云南省罗平县与腾冲县两地稻瘟病菌致病类型分析

中国虐亏c量搪 2016。32(14)：8489 Chinese Agricultural Science Bulletin 云南省罗平县与腾冲县两地稻瘟病菌致病类型分析 褚晋 ，何鹏飞 ，赵正龙 ，吴毅歆 ，何朋杰 ，何月秋 ( 云南农业大学植物保护学院，昆明650201； 辽宁省农业科学院植物保护研究所，沈阳110161； 云南农业大学农学与生物技术学院，昆明650201) 摘要：为了明确滇东南和滇西水稻稻瘟病菌组成，采用苗期喷雾法将来自2012年和2013年罗平县与 腾冲县2个病圃的295个单孢菌株，接种到丽江新团黑谷、CO39和IRBL三套单基因系，测定它们的致 病类型。结果表明，295个菌株可划分为79个致病类型，其中罗平县48个，特异类型32个；腾冲县47 个，特异类型31个，两地共有类型仅16个，占542；携带Pi一9(0、Pi一2(0、Pi一12(t)等3个抗病基因的水稻 品种的被侵染率分别为1013、l139、1139，表明这些抗病基因在抗病育种工作中仍有很好的利用 价值。 关键词：水稻稻瘟病；单基因系；抗病基因；侵染率 中图分类号：$43511l 文献标志码：A 论文编号：casbl5120039 Pathotype Analysis of Magnaporthe oryzae in Luoping and Tengchong of Yunnan Province Chu Jin ，He Pengfei ，Zhao Zhenglong ，Wu Yixin ，He Pengjie ，He Yueqiu ( Faculty ofPlant Protection，Yunnan Agricultural University(YA，Kunming 650201； Institute ofPlant Protection，Liaoning Academy ofAgricuhural Sciences，Shenyang 1 10161； Faculty ofAgronomy and Biotechnology,YAU，Kunming 650201) Abstract：To clarify the components of Magnaporthe oryzae in southeastern and western Yunnan Province，295 single spore isolates collected from the nurseries in Luoping and Tengchong counties in 20 1 2 and 20 1 3 were inoculated to three sets of singleisogenic lines(SILs)including LTH，C039 and IRBL，with seedling spraying methodThe pathotypes were determinedThe results showed that 295 isolates could be classified into 79 pathotypes，among which，there were 48 pathotypes with 32 special types in Luoping and 47 pathotypes with 3 1 special types in TengchongThere were only 16 pathotypes shared in the two nurseries，accounted for 542 The infected frequencies of the cuhivars with Pi一9( ，Pi一2(0 or Pi一12(0 blastresistance genes were 1013， 1 139and 1 139，indicating that those genes would be useful in blastresistant breeding Key words：rice blast；singleisogenic lines；resistance gene；infection frequency 0引言 稻瘟病是由病原菌Magnaporthe oryzae侵染引起 的一种真菌病害u 。稻瘟病可引起水稻大幅减产，常 年减产1030，严重时减产4050，甚至颗粒无 收，导致全球每年稻谷减产超过l0亿kg2】。云南省在 海拔762670 m均有水稻种植和稻瘟病发生，常年发 病面积6700 hm 3，尤其以滇东南和滇西稻瘟病发生更 为严重，稻瘟病的发生严重制约了当地粮食安全和农 业的可持续发展。 自1922年日本学者佐佐木首次报道了稻瘟病菌 及其致病力具分化特性以来 ，国内外学者对稻瘟病 菌遗传分化及其生理小种、致病类型展开了一系列研 基金项目：农业部公益性行业(农业)“科研专项经费项目“粮食作物基因对基因病害的抗病品种布局技术研究示范”(201203014)。 第一作者简介：褚晋，男，1986年出生，辽宁沈阳人，硕士研究生，主要从事植物病理学研究。通信地址：110161辽宁省农业科学院植物保护研究所 Tel：02431028800，Email：chujin86vipqqcom。 通讯作者：何月秋，男，1956年出生，湖北武穴人，教授，博士生导师，主要从事植物病理学研究。通信地址：650201云南农业大学植物保护学院，Tel 08715228581，Email：ynfh2007163corn。 收稿日期：2015-1215，修回日期：20160222。 褚晋等：云南省罗平县与腾冲县两地稻瘟病菌致病类型分析 85 究。1961年，日本学者培育出第一套水稻稻瘟病鉴别 品种 1。随后，各国学者也都先后培育了各自的鉴别 品种，但由于早期的鉴别品种遗传背景不清晰，导致了 对部分小种鉴别能力较差，不能广泛应用于世界范 围。1976年日本再次培育出了一套单基因鉴别品 种嘲，以此代替了原有的抗性遗传背景未知的鉴别品 种，这套鉴别品种可以有效地鉴别粳稻稻区的稻瘟病 菌，但由于此套鉴别寄主全部由粳稻组成，使得它对籼 稻的鉴别能力有限，应用范围受到一定限制。20世纪 80年代及21世纪初，国际水稻研究所(IRRI)也分别以 CO39及丽江新团黑谷作为轮回亲本，通过与具有 已知抗性的水稻品种杂交及多次回交分别培育出了两 套单基因近等基因系 。中国稻瘟病菌生理小种的鉴 定研究始于20世纪50年代，辽宁、吉林、福建、湖南等 省率先进行了稻瘟病菌致病性分化的研究，最终从众 多品种中筛选出由特特普、珍龙l3、四丰43等3 个籼稻品种和东农363、关东5l、 合江l8、丽江 新团黑谷(LTH)等4个粳稻品种共7个品种组成的中 国稻瘟病菌生理小种的鉴别品种 ，并且制定了统一 的命名方法，利用这套鉴别品种划分中国不同稻区的 稻瘟病菌生理小种。由于上述7个品种的鉴别能力存 在不足，中国农业科学院作物育种栽培研究所又以 LTH作为轮回亲本，培育出了一套单基因系水稻鉴 别品种n ，为鉴定中国稻瘟病菌生理小种提供了新的 鉴别依据。 大量研究u ” 表明，稻瘟病菌群体的致病类型结构 与遗传结构具有多样性，其群体结构的变异可直接导 致抗病品种抗性的丧失。单基因近等基因系鉴别品 种，具有各品种遗传背景相同、对不同菌株抗性反应明 显等优点，所以可便于区分比较不同稻瘟病菌致病类 型，从而让鉴定结果更为真实可靠。因此，通过单基因 近等基因系对稻瘟病致病类型的研究对掌握稻瘟病菌 群体的田间变化动态和合理布局水稻品种、控制病害 的流行均可起到指导作用。 1材料与方法 11供试菌株 供试的295株稻瘟病菌是2012年和2013年从云 南省罗平县和腾冲县稻瘟病病圃的丽江新团黑谷品 种穗颈瘟标本上单孢分离得到的，每个样本各采用1 株。其中2012年罗平县分离100株、腾冲县103株， 2013年罗平县47株、腾冲县45株。 12供试水稻品种 供试水稻分别为中国农业科学院培育的LTH系 列单基因系(LTH SILs)、国际水稻研究所培育的CO39 系列单基因系(CO39 SlLs)和IRBL系列单基因系 (IRBL SILs)。感病对照品种为LTH。 1_3孢子悬浮液的制备 孢子悬浮液的制备参考褚晋等141的方法，即将玉 米粒煮至破裂，分装到250 mL锥形瓶中，3次间隙性 高压蒸汽灭菌45 min，以备使用。将各菌株接至马铃 薯葡萄糖培养基上(PDA)，置于25恒温培养箱中培 养。待菌落扩展至培养皿面积30左右时将菌丝挑入 事先准备好的玉米粒培养基中，继续置于25恒温培 养箱中培养57天。菌丝长满后用无菌水洗掉玉米粒 表面的气生菌丝，转入1410 h光暗周期光照培养箱 中23cC继续培养，待产生足够多的分生孢子后，以灭菌 水洗下孢子，并加入003Tween20作为表面活性 剂，配制成接种用孢子悬浮液。使用血球计数板计数， 将孢子悬浮液的浓度调至1510 个孢子mL，供接种 使用。 14秧苗管理及接种 在温室内将3套单基因系品种及对照感病品种 LTH播于50穴的塑料育苗盘中，底肥施以浓度03的 硫酸铵，苗期追施2次，并于接种前3天再追施一次，待 苗长至45叶期接种。将各孢子悬浮液用小型喷雾器 均匀喷于各品种植株上，孢子悬浮液用量每盘约 60 mL。接种完毕后，育苗盘移至相对湿度恒定95 以上的人工接种室中25黑暗保湿48 h，然后在25 正常光照周期条件下培养57天。 15病情调查与致病类型命名方法 病情调查与分级参考IRRI的标准 。基于单基 因系致病型的划分参考Gilmourt 1的方法。即将含有 24个单个抗病基因的水稻品种按C101A5l(ei-2( )、 C101PKT(Pi- f)、F80一l(Pi- 、F128一l(Pi-tae)、IRBL1 (Pi-a)、IRBL3(Pi-1)、IRBL4(Pi-()、IRBL6(Pi-k)、IRBL7 (Pi- 、IRBL8(Pi- 、IRBL9(Pi-z)、IRBLIO(Pi- 、 IRBL1I(H- 、IRBL13(Pi-ta)、IRBL14(Pi- 、IRBL15 (Pi- 、IRBL17(Pi- 、IRBL18(el- ( )、IRBL19(Pi-3 (D)、IRBL20(Pi-5(f)、IRBL21(Pi-7(t)、IRBL22(Pi-9(D)、 IRBL23(Pi-12(O)、IRBL24(Pi-19(f)的顺序依次排列， 并分别冠以代码数字：001、002、004、01、02、04、 081、1、2、4、81、10、20、40、81、100、200、400、810、 1000、2000、4000、8100、10000。进行致病类型分类时， 将所有感病类型品种对应的代码值相加，并在所得数 字之和前冠以英文字母“I”(英文单词感病Infection的 首字母)，进而得出各个菌株的致病类型名称。 16致病力的评价 参照兰波旧、杨秀娟】 1等的方法，使用致病频率对 86 中围农孝c孟报http：wwwcasborgca 单个菌株的致病力来进行评价。 2结果与分析 21稻瘟病菌群体致病类型分析 基于已知抗病基因的3套单基因系对稻瘟病菌的 抗感反应，295个菌株共可划分为79个致病类型(表 1)。各类型分布比较分散，出现频率在034542 之间。致病频率大于70的强致病类型共有18个，占 所有致病类型的2278，致病频率在50与70之间 的较强致病类型共有24个，占所有致病类型的 3038，致病频率在2O与51之间的中等致病类型 共有23个，占所有致病类型的2911，弱致病力类型 仅有14个，占所有致病类型的1772，这说明云南省 罗平县与腾冲县两地稻瘟病菌主要以中等致病力以上 致病群体为主。 22不同年份与地区的致病类型差异分析 从不同年份来看，2012年罗平县与腾冲县共出现 63个致病类型，占致病类型总数的7975：2013年两 地共出现39个致病类型，占致病类型总数的4937。 2013年与2012年相比，2013年致病类型总数明显少于 2012年，而且群体结构趋于简单，这可能是由于2013 年采集菌株较少，且2012年罗平与腾冲两地雨水较多 导致发病严重所造成的。另外，从79个致病类型的出 现情况来看，连续两年间共有23个致病类型重复出现 在两地。其中，罗平地区有4个特有致病类型连续出 现，而腾冲地区有7个特有致病类型连续出现。 从不同地区来看，罗平县共出现了48个致病类 型，占致病类型总数的6076：腾冲县共出现了47个 致病类型，占致病类型总数的5949。其中罗平县特 表1 2012-2013年稻瘟病病菌致病类型及出现频率 编号 致病类型 出现频率， 编号 致病类型 出现频率 编号 致病类型 出现频率 1 IO 54 28 I1000281 03 55 I1364864 37 2 105 07 29 Il01242l O3 56 I1421845 07 3 IO81 07 30 I102234 17 57 I1442845 17 4 I1 0-3 31 Il023481 O7 58 I1452667 07 5 I145 03 32 Il02349l O3 59 11456845 1O 6 1364 17 33 I1040281 03 60 11456846 03 7 141 14 34 Il050255 07 61 I1456847 31 8 I593 24 35 11050258 14 62 11458666 O3 9 15934 1O 36 I109638l 2O 63 I1458667 10 l0 I62 27 37 Ill24945 1O 64 I1464545 07 ll I9381 O3 38 Il127656 07 65 I1464547 10 12 Il511 1O 39 Ill27666 O_3 66 11464945 17 13 Il82 O7 40 Ill27668 1O 67 I1464947 14 14 12338l O-3 41 Il127756 03 68 I1465357 07 15 I2531 O7 42 Il142284 17 69 n673945 17 l6 I83407 14 43 Il164407 10 70 I1822845 14 17 I854 10 44 Il164415 14 71 I1867647 03 18 19691 20 45 I1l9ll 03 72 Il86766 07 19 I1361 07 46 I12l205 07 73 1201618l 07 20 I3l61_36 17 47 I124553l 17 74 12068764 17 2l 13435-36 20 48 I13l5715 34 75 12162845 1O 22 1379645 07 49 Il324545 31 76 I2162847 10 23 1388821 20 5O Il324555 14 77 I221O0 03 24 14096 07 51 Il326915 20 78 I2677766 31 25 I415O1 07 52 Il332657 03 79 12677768 41 26 I4242 14 53 I1332667 03 27 1456845 14 54 I1362947 24 褚晋等：云南省罗平县与腾冲县两地稻瘟病菌致病类型分析 87 有致病类型32个，腾冲县特有致病类型31个，两地共 有类型仅16个，占542，致病类型具有丰富多样性。 2-3稻瘟病菌对24个抗病基因的侵染率 295个供试菌株均可引起 丽江新团黑谷发病。 由表2可见，对于24个不同的抗病基因来说，有 4585的菌株可以克服低于半数的抗病基因(0l2 个)，有5415的菌株可以克服多于半数的抗病基因 (13-24个)。其中，有552的菌株不能克服任何一个 抗病基因，有407的菌株可以克服全部的24个抗病 基因，没有发现同时克服7个、20个、21个和22个抗病 基因的菌株。 由表3可见，在24个抗病基因中， sh、Pi-k、 、 pi-z5、Pia、Pi-ta、Pi一3(0、Pi-l：、Pi-lO、Pi-t、Pi-ld、Pi-ld 等l2个基因的被侵染率都已经超过50，分别为 5063、5823、5823、5823、5949、6329、 6329、6456、6456、6709、7089、7215，表 明这些抗病基因在云南省罗平县与腾冲县已经基本失 去了利用价值。而Pi-9(t)、Pi-2(t)、Pi-12(O这3个抗病 表2稻瘟病菌与单基因系的关系 表3 295个菌株对24个抗病基因单基因系的侵染率 抗病基因 被侵染率 抗病基因 被侵染率 抗病基因 被侵染率 ei-2(0 1139 7O89 P 5O63 a)(O 2278 P 481O 1 4557 附 5823 Pi-z 3165 J 6329 Pi-ta“ 2278 5823 ei-5(O 3291 a 5949 胧 25_32 Pi-7(O 4430 5823 6329 Pi-9( 1013 Pi求 6456 b 4557 el-l=,(f) 1139 Pi 12 5 t 67O9 Pi-19(0 6456 88 中国农学通报http：wwwcasborgca 基因系被侵染率为1013、1139、1139，这说明 Pi-9(0、Pi-e(O、 J2(0等3个基因在抗病育种工作中 仍有很好的利用价值。 3结论与讨论 本研究基于3套单基因系水稻品种，对来自云南 省稻瘟病重发区罗平县与腾冲县的295个稻瘟病菌单 孢菌株进行了致病类型的测定，试验结果初步显示， 295个菌株可分为79个致病类型，且2个病圃相同的 致病类型仅l6个，占542，说明两地稻瘟病菌群体具 有丰富的多样性。稻瘟病菌对鉴别品系的侵染力试验 结果认为，已有超过半数菌株可同时克服l2个以上的 抗瘟基因，抗瘟基因抗性表现不尽如人意。前人在利 用IRBL单基因系进行研究时，也认为在云南地区已 有超过半数的抗病基因不再具有利用价值n 删，本研究 利用3套不同的单基因系进行了致病类型分析后，同 样也得到相似结果，这预示着挖掘与引进新的抗源基 因成为了云南省乃至全国防治水稻稻瘟病的当务之 急。在3套单基因系所含的24个抗病基因中， 9(0、 Pi-2(0、 2(0等基因受病原菌的侵染率比较低，表现 出较为广谱的抗瘟性，根据“基因对基因假说”，可以认 为 9(0、Pi-2(0、Pi-12(t)等3个基因在云南省水稻的 抗病育种工作中具有良好的利用价值。 由于中国传统稻瘟病鉴别品种具有品种类型的局 限性以及遗传背景不清等问题n ，导致了鉴定的生理 小种在实际生产与育种工作中所提供的指导意义不 大。基于己知单基因近等基因系的鉴别品种克服了遗 传背景对鉴定结果的影响 ，所得鉴定结果更具说服 力，更能客观地检测稻瘟病菌毒性组成。分析已知抗 病基因在田间的实际表现，且鉴定的结果毒性类型分 散，可鉴别出更多致病类型，致病类型的划分更加细 致。而病原菌对抗病基因的侵染率分析，可以更好地 评价与明确抗瘟基因在田间的抗性表现，可为抗瘟品 种的合理布局提供可靠的依据。本研究中所使用的三 套单基因系中，CO39及IRBL两套单基因系为国际水 稻研究所培育，其中CO39单基因系由于回交亲本 CO39中含有主效抗性基因 ”，故其并未达到单 基因系水平，所以不可鉴定出全部致病类型。而IRBL 单基因系培育时只经过l3次回交，24个品种间遗传 背景存在较大差异，并未达到近等基因系水平 ，也使 鉴定结果受到一定影响。中国农业科学院以LTH作 为轮回亲本培育的则是含有单基因的近等基因系，可 广泛应用于水稻稻瘟病致病类型的鉴定工作中，但由 于其所含抗瘟基因数量较少，故本研究综合了3套单 基因系对云南水稻主产区的稻瘟病菌进行了致病类型 的分析，得到了较为全面而又精准的数据，以期为研究 云南地区的稻瘟病菌提供科学的理论依据。 另外，在本研究所有供试水稻品种中，当不同品种 含有相同抗性基因时，CO39与LTH两套单基因系水 稻品种的抗谱普遍高于IRBL单基因系，所以笔者认 为当某些抗病基因存在于CO39与LTH两套近等基因 系时，它们可以更好的发挥抗性作用；另一方面，在 CO39(Pi-a)、CIO1LAC(Pi-J(D)、C104PKT(Pi-3(0)、 F124一l(Pi-ta)、F129(Pi-)、IRBL12(Pi- 等6个品种中 除了己知的主效抗病基因外，是否还存在着其他未知 抗病基因，这些都还需进一步证实。 参考文献 1 Krause R A，Webster R KThe morphology,taxonomy,and sexuality of the rice stem rot fungus，Magnaporthe salvinff (Leptosphaeria salvinil)J_Mycologia，1972，64(1)：103一ll4 2 张晓娟，张羽，张辰露，等分子标记在稻瘟病抗性育种中应用的研 究进展J】江苏农业科学，2013，41(8)：7375 3】 涂敏，王云月，卢宝荣，等云南省水稻品种稻瘟病抗性差异与遗传 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