分。 植物香气的产生机制非常复杂，可能是由几种 主要特征香气成分决定，也可能是由各种成分通过 融合、叠加、掩盖等相互作用而表现出来 J。 本实验表明，虽然根、茎、叶中共有的4种成分 (亚油酸、棕榈酸、十五烷酸和二十七烷)占挥发 油绝大多数，但茎中挥发油成分的种类远多于根、 叶，尤其是萜烯类和烯醇类。其中，前者有Or一衣 兰油烯、B一毕澄茄烯、 -衣兰油烯、 一杜松萜烯、 雪松烯、y-榄香烯、松柏烯、环氧石竹烯和桃柘 酚等，而后者有p一桉叶油醇、 一桉叶油醇、8一柏木 醇、芳樟醇、松烷醇、叔十六硫醇和3脱氧雌二 醇等，虽然其含有量均较低，但对该植物特殊气味 的形成具有重要作用；根中有茎、叶不存在的物 质，如 依兰油醇、二十六碳烯、二十九碳烷和 2，2 亚甲基双(4一甲基-l5叔丁基苯酚)等；叶 中有特定成分，如鲨烯和硬脂酸。由于萜烯类化合 物是具有很强生理活性的一类物质，为中草药的重 要组成成分，有着很强的杀菌、消炎、止痛、抗癌 等作用，因此我国长期使用铁皮石斛的茎作为药用 材料具有一定的科学依据。 另外还发现，无论是茎、根或者叶，其最主要 成分均为亚油酸、棕榈酸等有机酸，尤其是在叶中 含有量极高(9604)。据文献报道 ，这些成 分有一定的抗动脉粥样硬化作用，因此除茎外，根 和叶也可加以利用，应用于食品、化工等行业，如 作为茶、香料的成分或化妆品等。铁皮石斛试管苗 的挥发油中有许多既是活性药理成分，又是香料成 分，但其具体作用机制目前尚不清楚，有待于作进 一步研究。为了有效地开发利用铁皮石斛，以期用 其试管苗代替或部分代替野生种质，缓解该植物资 源贫乏的现状，有必要对其化学成分展开深入的研 究。本实验通过对铁皮石斛试管苗挥发油成分进行 研究，可为今后进一步开发利用该资源提供科学依 据。而且更为重要的是，它可作为评价不同种质铁 皮石斛试管苗品质的一个重要指标，由于出苗后不 同的生长环境和管理方式对其品质有着重要的影 响，故在试管苗即将出苗时对该植物的化学成分进 行测定，能准确了解其品质优劣，对优质铁皮石斛 资源的筛选、推广和应用均具有十分重要的意义。 参考文献： 1 周桂芬，吕圭源铁皮石斛不同部位黄酮碳苷类成分及清 除DPPH自由基能力比较研究J中国中药杂志，2012， 37(11)：15361540 2 张志勇，齐泽民，黄作喜铁皮石斛生物技术研究进展 J核农学报，2014，28(4)：605-610 3 Li Y，Wang C L，Wang Y J，et a1Three new bibenzyl deriva tives from Dendrobium candidumJChem 0m Bull， 2009，57(2)：218-219 4 IJi Y，Wang C L，Wang Y J，et a1Four new bibenzyl defiva tives from Dendrobium candidumJ 1Chem Ph n Bul1 2009，57(9)：997-999 5 Wang J H，Luo J P，Zha X Q，et a1Comparison of antitumor activities of different polysaccharide fractions from the stems of 2237 2015年10月 第37卷第10期 中成药 Chinese Traditional Patent Medieine October 2015 V0137 No10 6 7 8 9 1O Dendrobium nobile LindlJCarbohydPolym，2010，79(1)： 114118 12 Song J X，Shaw P C，Sze C W，el a1Chrysotoxine，a novel bibenzyl compound，inhibits 6-hydroxydopamine induced apop tosis in SH-SY5Y cells via mitochondria protection and NF-KB modulationJNeurochem Int，2010，57(6)：676-689 Tsai A C，Pan S L，Liao C H，et a1Moscatilin，a bibenzyl de- rivative from the India orchid Dendrobrium loddigesii，suppres- ses tumor angiogenesis and growth in vitro and in fJivoJ Cancer Lett，2010，292(2)：163170 李燕，王春兰，王芳菲，等铁皮石斛化学成分的研究 J中国中药杂志，2010，35(13)：1715-1719 霍昕，周建华，杨嘉，等铁皮石斛花挥发性成分研 究J中华中医药杂志，2008，23(8)：735-737 杨柳，刘守金，胡江苗，等GCMS法检测铁皮石斛茎中 挥发性成分J中国现代中药，20t3，15(5)：362-364 张倩倩，刘守金，方成武，等铜皮石斛花挥发性成分的 GCMS分析J中国现代中药，201l，13(6)：34 13 14 15 16 17 3540 邵进明，王道平，张永萍，等铁皮石斛茎叶中挥发油成分 的GCMS分析J贵州农业科学，2014，42(4)： 190193 康联伟，宋银，张媛，等铁皮石斛挥发油化学成分 的SPMEGCMS分析J中华中医药杂志，2011，26 (10)：2279-2281 康联伟，宋银，张媛，等铁皮石斛愈伤组织及试管苗 挥发油的气相色谱一质谱比较分析J时珍国医国药， 2011，22(6)：1391-1393 付涛，吴月燕，王立如，等鄞红葡萄及其突变体果实 氨基酸和香气分析J核农学报，2014，28