饲料中添加益生菌对凡纳滨对虾的生长和免疫力的影响

Comment pz1: 你们老师是教授/副教授淮海工学院二一七届本科毕业设计（论文） 第 1 页 共 25 页本 科 毕 业 设 计 (论 文)饲料中添加益生菌对南美白对虾生长和免疫力的影响Effects of Probiotic Bacterium on the Growth Performance and Immunity of Litopenaeus vannamei学 院 ：海洋生命与水产学院 专 业 班 级 ：水产养殖 131 学 生 姓 名 ：张鹏 学 号：2013121279 指 导 教 师 ：毕可然（副教授博士） 淮海工学院二一七届本科毕业设计（论文） 第 2 页 共 25 页2017 年 5 月毕业设计（论文）中文摘要Comment pz2: 从摘要开始全文的文字和字母是新罗马字体的淮海工学院二一七届本科毕业设计（论文） 第 3 页 共 25 页饲料中添加益生菌对南美白对虾生长和免疫力的影响摘 要：为研究饲料中添加益生菌对南美白对虾生长和免疫力的影响，以初体质量为( 6.95 1.20) g 的南美白对虾为实验材料，在室内养殖箱进行 3周的养殖实验和 2 周的副溶血弧菌人工感染实验; 其中，对照组每天投喂基础饲料，实验组每日投喂在基础饲料中添加地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌/枯草芽孢杆菌( 1：1) 配制成的 3 组实验饲料，实验饲料中益生菌的终浓度为 1010cfu /g。实验结果表明，添加芽孢杆菌饲料喂养的南美白对虾的生长速度明显比对照组生长速度快(P0.05)，其中添加复合芽孢杆菌的实验组生长速度最为明显。在饲料中添加单一芽孢杆菌或复合芽孢杆菌都可以明显加强南美白对虾对副溶血弧菌的抵抗能力(P0.05)，且复合芽孢杆菌的保护能力更强。饲料中添加芽孢杆菌可以提高南美白对虾肠道蛋白酶和淀粉酶活力，且饲料中添加复合芽孢杆菌的实验组的淀粉酶活力相比于对照组显著提高(P0.05)。饲料中添加芽孢杆菌可以有效的降低肠道中的弧菌数(P0.05)，南美白对酚氧化酶活力、超歧化氧化酶活力和总抗氧化能力有了明显的提升。综上所述，饲料中添加益生菌可以促进南美白对虾的生长，加强其免疫力，添加复合益生菌则有更好的效果。关键词: 南美白对虾; 益生菌; 生长; 免疫力; 副溶血弧菌毕业设计（论文）外文摘要淮海工学院二一七届本科毕业设计（论文） 第 4 页 共 25 页Effects of Probiotic Bacterium on the Growth Performance and Immunity of Litopenaeus vannameiAbstract: In order to study the effects of probiotics on the growth and immunity of Penaeus vannamei, the larvae of P. vannamei (6.95 1.20) g were used as experimental materials and cultured in the indoor culture box for 3 weeks The experimental group was fed with Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis / Bacillus subtilis (Bacillus subtilis) in the control group, and the control group was fed with basal diet daily. 1: 1). The final concentration of probiotics in experimental feed was 1010 cfu / g. The results showed that the growth rate of Penaeus vannamei fed with Bacillus sp. Was faster than that of the control group (P 0.05). The growth rate of the experimental group was the most obvious. The addition of single Bacillus or Bacillus subtilis to the feed could significantly enhance the resistance of P. viride to Vibrio parahaemolyticus (P 0.05), and the protective ability of Bacillus subtilis was stronger. The activity of amylase and the activity of amylase in the control group were significantly higher than those in the control group (P 0.05). The addition of Bacillus in feed could effectively reduce the number of Vibrio in the intestine (P 0.05). The activity of Phenoloxidase, the activity of hyperbranched oxidase and the total antioxidant capacity were improved obviously. In summary, the feed added probiotics can promote the growth of Penaeus vannamei, strengthen its immunity, add compound probiotics have a better effect.Keywords: Penaeus vannamei; Probiotics; Growth; Immunity; Vibrio parahaemolyticus淮海工学院二一七届本科毕业设计（论文） 第 5 页 共 25 页目 录1.1 目前国内外对虾养殖简况 .51.2 现阶段我国对虾养殖存在的主要问题 .51.3 益生菌 .62.材料与方法 .72.1实验材料 .72.2实验分组 .82.3副溶血弧菌感染实验 .83.实验指标与计算 .93.1 生长指标 .93.2 肠道消化酶活力 .93.3虾肠道菌群总数和弧菌总数 .103.4免疫指标的测定 .103.4.1血细胞计数 .103.4.2酚氧化酶（PO）活性的测定 .104.结果与分析 .124.1不同益生菌对南美白对虾生长指标的影响 .124.2不同益生菌对肠道消化酶活力的影响 .134.3不同益生菌对肠道菌群总数和弧菌总数的影响 .144.4不同益生菌对南美白对虾免疫指标的影响 .154.4.1不同益生菌对南美白对虾血细胞数量的影响 .154.4.2不同益生菌对南美白对虾的血清中酚氧化酶（PO）活力的影响 .154.4.3不同益生菌对南美白对虾血清中的溶菌酶活力的影响 .154.4.4不同益生菌对南美白对虾血清中的超氧化歧化酶（SOD）的影响 .164.4.5不同益生菌对南美白对虾血清的总抗氧化能力的影响 .165.讨论 .165.1营养及益生菌添加剂途径的对虾免疫调控 .175.2饲料中添加益生菌改善养殖环境 .175.3无抗时代的抑菌方案 .18结 论 .19致 谢 .20参 考 文 献 .211.绪论 .51.1目前国内外对虾养殖简况 .51.2现阶段我国对虾养殖存在的主要问题 .51.3 益生菌 .62.材料与方法 .72.1实验材料 .72.2实验分组 .82.3副溶血弧菌感染实验 .83.实验指标与计算 .83.1 生长指标 .93.2 肠道消化酶活力 .9淮海工学院二一七届本科毕业设计（论文） 第 6 页 共 25 页3.3虾肠道菌群总数和弧菌总数 .93.4免疫指标的测定 .104.结果与分析 .134.1不同益生菌对南美白对虾生长指标的影响 .134.2不同益生菌对肠道消化酶活力的影响 .134.3不同益生菌对肠道菌群总数和弧菌总数的影响 .144.4不同益生菌对南美白对虾免疫指标的影响 .155.讨论 .165.1营养及益生菌添加剂途径的对虾免疫调控 .175.2饲料中添加益生菌改善养殖环境 .175.3无抗时代的抑菌方案 .18结 论 .18致 谢 .19参 考 文 献 .20淮海工学院二一七届本科毕业设计（论文） 第 7 页 共 25 页1.绪论1.1 目前国内外对虾养殖简况日前，由于虾类养殖业在农业生产总值中占很大一部分，对虾类也是人类摄取蛋白的重要来源，所以很多沿海国家的对虾养殖产业正处于快速发展时期，全球对虾养殖业进入迅速发展是从1980年到1990年。1993年，由于全球爆发对虾病毒，给对虾养殖业造成了很大的损失，之后对虾的养殖发展进入了没落期 1。此后，因为养殖品种的研究，出现了南美白对虾养殖品种，再加上养殖技术的不断先进如微生物制剂的广泛使用，促进全球对虾养殖产业逐渐的稳步的前进，对对虾养殖产量的提升有着不可忽视的存在 2。通过相关研究可了解，中国大部分地区对虾养殖产业重点养殖的品种为南美白对虾，并且南美白对虾产量占所有虾类产量百分比每年都在逐步提升，2003年我国养殖对虾总产量达到79万吨，其中南美白对虾产量达到61万吨，占虾类养殖总量的76.7% 3。2010 年全球对虾的总产量350 万吨，而我国对虾养殖产量达到134.8万吨，其中海水对虾占到73.3 万吨，淡水虾的产量占到61.5万吨，我国南美白对虾的产量约占我国南美白对虾容量的80%，我国南美白对虾主要养殖产地为江苏、广东和广西等地。目前我国对虾养殖主要养殖品种除了南美白对虾（Litopenaeus vannamei）外，还有斑节对虾（Penaeus monodon） ，中国对虾（Fenneropenaeus chinensis ） ，日本对虾（Marsupenaeus japonicus）等。在我国沿海地区也有少量养殖长毛对虾（Fenneropenaeus penicillatus） ，墨吉对虾（Fenneropenaeus merguiensis） ，细角对虾（Litopenaeus stylirostris） ，新对虾（Matapenaeus sp）等在我国沿海地区也有少量养殖。1.2 现阶段我国对虾养殖存在的主要问题虽然我国对虾养殖产业再不停的前进与进步，但现在当下依然有不少问题等待解决。目前国内在对虾养殖中生产中缺乏一个明确的管理标准，这就造成对虾养殖户对利润的一味追求，而造成对养殖环境的严重破坏，过多的重视对虾这一养殖对象，而忽视了养殖环境，饲料投喂过剩或养殖过程中操作不当导致养殖排水中营养成分的极大超标，这些养殖废水在没有经过处理的情况下被排放到养殖环境周围的自然水域中，引起该水域氮磷含量非正常上升，这就大大增加了该水域水体富营养化的可能。除了养殖生产过程的养殖废水的肆意排放，还有很多问题需要去解决：首先是虾苗的健康活力问题，健康的虾苗关系到养殖是否能够成功，民间有一句话：好的虾苗养殖已经成功了一半，所以健康的虾苗很重要，虾苗的成活率、抗病力和生长速度与虾苗的品质有很大的关系，饵料系数的高低与虾苗的品质也有很大程度上的联系。正因为这样，好多育苗场一味地提高出苗的成活率而很大程度上使用大量的违禁药品，从而导致淮海工学院二一七届本科毕业设计（论文） 第 8 页 共 25 页虾类的免疫体质受到不同程度的损伤，在育苗过程不重视幼虾生长过程所需的营养成分，因为活饵料成本比较高，所以好多育苗场为了节约成本获得更高的利润选择不投喂活饵料，这样导致在养殖后期对虾虾体容易感染病毒性疾病白斑综合症病毒(WSSV)、桃拉病毒(TSV)和传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)4 。白斑综合症病毒(WSSV)现在已经是制约我国南美白对虾养殖产业迅速发展的关键性影响之一。自 1993 年发现该病毒开始至今，全球水产研究者对它开展了大量的调查实验，但至今依然没有取得有任何突破性的进步，到现在也没有研发出任何有效可行的方案来预防白斑综合症病毒的爆发和控制该病毒的发散。第二因为养殖水质问题，工业废水、农业废水以及生活废水造成我国很多自然水体污染严重，仅仅就 2010 年中国就有 760 多亿 m3 的各种污水排流到自然水体中。被污水污染的水体通过多次的交叉污染，最后致使虾类疾病交叉互相传播，导致虾病大面积的爆发。其次，我国的饲料生产水平不及国外饲料生产水平，而且我国的饲料产品安全没有一个系统的行业标准，营养组成不科学，从而致使虾类的营养跟不上、生长速率过慢，因此很多开口饵料都是从国外进口的。1.3 益生菌1.3.1 益生菌的概念益生菌又名“ 微生物制剂”、 “活性微生物”等，主要产品有光和细菌、乳酸杆菌、枯草杆菌、双歧杆菌、假单胞菌、酵母菌、粪球菌等。其中光和细菌是我国养殖早期最常用的益生菌，在这么多年的实践与探索中，益生菌的使用已经被普遍接受，并且成为一种普遍的养殖方式存在 5。这几年来，在养殖产业上出现品种繁杂、功能多样的微生物制剂，有一些是国外引进的，还有一部分是我国自主研制的，使用效果也大同所异，在对虾养殖中使用 Epicin 来改善养殖水体环境 27，很多益生菌在净化池底有机物上也都取得了明显的效果 6，比如有机污染降解菌等等。益生菌作为外源细菌进入生物体，作用机理就好像直接吃进活的细菌，就好像投喂一些“ 好细菌” 来遏制 “坏细菌”；将水体中的氨氮等有机物质来作为益生菌的营养元，从而降低水中的氨氮浓度；养殖生产过程中一些有机污染物通过生物降解的方法来转变为二氧化碳、无机盐等无机物质；改善机体的新陈代谢，增强机体的对外界的刺激能力 7；益生菌可以抑制有害菌在肠道内的繁殖，减少毒素的产生，从而促进肠道蠕动，提高肠道机能，增强肠道对营养的吸收，可以使养殖动物快速的生长 8。水产养殖生产过程中，饵料的残留和动物的粪便在时间的催化下产生大量的有机污染物，使养殖水体的污染越来越严重，导致生态环境严重失衡 9。益生菌具有繁衍能力强、可以快速的适应生存环境、而且作用效果显著，与物理淮海工学院二一七届本科毕业设计（论文） 第 9 页 共 25 页处理、化学处理等方法相比较，益生菌无需复杂的处理过程、这样可以节约大量的劳动力和经济投入、而且没有毒性残留，所以可以在养殖水环境调控过程中广泛推广。我国的水产养殖面积和产量均位列在世界的前沿，所以应该保持健康的养殖方式，益生菌应该广泛推广使用 10。1.3.2 益生菌在水产养殖中的调水作用水产养殖规模化的迅速发展可以带来巨大的利润和效益，但也引起了一系列的问题。在规模化的养殖环境里造成了严重的水体污染。有关研究显示，在养殖过程中对饵料的不完全利用，造成大量的残饵、粪便等碳氢化合物在养殖水体中的长时间累积，在厌氧细菌的催化下产生大量的毒性物质，对养殖动物造成不可挽救的伤害 11，造成养殖水体的环境毁灭性破坏。另一方面，养殖水质问题，工业废水、农业废水以及生活废水造成我国很多自然水体污染严重。现在养殖环境的规模化，造成病毒种类的繁多复杂且传播迅速，造成养殖动物发病数增多，给养殖户带来了严重的经济损失。据相关资料显示，我国这几年养殖发生严重病害且发生病害的面积很大，占到总体养殖面积的五分之一，每年损失的产量多于 146 万吨 12。近年来全国的养殖面积不断扩大，规模化的养殖方式的大面积使用，造成水体严重的富营养化。养殖过程中对饵料的用量没有准确的用量，造成饵料的残余，再加上养殖动物的粪便、尸体的有机物共存在一个养殖环境中，因为这几天养殖规模的不断扩大和养殖年限的增加，造成水体的自我恢复能力不断下降，使得养殖水体中的一些有毒物质的含量严重超标 13，造成养殖水体的质量下降，水产病害发病频率升高，而造成这一系列问题发生的主要根源就是有机物污染、氨氮、亚硝态氮等在养殖水体中的长时间沉积。目前，国内尝试用益生菌对养殖污染的水体进行生态修复掀起了养殖领域对水处理的一片热潮，挑选培养针对净水作用和制剂生产性能优良的优势的芽孢杆菌或其他的组合是制作有效微生态净水产品的成败 11。2.材料与方法2.1 实验材料实验对虾：2017 年 4 月 3 日在连云港市赣榆区青口镇对虾养殖场购买的南美白对虾用于此次试验用的虾，大小为 300 头，体质量(1.65 005) g。将买的虾暂养在有效体积大约为 25 升的 3 升的玻璃缸中。养殖期间每天换水 1 次，换水量为 1/4-1/3，逐日投喂饲料 3 次，水的温温度保持在( 23 2) ，持续充气。益生菌：地衣芽孢杆菌 (Bacilluslicheniformis)( 菌含量不小于 1010 CFU/g，绿百多生物有限公司生产)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)( 菌含量不小于 1010 CFU/g，绿百多生物有限公司生产 )，常温保藏，用于拌料。副溶血弧菌：攻毒用副溶血弧菌，直接从实验室获得。活化菌种后使用 2216E 淮海工学院二一七届本科毕业设计（论文） 第 10 页 共 25 页（1000mlNSS 溶液中加入酵母膏 1g，蛋白胨 5g，磷酸铁 0.1g，琼脂20g，PH7.6-7.8）液体培养基来激活培养，用离心法收集培养菌体，再用 PBS 缓冲液稀释备用，用于人工感染实验。实验基础饲料：由南通巴大饲料有限公司生产的宝鼎牌南美白对虾配合饲料作为本次实验的基础饲料，饲料各指标见表 1表 1:基础饲料各项指标Tab.1: Composition of the base diet in g/100g dry diet原料 Ingredients 配比 Quota 原料 Ingredients 配比 Quota鱼粉 Fish meal 34 豆粕 Soybean meal 13花生粕 Peanut meal 9 鱿鱼膏