沉淀反应

沉淀反应（precipitation reaction)邓念华临床免疫学教研室,可溶性抗原+相应抗体肉眼可见的沉淀,一、定义：,形成肉眼可见的大的免疫复合物。沉淀线(环)的观察以及免疫比浊法中的终点法就是测定此阶段形成的复合物,第一阶段,第二阶段,二、沉淀反应分两个阶段,抗原抗体特异性结合，快速但不可见。免疫比浊法中的速率法就是利用此阶段测定免疫复合物形成的速率。,1897年 Kraus 就发现细菌培养液（毒素）与相应抗血 清混合出现沉淀1905年 Bechhold 把抗体放在明胶中，将抗原加于其 中，发现沉淀反应可在凝胶中进行1946年 Oudin 报告了试管免疫扩散技术1965年 Mancini 提出单向免疫扩散技术，使定性免疫 试验向定量化发展1959年 Schultze建立透射比浊法1967年 Ritchie建立散射比浊法1977年 Sternberg建立速率散射比浊法 发展趋势：快速、微量、自动化。,三、发展史：,液体内沉淀试验,凝胶内沉淀试验,凝胶免疫电泳技术,沉淀反应可分三类,免疫浊度测定絮状沉淀试验,单向扩散试验双向扩散试验,对流免疫电泳火箭免疫电泳免疫固定电泳,第一节 液相内沉淀试验,一、絮状沉淀试验:(flocculation test)二、环状沉淀试验:(ring precipitation test)三、免疫浊度试验: (immunoturbidimetry),原理,一、絮状沉淀试验,( flocculation test),方法评价： 敏感度较低、简便、 易受抗原抗体比例 影响最适比,临床意义： 测定抗原抗体反应 的最适比。,康氏试验：梅毒抗体,康氏试验,康氏试验是又称非特异类脂质抗原试验,可用于梅毒筛查。原理:使用酒精浸泡牛心粉，提取磷脂部分做为抗原，加入胆固醇以增加灵敏度，与待测血清中抗体(反应素)，在电解质作用下，抗原抗体形成可见的沉淀反应。请问目前常用的梅毒筛查有哪些方法?梅毒感染的确证实验有哪些?,1:2,1:4,1:8,1:16,1:32,1:64,1:128,各管抗原倍比稀释,加入抗血清,各管抗体量不变,振摇 混匀、37孵育,沉淀量不同,出现沉淀量最多的管为最适比例管。,轻摇,絮状沉淀试验,Ag,AbAg,方阵滴定法,原理,二、环状沉淀试验,(ring precipitation test),方法评价： 敏感度较低、简便、快速、实用、只能定性不能定量、缺乏多对分辨力。,临床意义： 鉴定血迹、 诊断炭疽,Ab,Ag,沉淀管内径1.52mm阳性：15min出现沉淀环阴性：30min不出现沉淀环,三、免疫浊度试验,1.透射比浊法（transmission turbidimetry)2.免疫胶乳比浊法(immunolatex turbidimetry)3.散射比浊法（nephelometry) 速率散射比浊法(rate nephelometry) 终点散射比浊法(endpoint nephelometry),返回,海德堡进行的沉淀分析,1、在抗体浓度过量时，随着抗原浓度不断上升免疫沉淀逐渐增多（如右图）,原理：,检测器,检测器,透射测定,散射比浊,2.抗原抗体复合物，在一定光线照射下，可产生散射光及透射光，并用仪器检测这些光的强度，可反应抗原抗体复合物的量。,原理：,吸光度A=lgI0/Ik1bC复合物,Ag-Ab 复合物,1.原理：,一）透射比浊法,C复合物k2C抗原（Ab过量）,吸光度A k3C抗原,足够大（35-100nm），要形成一定浊度,稀释待检样品和标准品 （5ul)ApoB抗血清1m(过量)（132164）孵育一定时间测定吸光度(A340nm)值,标准曲线,2. 技术要点（载脂蛋白B的检测）,按log-logit转换或y=ax3+bx2+cx+d方程进行曲线拟合，制备剂量-反应曲线,4. 方法评价： 操作简单、快速、易于自动化；敏感度比单扩高10倍，但比散射比浊低（数量多而大的抗原抗体复合物才适用本方法）；反应时间长(测定的是第二反应阶段) ；抗体用量较大。,3.影响因素：注意抗原的稀释；标本应避免混浊。,代表性仪器：,全自动系列化分析仪： olympus AU560,日立7600全自动生化分析仪。 特定蛋白分析仪检测前白蛋白 、载脂蛋白A、B等。,1. 原理,入射光I0,透射光I,吸光度A=lgI0/Ik1bC复合物,C复合物k2C抗原(抗体过量),二) 免疫胶乳比浊法,2. 技术要点稀释待检样品和标准品 加抗体致敏胶乳溶液 孵育一定时间测定吸光度(A340nm)值制备剂量-反应曲线,标准曲线,3. 方法评价 ： 敏感度高（达ng/L）； 稳定、可靠，特异性好； 不需特殊仪器设备； 血清中的 RF可与IgG Fc段结合，使IgG致敏胶乳颗粒出现非特异性凝集，用F(ab)2片段代替IgG既可消除此干扰。,代表性仪器：,普通分光光度计自动生化分析仪：olympus AU560,三) 散射比浊法,II042（dn/dc) 2 Mc(1+cos ) N24,散射光强度,颗粒直径入射光波长,颗粒直径或入射光波长,散射角度尽可能大：提高灵敏度；排除大颗粒的干扰,第一阶段,第二阶段,速率散射比浊,终点散射比浊,I0入射光,IK1C复合物,散射光I,（596）,C复合物K2C抗原（Ab浓度恒定）,IK3C抗原,1.原理：抗原与过量抗体反应达到平衡时，形成复合物不再增加，并在形成絮状沉淀前，测定此时的溶液浊度。抗原抗体作用30-120min内比浊，形成较小复合物,（一）终点散射比浊法,2. 技术要点稀释待检样品和标准品 加最适工作浓度的抗体孵育测定散射光强度 I（450nm ）绘标准曲线,标准曲线,I2-I1,定时散射比浊法测定原理示意图,4.方法评价：可自动化；敏感度达ug/L水平，高于透射比浊法；但反应时间较长 (第二阶段)。,3.抗原过量检测：抗体过量：阈值限：。,代表性仪器：,Dade Behing公司： BN-100 BN-Prospec BN-特定蛋白系统。,BN ProSpec全自动特定蛋白分析仪,（二） 速率散射比浊法1.原理：是抗原抗体结合反应的动力学测定法；速率是指抗原抗体反应在单位时间内形成免疫复合物的量；连续测定各时间复合物形成的速率与其产生的散射光信号联系在一起，形成动态的速率散射比浊法，每项检测仅12min即可完成。,抗原抗体复合物形成的速率,抗原抗体反应速率的动态变化,2. 技术要点稀释待检样品和标准品 加最适工作浓度的抗体孵育立即比浊（速率单位RU）绘标准曲线,ARRAY 360：自动进行1:6、1:36、1:216和1:1296等稀释度稀释，也可以根据需要临时设定稀释度。,3. 方法评价：可自动化，快速；（在第一阶段检测、60s内完成测定）敏感度高，最小检出量达g/L水平；重复性好（CV5%)；但抗体的质量要求高，仪器和试剂较贵。,代表性仪器：,美国BECKMAN公司 ：全自动特定蛋白分析系统ARRAY360IMMAGE全自动特定蛋白分析仪,IMMAGE全自动特定蛋白分析仪,1.抗原抗体比例：抗体过量；抗原过量监测 2.抗体的质量：特异性高、亲和力好、效价高 3.增浊剂的使用：（提高反应速度）PEG6000，tween-20,（一）免疫比浊分析的影响因素,四）、免疫比浊分析的影响因素和临床应用,4.伪浊度: 标本（高血脂、反复冻融） 抗体：效价低、特异性差 PEG浓度过高 器材不清洁 5.入射光光源和波长：氦氖光源，633nm 6.标准曲线制备与质量控制,（二）临床应用,免疫球蛋白IgG、IgA、IgM、链、链、免疫球蛋白亚类；补体C3、C4；血浆蛋白：前白蛋白(PAB)、白蛋白(ALB)、1-抗胰蛋白酶(1-AT)、2-微球蛋白(2-MG)、转铁蛋白(TRF)、铜蓝蛋白(CER)、结合珠蛋白(HP)、C-反应蛋白(CRP)、载脂蛋白ApoAI、ApoB、脂蛋白(a)、类风湿因子(RF)、尿微量蛋白系列和某些治疗性药物浓度等。,原理：,将可溶性抗原与相应分别放入凝胶（如琼脂、琼脂糖等）内进行扩散，形成浓度梯度，在抗原抗体浓度比例恰当的位置，形成肉眼可见的免疫沉淀线、沉淀环。,第二节 凝胶内沉淀试验,分类：,单相琼脂扩散试验(single gel diffusion test) 双相琼脂扩散试验(double gel diffusion test）凝胶免疫电泳(gel immuno-electrophoresis),一、单相琼脂扩散试验(一) 原理,沉淀环的大小与抗原浓度呈正相关。,(二) 技术要点,T1为1624h；T2为2448h；T3为48h以上,可见T3为直线，T1为反抛物线,t1为1624h；t2为2448h；t3为48h以上,可见t1为直线，t3为反抛物线,Mancini曲线大分子抗原,Fahey曲线小分子抗原,Mancini曲线扩散48h、大分子抗原,绘制标准曲线：,(三) 影响因素1. 抗原分子量 分子量大，扩散慢，沉淀环较小；分子量小，扩散快，沉淀环相对较大。要求待检血清和抗原标准品在血清学上具有均一性，否则可能出现结果偏高或偏低。,2. 抗体种类 实验证明马抗血清为1-10IU/ml，羊为0.4-4IU/ml，兔抗血清可测抗原0.1-1IU/ml，为提高实验敏感度，应选兔抗血清。,3. 抗体稀释度 抗体浓度易小，因相应沉淀环增大，不同浓度抗原间的差别较显著，方法敏感度较高。,但沉淀环过大，常造成边缘糊不清，致使测量误差也增大。因此要求在沉淀环清晰的基础上加大稀释度以提高敏感度。,4. 扩散时间与温度 扩散时间赿长，扩散温度在4-37范围内，升高温度，反应时间缩短。注意扩散要达到终点后，其沉淀环直径才与抗原含量呈一定关系。抗原含量越高，达到一定关系所用扩散时间越长。,5.每次都要做标准曲线，并必须加测质控血清；6.双环现象（重链病）；,7.单克隆抗体测正常人多态性抗原，则抗体相对过量，结果降低；8. 多克隆抗体测定单克隆蛋白，则抗原相对过量，结果增加。,(四) 方法评价一种简便、实用的定量方法；不需特殊仪器制备；灵敏度稍差为1.25mg/L；耗时长,影响因素多（操作规范时，重复性和线性尚可依赖），目前临床中少用。,(一) 原理：,Ab,Ag,染色标本图,1.抗原抗体双向自由扩散2.24小时出结果3.呈现沉淀线或弧,二、双向琼脂扩散试验,(double gel diffusion test),(二) 操作步骤制板 1.5%琼脂、4ml每片打孔 孔径3mm，孔间距35mm加样 孵育 37、24-48h,应用,(三)双向琼脂扩散试验的应用抗原或抗体的有无及纯度；估算抗原及抗体的相对含量及相对分子量；分析抗原的性质；滴定抗体的效价。,4.抗原抗体纯度鉴定,“1” 为单一抗原抗体系统。,“n” 为多个抗原抗体系统。,*可以用混合抗原鉴定抗体纯度。,抗原抗体纯度鉴定,*可以用混合抗体鉴定抗原纯度。,1.检测未知抗原或抗体,Ag,Ab,A B C D E F,A: 浓度Ag、Ab及扩散率近似；,B：浓度Ag、Ab近似，扩散率AgAb ；,C：浓度Ag、Ab近似，扩散率AgAb ；,D：浓度AgAb，扩散率近似；,E：浓度AgAb，扩散率AgAb ；,F：浓度AgAb，扩散率AgAb ；,估计相对含量及分子量,2表示标准Ag,1表示待检Ag,待检Ag与标准抗原完全吻合；,待检Ag中含有与标准Ag相同的Ag；还有另外的Ag与Ab相对应；,待检Ag有与Ab相对应的Ag，但与标准Ag不同；,待检Ag与标准Ag性质相同；但含量较低；,抗原性质分析,1.周围6个孔放不同稀释度的相应Ab。,2.以出现沉淀线的血清最高稀释倍数为 该抗体的效价。,3.可进行任意稀释。,抗体效价滴定,三、免疫电泳技术(immunoelectrophoresis technique),特点：,1.高特异性；2.高分辨率、快速、微量。,电泳原理,pH88.6 缓冲液中,阴粒离子多,等电点pH34分子量较小,等电点pH56分子量较大,阴粒离子少,向正极电泳力小,向正极电泳力大,影响因素,1.电场强度：恒定电流24mA/cm,恒定电压210V/cm,4.电渗作用：在电场中液体相对于固体的移动。,2.溶液pH值：缓冲液偏碱性，蛋白质带负电荷,3.离子强度：高，泳动慢；低，泳动快，缓冲能力,0.05molL、pH8.6的巴比妥缓冲液,电渗作用,带负电的琼脂,静电感应,一）、对流免疫电泳(counter immunolelctrophresis,CIEP),(一) 原理 在pH8.6的琼脂凝胶中：抗体球蛋白：带少量负电荷且分子较大，因此电泳力电渗力，泳向负极，放(+)；抗原蛋白质：带较强负电荷且分子较小，因此电泳力电渗力，泳向正极，放()；电泳一定时间后，二者相向运动，形成肉眼可见的沉淀线。,示意图,I=34mA/cm、30min,+,1：Ag与Ab对应；,2：AbAg，Ag为 弱阳性,3：AgAb， Ag强阳性,4：AgAb，Ag含量较高；,（二）操作步骤,-,(三) 方法评价 简便、快速； 敏感度较双相琼脂扩散试验高810倍， 但分辨力较其低；可测出ug/ml级的蛋白质；目前已不推荐使用。,三、火箭免疫电泳（rocket immunoelectrophoresis,RIE),单向免疫扩散 + 电泳技术,原理, ,Ab,峰形高低与抗原量成正比,1.制板：56度将抗体混于凝胶中2.打孔：3.加样 4.电泳：抗原向正极泳动5.观察沉淀峰6.绘制标准曲线,+,68mm,5mm,二）操作步骤,沉淀峰高,抗原浓度,1.测定沉淀峰高度2.在标准曲线上查找 相应抗原浓度,标准曲线,标准曲线,注意事项,2.琼脂应为无电渗或电渗很小,1.电泳顶部云雾状或 圆形，应继续电泳,3.标本 多时，应将琼 脂板置于电泳槽 上，搭桥并开启 电源后加样，否则 形成宽底。,4.IgG在pH8.6的 缓冲条件下净 电荷为零，因 此需经甲醛 化处理,注意事项,（四）方法评价：,与双扩比较： 敏感 较单扩散敏感10-16倍（达ug/ml以上） ； 快速 仅需1h左右。 但敏感度仍不高, 方法繁琐, 影响因素较多。 用途 适用快速诊断检测。如乙型肝炎抗原的快速检测。,(一) 原理,观察沉淀弧,根据沉淀弧的数量、位置和形态，可分析样品中所含抗原成分及其性质。,双相免疫扩散：,区带电泳：,四、免疫电泳(immunoelectrophoresis,IEP),(二) 操作步骤,莊榮輝 (1985) 博士論文. p.81,+,-,c,c,染色脫色,1.制板、打孔、加样2.电泳 1.5-2h(4-6Vcm)3.打槽加抗血清4.孵育 37 24h5.染色脱色观察,观察结