双水杨醛乙二胺西佛碱毕业论文

闽南师范大学毕业论文双水杨醛乙二胺西佛碱铁配合物与牛血清白蛋白相互作用模式的研究Research the interactation mode between ferrous - BIS salicylidene ethylenediamine and BSA姓 名： 学 号： 系 别： 化学与环境科学系 专 业： 应用化学 年 级： 10级 指导老师： 2014年1月10日I摘要双水杨醛乙二胺西佛碱和铁（）-双水杨醛乙二胺西佛碱配合物（配合物1）的合成，并对配合物1进行红外表征。用荧光光谱及紫外吸收光谱方法，研究该配合物1与牛白蛋白（BSA）的相互作用。研究表明配合物1对BSA猝灭作用属于静态猝灭，根据Stern-Volmer 方程, 计算了配合物1与BSA 间的结合常数Kq，用Van.t Hoff方程计算了热力学参数；乙醇和EDTA为探针以及透析法推测了配合物1-BSA复合物透析过程中生成新的物质。关键词：双水杨醛乙二胺西佛碱；亚铁离子；荧光光谱；牛血清白蛋白；EDTAAbstractThe Synthesis of BIS salicylidene ethylenediamine Schiff base and Fe() - BIS salicylidene ethylenediamine Schiff base .And the structures of Fe() - BIS salicylidene ethylenediamine Schiff base were confirmed by infrared. We reseached the interactation with the complexes and BSA by UV and molecular fluorescence analysis .The study shows that the quenching effect on BSA belongs to static quenching.We calculated the binding constant Kq of the complexes and BSA according to the Stern - Volmer equation and calculate the thermodynamic parameters with the Van. T Hoff equation.We used Ethanol and EDTA as probe to speculate the new substances from the dialysis process .Key words: BIS salicylidene ethylenediamine Schiff Base; Fe(); fluorescence spectrum;BSA;EDTA目 录中文摘要 .I英文摘要 .I前言 .11 实验部分 .11.1 仪器与试剂 .11.2 亚铁双水杨醛乙二胺西佛碱配合物（配合物 1）的合成 .11.3 配合物 1 与牛血清白蛋白(BSA)相互作用荧光测定 .21.3.1 配合物 1 与 BSA 相互作用常温荧光测定 .21.3.2 配合物 1 与 BSA 相互作用变温荧光测定 .21.3.3 配合物 1 与 BSA 相互作用同步荧光测定 .21.4 配合物 1 与 BSA 相互作用紫外测定 .21.5 EDTA 对配合物 1-BSA 复合物的相互作用的影响测定 .21.5.1 EDTA 对配合物 1-BSA 复合物的作用紫外测定 .21.5.2 双水杨醛乙二胺西佛碱与 BSA 相互作用的荧光测定 .31.5.3 EDTA 对配合物 1-BSA 复合物的作用荧光测定 .31.5.4 Fe(edta)配合物对双水杨醛乙二胺西佛碱 -BSA 复合物的作用荧光测定 .31.6 乙醇对配合物 1-BSA 复合物的作用荧光测定 .31.7 采用透析法对配合物 1-BSA 复合物的相互作用结果的测定 .32 结果与讨论 .42.1 亚铁双水杨醛乙二胺西佛碱配合物红外光谱表征 .42.2 配合物 1 与 BSA 相互作用的荧光分析 .42.2.1 配合物 1 与 BSA 相互作用常温荧光分析 .42.2.2 配合物 1 与 BSA 相互作用荧光猝灭方式分析 .52.2.3 用静态猝灭法对配合物 1 与 BSA 的相互作用进行分析 .62.2.4 配合物 1 与 BSA 之间的作用力类型分析 .82.2.5 配合物 1 与 BSA 相互作用同步荧光分析 .82.3 配合物 1 与 BSA 相互作用紫外表征 .92.4 EDTA 对配合物 1-BSA 复合物的相互作用的影响的分析 .102.4.1 EDTA 对配合物 1-BSA 复合物的相互作用的影响的荧光分析 .102.4.2 EDTA 对配合物 1-BSA 复合物的相互作用的影响的紫外分析 .102.5 乙醇对配合物 1-BSA 复合物的相互作用的影响的荧光分析 .122.6 配合物 1 与 BSA 相互作用模式图 .122.7 采用透析法对配合物 1-BSA 复合物的相互作用结果的分析 .132.7.1 配合物 1 与 BSA 作用透析后产物红外光谱表征 .132.7.2 透析法对配合物 1-BSA 复合物的相互作用结果的分析 .143 结论 .15参考文献 .16致谢 .181前言 蛋白质是生物体的重要组成部分，是生命活动的物质基础。血清白蛋白常作为一种模型蛋白质用于生物医用材料研究领域 1 , 2 ，可与许多内源及外源性化合物结合起到存储与转运作用 3 , 4 ，即在体内起着酸度保持、金属离子、氨基酸、脂肪酸、药物等的贮存、运载等重要的作用 5，是基础科学研究中最常用的药物靶蛋白之一 6 。从不同角度研究以白蛋白为代表的蛋白质与具有生物活性小分子之间的相互作用，已成为一个非常活跃的研究课题 7。牛血清白蛋白( BSA) 肽链含有 582 个氨基酸残基，在 ex = 280 nm 时，BSA 的内源荧光主要来源于 19 个酪氨酸和 2 个色氨酸残基。酪氨酸的荧光主要通过能量转移给色氨酸而发出，2 个色氨酸分别位于 134 位和 212 位，其发射峰特征、能量转移及荧光寿命等指标可以对蛋白质分子中荧光生色基团的结构及其所处的微环境提供有效的信息 8, 9。本文利用荧光光谱法和紫外吸收光谱法研究了铁（）双水杨醛乙二胺西佛碱配合物（配合物1）与牛血清白蛋白（BSA）相互作用的机理；利用透析法以及乙醇、EDTA 为探针推测配合物与BSA相互作用模式。1 实验部分1.1 仪器和试剂试剂：牛白蛋白(BSA) （生化试剂） 国药集团化学试剂有限公司水杨醛 （AR） 国药集团化学试剂有限公司乙二胺 （AR） 广东汕头市西陇化工厂六水合硫酸亚铁铵 （AR） 广东汕头市西陇化工厂EDTA （AR） 国药集团化学试剂有限公司乙醇 （AR） 西陇化工股份有限公司仪器： LS-55 荧光分光光度计 （美国 PE 公司）UV-2550 紫外分光光度计 （Shimadzu 公司）1.2 亚铁-双水杨醛乙二胺西佛碱配合物（1）的合成取乙二胺 5.6mL 和 17mL 水杨醛溶解于 50mL 甲醇中，在冷水浴中搅拌30min，静置 15min，减压抽滤，用乙醇洗涤，在常温下干燥 6h，得亮黄色固体粉末，再取 2.5g 固体用 40mL 乙醇重结晶、抽滤，在常温下干燥 4h，得黄色晶体即为双水杨醛乙二胺西佛碱。取双水杨醛乙二胺西佛碱 1.000g 溶解于40mL 甲醇中，再加入硫酸亚铁铵 1.000g，回流 1h，冷却，过滤，干燥，得淡2粉色固体即为 Fe（）双水杨醛乙二胺西佛碱配合物（配合物 1） 。1.3 配合物 1 与 BSA 相互作用荧光测定1.3.1 配合物 1 与 BSA 相互作用常温荧光测定称取0.048g 配合物1溶解并定容于100mL容量瓶中，用HAc-NaAc缓冲溶液（pH=6.8）配制溶度为110 -4mol/L的BSA 溶液，然后于一系列10.00mL的容量瓶中加入1.00mL的BSA溶液，并加入不同体积的配合物1溶液，定容。以=292nm为激发波长，记录300450nm范围的荧光光谱。1.3.2 配合物 1 与 BSA 相互作用变温荧光测定称取 0.048g 配合物 1 溶解并定容于 100mL 容量瓶中，用 HAc-NaAc 缓冲溶液（pH=6.8）配制溶度为 110-4mol/L 的 BSA 溶液，然后于一系列 10.00mL的容量瓶中加入 1.00mL 的 BSA 溶液，并加入不同体积的配合物 1 溶液，定容。将该系列溶液分别于 25,30,35 和 40下，以 =290nm为激发波长，记录300450nm 范围内的荧光光谱。1.3.3 配合物 1 与 BSA 相互作用同步荧光测定称取0.049g配合物1溶解并定容于100mL容量瓶中，用HAc-NaAc缓冲溶液（pH=7.0）配制溶度为110 -4mol/L的BSA 溶液，然后于一系列10.00mL的容量瓶中加入1.00mL的BSA溶液，并加入不同体积的配合物1溶液，定容。以=292nm为激发波长，测定 =15nm和 =60nm时的同步荧光光谱。1.4 配合物1与BSA相互作用紫外测定称取 0.024g 配合物 1 溶解并定容于 100mL 容量瓶中，用 HAc-NaAc 缓冲溶液（pH=6.9）配制溶度为 110-4mol/L 的 BSA 溶液，然后于一系列 10.00mL的容量瓶中加入 1.00mL 的配合物 1 溶液，并加入不同体积的 BSA 溶液，定容。以配合物 1 溶液为参比液，记录 200500nm 范围内的紫外吸收光谱。1.5 EDTA 对配合物 1-BSA 复合物的相互作用的影响测定1.5.1 EDTA 对配合物 1-BSA 复合物的作用紫外测定称取 0.048g 配合物 1 溶解并定容于 100mL 容量瓶中，称取 0.039gEDTA用 HAc-NaAc 缓冲溶液（ pH=6.8）溶解并定容于 100mL 容量瓶中，用 HAc-NaAc 缓冲溶液（pH=6.8）配制溶度为 110-4mol/L 的 BSA 溶液，然后于一系列 10.00mL 的容量瓶中加入 1.00mL 的 BSA 溶液和 3.00mL 配合物 1 溶液，再3加入不同体积的 EDTA 溶液，定容。以配合物 1 与 BSA 混合液为参比液，记录 200500nm 范围内的紫外吸收光谱。1.5.2 双水杨醛乙二胺西佛碱与 BSA 作用的荧光测定称取0.032g双水杨醛乙二胺西佛碱溶解并定容于100mL容量瓶中，用HAc-NaAc缓冲溶液（pH=6.8）配制溶度为110 -4mol/L的BSA溶液，然后于一系列10.00mL的容量瓶中加入1.00mL的BSA溶液，并加入不同体积的双水杨醛乙二胺西佛碱溶液，定容。以=280nm为激发波长，记录 300450nm范围的荧光光谱。1.5.3 EDTA 对配合物 1- BSA 复合物的相互作用的影响荧光测定称取 0.048g 配合物 1 溶解并定容于 100mL 容量瓶中，称取 0.039gEDTA用 HAc-NaAc 缓冲溶液（ pH=6.8）溶解并定容于 100mL 容量瓶中，用 HAc-NaAc 缓冲溶液（pH=6.8）配制溶度为 110-4mol/L 的 BSA 溶液，然后于一系列 10.00mL 的容量瓶中加入 1.00mL 的 BSA 溶液和 3.00mL 配合物 1 溶液，再加入不同体积的 EDTA 溶液，定容。以 =280nm为激发波长，记录 300450nm范围的荧光光谱。1.5.4 Fe(edta)配合物对双水杨醛乙二胺西佛碱 - BSA 复合物的作用荧光测定称取 0.032g 双水杨醛乙二胺西佛碱溶解并定容于 100mL 容量瓶中，称取0.016g 六水合硫酸亚铁铵和 0.030gEDTA 配制摩尔比为 2:1 的 Fe(edta)配合物溶液，用 HAc-NaAc 缓冲溶液（pH=6.8）配制溶度为 110-4mol/L 的 BSA 溶液，然后于一系列 10.00mL 的容量瓶中加入 1.00mL 的 BSA 溶液和 5.00mL 双水杨醛乙二胺西佛碱溶液，再加入不同体积的 Fe(edta)配合物溶液，定容。以=280nm为激发波长，记录 300450nm 范围的荧光光谱。1.6 乙醇对配合物 1-BSA 复合物的作用荧光测定称取 0.049g 配合物 1 溶解并定容于 100mL 容量瓶中，用 HAc-NaAc 缓冲溶液（pH=6.8）配制溶度为 110-4mol/L 的 BSA 溶液，然后于一系列 10.00mL的容量瓶中加入 1.00mL 的 BSA 溶液和 3.00mL 配合物 1 溶液，再加入不同体积的乙醇溶液，定容。以 =280nm为激发波长，记录 300450nm 范围的荧光光谱。1.7 采用透析法对配合物 1-BSA 复合物的相互作用影响的测定4称取 0.050g 配合物 1 和 0.10gBSA，加入 30mL 蒸馏水溶解。用透析袋透析且每隔 2 天换一次水，每次换水前取 1mL 透析袋内的原液并稀释 25 倍，以蒸馏水为参比，记录 200500nm 范围内的紫外吸收光谱。2 结果与讨论2.1 亚铁双水杨醛乙二胺西佛碱配合物红外光谱表征利用 NicoLet360 光谱仪对亚铁双水杨醛乙二胺西佛碱配合物（配合物1）进行红外光谱表征，结果如图 1 所示。10 20 30 40bav/cm-1图 1 双水杨醛乙二胺西佛碱及配合物 1 红外光谱图a：双水杨醛乙二胺西佛碱；b：配合物 1如图 1 所示，双水杨醛乙二胺西佛碱（曲线 a）及其配合物 1（曲线 b） 。对比曲线 a 和曲线 b，C-C 振动由 1498cm-1 和 1610 cm-1 移动至 1491 cm-1 和1608 cm-1，变化不明显，说明水杨醛的基本骨架未变；C-N 伸缩振动由原来的1635 cm-1 移动至 1608 cm-1，向低波数移动了 27 cm-1，说明 N 原子上的孤对电子可能与 Fe() 发生配位作用；O-H 在 25003200cm-1 出现宽而散的特征峰移动至 3350cm-1 左右，向高波数移动，说明 O 原子被 Fe()离子竞争走孤对电子。由此说明，Fe() 与双水杨醛乙二胺西佛碱作用生成新的配合物。2.2 配合物 1 与 BSA 相互作用的荧光表征2.2.1 配合物 1 与 BSA 相互作用常温荧光分析固定 BSA 的浓度为 110-4mol/L，改变配合物 1 的浓度，并以 ex292 nm5的激发波长分别激发 BSA 溶液及 BSA 与配合物 1 的混合溶液。然后分别记录波长为 300450nm 的荧光发射光谱，其荧光发射光谱的测定结果如图 2 所示。30 350 40 45005010150nmFfedcba图2 不同浓度配合物1对BSA 溶液荧光光谱的影响af：C 配合物1 /(10-4mol/L )0，1.1，3.3，5.5，7.7，9.9当激发波长为292nm时，配合物1在300450nm范围内无荧光发射，而BSA由于其本身的色氨酸残基和络氨酸残基而产生内源荧光 10。因此，固定BSA的浓度不变，依次加入不同浓度配合物1，随着配合物浓度的逐渐增加，BSA在350nm附近的荧光发射峰强度有规律的减弱，其结果如图 2所示，该特征的出现初步表明配合物1与BSA发生了一定程度的作用。2.2.2 配合物 1 与 BSA 相互作用荧光猝灭方式分析荧光猝灭是猝灭剂与荧光体激发态分子之间的相互作用的结果，猝灭过程通常有动态和静态猝灭之分，它们均遵从 Stern-Volmer 方程：F0/F=1+kq0CQ=1+ ksv CQ 式中，F 0 和 F 分别为未加入猝灭剂时 BSA 的相对荧光强度；k q 为双分子猝灭过程的速率常数； 0 为无猝灭剂存在时荧光分子的平均寿命，通常取值 10-8s11；k sv 为 Stern-Volmer 猝灭常数，是双分子猝灭速率常数与单分子衰变速率常数的比率；C Q 为猝灭剂的摩尔浓度 12, 13。而区分动态猝灭与静态猝灭的主要依据之一是：动态猝灭主要依赖于分子的扩散，增加温度导致扩散速度加快，猝灭常数将随着