多穗柯甜茶的质量标准研究终稿

学科分类号 0710 本科生毕业论文题目（中文）：多穗柯甜茶的质量标准研究 （英文）：The Study to the Quality Standard ofLithocarpus litseifolius (Hance) Chun学生姓名： 黄雪雨 学 号： 1112403038 系 别： 生命科学系 专 业： 生物科学专业 指导教师： 伍贤进（教授） 李胜华（副教授） 起止日期： 2014.32015.4 年 月 日怀化学院本科毕业论文诚信声明作者郑重声明：所呈交的本科毕业论文，是在指导老师的指导下，独立进行研究所取得的成果，成果不存在知识产权争议。除文中已经注明引用的内容外，论文不含任何其他个入或集体已经发表或撰写过的成果。对论文的研究做出重要贡献的个入和集体均已在文中以明确的方式标明。本声明的法律结果由作者承担。本科毕业论文作者签名：年 月 日目 录摘 要 .I关键词 .IKey words .II1 前言 .11.1 多穗柯的作用 .11.2 主要化学成分 .12.3 本实验目的及意义 .22 材料与方法 .22.1 实验材料 .22.1.1 多穗柯样品采集与处理 .22.1.2 仪器与设备 .32.1.3 试剂与药品 .32.2 实验方法 .32.2.1 黄酮含量的考察 .32.2.2 总多酚含量的考察 .32.2.3 总灰分考察 .42.2.4 水不溶性灰分考察 .42.2.5 酸不溶性灰分考察 .43.1 总黄酮含量分析 .53.2 总多酚含量分析 .53.3 总灰分含量分析 .53.4 水不溶性灰分含量分析 .63.5 酸不溶性灰分含量分析 .64 讨论 .7参考文献 .7致 谢 .10I多穗柯甜茶的质量标准研究摘 要目的：研究多穗柯甜茶的质量标准，为穗柯甜茶的质量控制提供依据。方法：用茶烘焙法处理的新鲜多穗柯成年叶和嫩叶为材料，采用氯化铝比色法以芦丁为标准品测定多穗柯甜茶中的总黄酮含量；参照 GB/T 8313 规定测定总多酚含量；参照 GB/T8306规定测定总灰分含量、参照 GB/T 8307 测定水不溶性灰分、参照 GB/T 8308 测定酸不溶性灰分含量。结果：不同时间采集于湖南芷江野生甜茶厂栽培基地的三批成年叶制成的甜茶黄酮含量不低于 8.52%，多酚含量不低于 10.10%，总灰分、水不溶性灰分、酸不溶性灰分含量分别不高于 4.96%、1.98%、0.29%；嫩叶制成的甜茶黄酮含量不低于9.24%，多酚含量不低于 10.21%，总灰分、水不溶性灰分、酸不溶性灰分含量分别不高于 4.99%、2.24%、0.19% 。结论：所研究的质量标准能为多穗柯甜茶质量控制提供有效的依据。关键词多穗柯；质量标准；总黄酮；总多酚；灰分The Study to the Quality Standard of Lithocarpus litseifolius (Hance) ChunAbstractObjective: To study the quality standard of Lithocarpus litseifolius (Hance) Chun and provide basis for controlling the quality standard of litseifolius. Methods: Taking the fresh adult leaves and tender leaves witch is treated by curing as materials, ussd rutin as standard to determine the total flavonoids content with Aluminum chloride colorimetry; content of total polyphenol were determined referred to the rules of GB/T 8313; determined the content of total ash referred to the rules of GB/T8306, determined the content of insoluble ash referred to the rules of GB/T8307, determined the content of acid-insoluble ash referred to the rules of GB/T8308. Results: Three bathes sweet tea were collected from the cultivation base of ZhiJiang wild sweet tea factory on different month. The total flaconoides content of sweet tea made by adult leaves were not under 8.52%, total polyphenol content were not under10.10%, the content of total ash, insoluble ash, acid-insoluble ash were not over 4.96%,1.98%,0.29% IIrespectively. The total flaconoides content made by tender leaves were not under 9.24%, total polyphenol content were not under10.21%, the content of total ash, insoluble ash, acid-insoluble ash were not over 4.99%、2.24%、0.19% respectively. Conclusion: The study to quality standard can provide effective basis for the control of litseifolius quality.Key wordsLithocarpus litseifolius (Hance) Chun; Quality Standard; Total Flavonoid; Total Polyphenol ; Ash11 前言多穗柯(Lithocarpus polystachyus Rehd.)，又叫甜叶子树、胖稠、甜味菜、大叶稠子、甘茶、多穗石柯等，是壳斗科栎属的一种常绿乔木 12。多穗柯主要以野生状态分布在我国长江以南省区的低山密林中，尤其以江西、广西、湖南、安徽等省资源丰富，在湖南主要分布于雪峰山一带 3。1.1 多穗柯的作用多穗柯兼具茶、糖、药三种功能，嫩叶可采摘加工制成甜茶饮品，并且具有高甜、低热和无糖的特点。多穗柯甜茶在民间已有上千年的使用历史,在降血糖、调血脂及降血压方面也有独特的疗效。据文献报道,多穗柯叶有清热利湿的功能,可治湿热痢疾、皮肤瘙痒、痈疽恶疮 4;叶煎服可治高血压 5。多穗柯具有明显的降血糖作用，其中的总黄酮具有改善链脲菌素或四氧嘧啶诱发的高血糖和糖耐量作用 6 ，对型糖尿病和型糖尿病都有显著改善作用 7。多穗柯乙酸乙酯、水相提取液都能降低小鼠血糖和小鼠血清中的丙二醛(MDA 值)，可使小鼠血清中的过氧化氢酶（CAT 值）恢复。多穗柯提取液具有降血糖功效，对糖尿病小鼠具有一定的调节保护作用 8。有实验用多穗柯嫩叶提取的甜味剂进行大鼠降血脂实验证实有降胆固醇和甘油三脂的作用,并能延长凝血时间,减少血粘度作用 9。有研究证明多穗柯中的总黄酮有一定的抑菌效果，且 70%的乙醇提取液的抑菌效果最明显 10。李晚谊 11等发现多穗柯甜茶的醋酸乙酯组分抗过敏作用最强,对透明质酸酶的抑制率为 70%，抗过敏的活性成分可能是黄酮。多穗柯叶片中的三个化合物三叶苷 2 醋酸盐，根皮苷和三叶苷，在体外有较弱的抗氧化活性 12，其中根皮苷在体内能被水解脱去糖苷基生成根皮素，具有更好的抗氧化能力13。多穗柯中的根皮苷可以促进大小鼠的学习和记忆能力，并有拮抗胰岛素减弱记忆保持的能力 14。曾宪彪 15用多穗柯提取液对大鼠灌胃进行长期毒性研究发现大鼠除有可逆性肝中毒改变外，未见明显的其他毒性反应，可见多穗柯基本无毒副作用。1.2 主要化学成分近年来，全国各地的学者对多穗柯的化学成分进行了较深入的研究。王日为等 16通过对湖南野生甜茶及初制品的水浸出物等常量成分测定表明，甜茶的甜味不是可溶性还原糖提供的。多穗柯的化学成分主要是黄酮类和三萜类化合物 17，李胜华 18等学者通过研究不同时间多穗柯中黄酮总含量动态变化表明其叶片中的黄酮类化合物的含量高达 10.6 %左右。目前已有人鉴定出多穗柯中至少含 22 种黄酮类物质，而黄酮类中的根皮苷、三叶苷和 3 羟基根皮苷正是多穗柯的主要甜味成分 11,1924。周文华 25从湖南甜茶中分离到二氢查尔酮-2-D 葡萄糖甙和二氢查耳酮 4-D 葡萄糖甙这两种含量极高的天然甜素，总含量达到 12.6%。李胜华等人对多穗柯醇提物进行分2离纯化，鉴定出其中含有根皮苷、根皮素、二氢查尔酮-2-D -吡喃葡萄糖苷、胡萝卜苷、-谷甾醇、槲皮素、木犀草素、槲皮苷及齐墩果酸等 9 种化合物。Henry.R.Arthur 等 26在上世纪七十年代研究发现，多穗柯茎和叶中含有结构类型主要为齐墩果烷和达玛烷环菠萝蜜烷等的三萜类化合物。廖晓峰 27对多穗柯甜茶浸提液进行全面分析，证明了其富含多种人体必需的微量元素、维生素及 16 种氨基酸，并发现了多穗柯甜茶中咖啡碱含量比普通绿茶低，总多酚和黄酮的含量都要高于绿茶。1.3 本实验目的及意义多穗柯在我国民间作为茶、药使用已有上千年的历史，随着入们生活水平的提高，像多穗柯甜茶这类高甜、低热、无糖的天然健康食品日益受到广大消费者的青睐。近年来，多穗柯甜茶的应用范围日渐扩大，除茶、药两用外，还被加工制成甜味剂、色素等食品添加剂和各种保健食品。据初步考察，我国年产多穗柯干嫩叶 1000 吨左右 9。我国对多穗柯甜茶的科学研究起步较晚，发展缓慢，近几年才呈现出增长趋势 28，在食用和药用价值两方面的开发及利用上取得了很大的进展。如今我国多穗柯甜茶产量日益增加，但对多穗柯的研究多集中于多穗柯的化学成分及药理作用分析两大方面，质量控制方面的研究太少，只有黄松等学者曾对采摘于湖南的六批多穗柯甜茶的总黄酮和根皮苷质量进行研究，通过紫外分光光度计测得其总黄酮含量在 103.12183.54 mgg- 1 之间，用高效液相色谱法测得根皮苷含量在0.09981.1976g 范围内与峰面积积分值呈良好线性关系 29；廖晓峰 27等曾通过对江西野生多穗柯甜茶成分的分析,证明了其总灰分含量为 42.4 mg/g，水不溶性灰分含量有 26.8 mg/g，富含多种营养物质及入体必需的微量元素和维生素,并因富含二氢查耳酮新型甜味剂而有独特的甜茶特色。这些学者的研究为大力开发的天然野生植物多穗柯资源的质量标准建立提供了一定的科学依据，但不足以作为建立多穗柯甜茶的质量标准的充分依据。黄酮是带给多穗柯甜茶特色的一类化合物，多穗柯所具有的多种药理功效都是黄酮类化合物所起的作用。甜茶也是一种别样茶，而多酚是茶叶色香味的主要成分之一，也是茶叶中保健功能的主要成分之一。灰分反映的是食品或药品本身的无机盐含量，灰分检测是对产品纯度检测的一种方法。本文对湖南芷江产甜茶的总黄酮，总多酚，总灰分，水不溶性灰分和酸不溶性灰分含量进行了研究，为多穗柯甜茶的质量标准建立提供更多的理论依据，也为甜茶开发利用提供更多的保证。2 材料与方法2.1 实验材料2.1.1 多穗柯样品采集与处理3本实验采用的 3 批怀化多穗柯样品分别于 2014 年 7 月、10 月、2015 年 4 月采集于湖南怀化芷江，每次采摘有嫩叶（多穗柯茎尖 24 cm 新芽）和成年叶（新芽以下1-3 片新叶，叶长 1012 cm）两种样品。采摘后用流水洗净茶叶表面的泥沙，自然风干表面水分后在 110 干燥箱内嫩叶杀青 6 min，成年叶杀青 10min，再置于 65干燥箱中烘干至恒重，得到多穗柯成年叶和嫩叶制成的两种茶叶（后文分别用成年叶与嫩叶指代）。将烘干的茶叶粉碎，过 60 目筛，得到多穗柯甜茶磨碎样品，保存在干燥器中。2.1.2 仪器与设备UV-2450 分光光度计；KA-1000 离心机（上海安亭科学仪器厂）；RE-52AA 旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；0.45 um 滤膜（津腾实验设备有限公司）SX12-10 型马弗炉（河北省黄骅市综合电器厂） ；定量滤纸（杭州 特种纸业有限公司）FA2004N 型分析天平；XT-1000A 型粉碎机（浙江永康市红太阳机电有限公司）；420 型恒温水箱（江苏金坛市中大仪器厂）。2.1.3 试剂与药品芦丁对照品（上海如吉生物科技发展有限公司，批号：140702）；没食子酸（天津市光复精细化工研究所）；福林酚试剂（上海如吉生物科技发展有限公司，批号：75260）；甲醇；乙醇；亚硝酸钠；氯化钠；氢氧化钠；碳酸钠；盐酸；水为蒸馏水。2.2 实验方法2.2.1 黄酮含量的考察制备标准曲线：称取干燥至恒重的芦丁对照品 10 mg，置 50 ml 容量瓶中，加 85 % 乙醇 30 ml，置于水浴上微热使溶解，放冷，加乙醇稀释至刻度，摇匀，使之成为浓度为 0.2 mg/ml 的芦丁标准品溶液，作为贮备液备用。精密吸取此对照液 0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 ml 分别置于 25 ml 量瓶中，加 5 %亚硝酸钠溶液 1.0 ml，摇匀放 6 min 后，加 10 % 氯化铝溶液 1.0 ml，摇匀，放置 6 min 后，加 1.0 mol/L 氢氧化钠 10 ml，最后各用 85 %乙醇稀释至刻度，摇匀，放置 15 min 。用第一瓶作空白，在 510 nm 处测吸光度，以吸光度(y )作纵坐标，芦丁浓度(x)作横坐标绘制标准曲线，得出回归方程。样品中总黄酮提取 18,30及含量的测定：索氏提取法，称取粉碎甜茶样品 2 g ，滤纸包好，用 100 ml 甲醇在 80水浴中提取至提取器中液体近无色，旋转蒸发回收甲醇，滤纸过滤，用 85 %乙醇将提取液定容至 100 ml 容量瓶中，得到待测液。精密量取 3份 1 ml 样品溶液至 25 ml 的定量管，加 5 % 亚硝酸钠 1.0 ml，混匀，放置 6 min，加5 % 的氯化铝 1.0 ml，混匀，放置 6 min，加 1 mol/L 的氢氧化钠 10 ml，再加水至刻4度，摇匀，放置 15 min，用分光光度法在 510 nm 波长处测定吸光度，根据回归方程计算样品中总黄酮含量。2.2.2 总多酚含量的考察参照 GB/T8313-2008 茶多酚含量测定方法 31。标准曲线制备：精密称取没食子酸标准品 0.110 g 溶解于 100 ml 容量瓶中，再从 100 ml 容量瓶中取 10 ml 溶液溶于 100 ml容量瓶中，制成浓度为 100 g/ml 的标准储备液。分别精密吸取标准储备液 0 ml，0.4 ml， 0.8 ml，1.2 ml，1.6 ml，2.0 ml，2.4 ml 于 25 ml 刻度试管中，在每个试管内分别加入 5 ml 福林酚试剂，摇匀，反应 3 min8 min 内，加入 4 ml 7.5 %碳酸钠溶液，加水定容至刻度，摇匀。室温下（25 左右）放置 60 min。用 10 mm 比色皿在 765 nm 波长条件下用分光光度计测定吸光度，以吸光度(y)作纵坐标，没食子酸浓度(x)作横坐标绘制标准曲线，得出回归方程。样品中总多酚提取及含量测定：称取 0.2 g 均匀磨碎的试样于 10 ml 离心管中，加入在 70 中预热过的 70 %甲醇溶液 5 ml，用玻璃棒充分搅拌均匀湿润，立即移入 70 水浴中，浸提 10 min（每 5 min 搅拌一次） ，浸提后冷却至室温，转入离心机在 3500 rpm 转速条件下离心 10 min，将上清液转移至 10 ml 容量瓶。残渣再用 5 ml 70%的甲醇溶液提取一次，重复以上操作。合并以上提取液并用甲醇定容至 10 ml，摇匀，过0.45 um 虑膜，得到母液。吸取三份 0.1 ml 的母液至 25 ml 刻度试管中，用蒸馏水做空白对照，在每个试管内分别加入 5 ml 福林酚试剂，摇匀，反应 3 min8 min 内，加入 4 ml 浓度为 7.5%的碳酸钠溶液，加水定容至刻度，摇匀。室温下放置 60 min。用 10 mm比色皿在 765 nm 波长条件下用分光光度计测定吸光度，根据标准曲线计算总多酚含量。2.2.3 总灰分考察参照 GB/T8306-2013 总灰分含量测定方法 32。将三个 50 ml 和三个 30 ml 洁净的坩埚置于 525 25 高温炉内灼烧 1 h，待炉温降至 300 左右时，取出坩埚，于干燥器内冷却至室温，称量。分别称取三份 5 g 和三份 2 g 的干燥样品于 50 ml 和 30 ml 的坩埚内，在电热板上徐徐加热，使试样充分炭化至无烟。将坩埚移入 525 250 高温炉内，灼烧至无炭粒。待炉温降至 300 左右时，取出，置于干燥器内冷却至室温，称量。再移入高温炉内以上述温度灼烧 1 h，取出，冷却，称量。再移入高温炉内，灼烧 30 min，取出，冷却，称量。重复此操作，直至连续两次称量差不超过 0.001 g 为止。以最小称量为准。2.2.4 水不溶性灰分考察参照 GB/T8307-2013 水不溶性灰分含量测定方法 33。用 25 ml 沸蒸馏水,将三份 30 5ml 坩埚内的总灰分从坩埚中分别洗入 100 ml 烧杯中，加热至微沸,趁热用无灰滤纸过滤,用热蒸馏水分次洗涤烧杯和滤纸上的残留物,直至滤液和洗涤液体积达 150 ml。将滤纸连同残留物移入原坩埚中,在沸水浴上小心地蒸去水分。移入高温炉内,以 52525 灼烧至灰中无炭粒。待炉温降