蛋白质工程的崛起 PPT课件

1.4蛋白质工程的崛起,1,想一想：,1、要想让一种生物的性状在另一种生物中表达，在种内可以用 办法实现,杂交育种,2、要使有生殖隔离的种间生物实现基因交流,克服远缘杂交的障碍 ,可以采用 的办法实现,基因工程,3、要对现有蛋白质进行改造，制造出目前从天然蛋白质中找不到的蛋白质，可以采用的方法是 。,蛋白质工程,一、蛋白质工程崛起的缘由,蛋白质工程的崛起主要是工业生产和基础理论研究的需要,2,1、基因工程的应用（1）基因工程的实质：,将一种生物的基因转移到另一种生物体内，使后者产生本不能产生的蛋白质，进而表现出新的性状。,在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质。,（2）基因工程的不足：,3,天然蛋白质是生物在长期进化过程中形成的，它们的结构和功能符合特定物种生存的需要，却不一定完全符合人类生产和生活的需要。,2、天然蛋白质的不足,3、蛋白质工程的目的,生产符合人类生产和生活的需要的蛋白质。,4,满足人类生产和生活的需要,例如：,改造,玉米中赖氨酸含量比较低,天冬氨酸激酶（352位的苏氨酸）,二氢吡啶二羧酸合成酶（104位的天冬酰胺）,天冬氨酸激酶（异亮氨酸）,二氢吡啶二羧酸合成酶（异亮氨酸）,玉米中赖氨酸含量可提高数倍,改造,改造,5,你知道人类蛋白质组计划吗？它与蛋白质工程有什么关系？我国科学家承担了什么任务？,人类蛋白质组计划是继人类基因组计划之后，生命科学乃至自然科学领域中的一项重大的科学命题。2001年，国际人类蛋白质组组织宣告成立。之后，该组织正是提出启动两项重大国际合作行为：一项是有中国科学家牵头执行的“人类肝脏蛋白质组计划”；另一项是以美国科学家牵头执行的“人类血浆蛋白质组计划”。,6,“人类肝脏蛋白质组计划”是国际上第一个人类组织器官的蛋白质组计划，由我国贺福初院士牵头，这是中国科学家第一次领衔的重大国际科研协作计划，总部设在北京，目前有16个国家和地区的80多个实验室报名参加。它的科学目标是揭示并确认肝脏的蛋白质，为重大肝病预防、诊断、治疗和新药研发的突破提供重要的科学基础。人类蛋白质组计划的深入研究将是对蛋白质工程的有力推动和理论支持。,7,蛋白质工程就是在对蛋白质的化学、晶体学、动力学等结构与功能认识的基础上，对蛋白质人工改造与合成的产品。“后基因组时代”将是“蛋白质组学时代”，即从对基因信息的研究转向对蛋白质信息的研究，包括研究蛋白质结构、功能与应用及蛋白质相互关系和作用。,8,蛋白质工程是应怎样的需求而崛起的？,蛋白质工程的崛起主要是工业生产和基础理论研究的需要。而结构生物学对大量蛋白质分子的精确立体结构及其复杂的生物功能的分析结果，为设计改造天然蛋白质提供了蓝图。分子遗传学的以定点突变为中心的基因操作技术为蛋白质工程提供了手段。,9,干扰素是由效应T细胞产生的糖蛋白，可阻断细胞分裂间期，抑制DNA复制，从而可用于治疗疾病。但干扰素在体外很难保存。,在已研究过的几千种酶中，只有极少数可以应用于工业生产，绝大多数酶都不能应用于工业生产，这些酶虽然在自然状态下有活性，但在工业生产中没有活性或活性很低。,科学家面临新的问题,10,在已研究过的几千种酶中，只有极少数可以应用于工业生产，绝大多数酶都不能应用于工业生产，这些酶虽然在自然状态下有活性，但在工业生产中没有活性或活性很低。这是因为工业生产中每一步的反应体系中常常会有酸、碱或有机溶剂存在，反应温度较高，在这种条件下，大多数酶会很快变性失活。提高蛋白质的稳定性是工业生产中一个非常重要的课题。一般来说，提高蛋白质的稳定性包括：延长酶的半衰期，提高酶的热稳定性，延长药用蛋白的保存期，抵御由于重要氨基酸氧化引起的活性丧失等。,11,干扰素是一种抗病毒、抗肿瘤的药物。将人的干扰素的cDNA在大肠杆菌中进行表达，产生的干扰素的抗病毒活性为106 U/mg，只相当于天然产品的十分之一，虽然在大肠杆菌中合成的-干扰素量很多，但多数是以无活性的二聚体形式存在。为什么会这样？如何改变这种状况？研究发现，-干扰素蛋白质中有3个半胱氨酸（第17位、31位和141位），推测可能是有一个或几个半胱氨酸形成了不正确的二硫键。研究人员将第17位的半胱氨酸，通过基因定点突变改变成丝氨酸，结果使大肠杆菌中生产的-干扰素的抗病性活性提高到108 U/mg，并且比天然-干扰素的贮存稳定性高很多。,12,概念:蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造或制造一种新的蛋白质，以满足人类对生产和生活的需求。,前提：,途径：,目的：,了解蛋白质的结构和功能,改造基因(基因修饰或基因合成),定向改造或制造蛋白质，满足人类的生产或生活的需要,二、蛋白质工程的基本原理,13,蛋白质工程的内容主要有两方面：,根据需要设计具有特定氨基酸序列和空间结构的蛋白质而氨基酸排序由基因决定，所以还需要改造相应基因中脱氧核苷酸序列或人工合成所需要的自然界原本不存在的基因片段，用于蛋白质工程。,14,应该从对基因的操作来实现对天然蛋白质改造，主要原因如下：（1）任何一种天然蛋白质都是由基因编码的，改造了基因即对蛋白质进行了改造，而且改造过的蛋白质可以遗传下去。如果对蛋白质直接改造，即使改造成功，被改造过的蛋白质分子还是无法遗传的。（2）对基因进行改造比对蛋白质直接改造要容易操作，难度要小得多。,15,逆转录,转录,DNA,RNA,翻译,肽链,复制,复制,折叠等,具有空间结构的蛋白质,表达生物特有的功能或性状,天然蛋白质的合成过程,遵循中心法则，并需经过高级空间结构的转变,16,蛋白质三维结构,氨基酸序列多肽链,基因DNA,预期功能,分子设计,mRNA,生物功能,转录,翻译,折叠,从预期的蛋白质功能出发设计预期的蛋白质结构推测应有的氨基酸序列找到相应的脱氧核苷酸序列,蛋白质工程流程图,17,比较基因工程和蛋白质工程,2010-1-10,18,18,目的基因,预期的蛋白质功能,基因表达载体,基因,获取目的基因构建表达载体导入受体细胞目的基因的检测与表达,预期蛋白质功能设计蛋白质结构推测氨基酸序列推测核苷酸序列合成DNA 表达出蛋白质,定向改造生物的遗传特性，获得人类所需的生物类型或生物产品,定向改造或生产人类所需的蛋白质,生产自然界中已有的蛋白质,蛋白质工程是在基因工程的基础上,延伸出来的第二代基因工程。因为对现有蛋白质的改造或制造新的蛋白质，必须通过基因的修饰或基因的合成。,生产自然界没有的蛋白质,19,蛋白质工程的主要步骤通常包括：（1）从生物体中分离纯化目的蛋白；（2）测定其氨基酸序列；（3）借助核磁共振和X射线晶体衍射等手段，尽可能地了解蛋白质的二维重组和三维晶体结构;,（4）设计各种处理条件，了解蛋白质的结构变化，包括折叠与去折叠等对其活性与功能的影响；（5）设计编码该蛋白的基因改造方案，如定点突变；（6）分离、纯化新蛋白，功能检测后投入实际使用。,20,21,蛋白质的结构,蛋白质的一级结构,22,蛋白质的结构,蛋白质的二级结构,23,蛋白质的结构,胰岛素的三级结构,24,蛋白质的结构,血红蛋白质的四级结构,血红蛋白分子就是由二个由141个氨基酸残基组成的亚基和二个由146个氨基酸残基组成的亚基按特定的接触和排列组成的一个球状蛋白质分子，每个亚基中各有一个含亚铁离子的血红素辅基。,25,1、蛋白质工程的诞生是有其理论与技术条件的，它是随着分子生物学、晶体学以及计算机技术的发展而诞生的，与基因组学、蛋白质组学、生物信息学的发展等因素有关2、现状：成功的例子不多，主要是因为蛋白质发挥其功能需要依赖于正确的空间结构，而科学家目前对大多数蛋白质的空间结构了解很少。,三、蛋白质工程的进展与前景,26,异想天开,能不能根据人类需要的蛋白质的结构，设计相应的基因，导入合适的细菌中，让细菌生产人类所需要的蛋白质食品呢？,理论上讲可以，但目前还没有真正成功的例子。一些报道利用细菌生产人类需要的蛋白质往往都是自然界已经存在的蛋白质，并非完全是人工设计出来而自然不存在的蛋白质。主要原因是蛋白质的高级结构非常复杂，人类对蛋白质的高级结构和在生物体内如何行使功能知之甚少，很难设计出一个崭新而又具有生命功能作用的蛋白质，而且一个崭新的蛋白质会带来什么危害也是人们所担心的。,27,讨论：某多肽链的一段氨基酸序列是： 丙氨酸色氨酸赖氨酸甲硫氨酸苯丙氨酸（1）怎样得出决定这一段肽链的脱氧核苷酸序列？请把相应的碱基序列写出来。有多少种？（2）确定目的基因的碱基序列后，怎样才能合成或改造目的基因（DNA）？,28,GCU（或C或A或G）UGGAAA（或G）AUGUUU（或C）,mRNA序列,脱氧核苷酸序列,2.确定目的基因的碱基序列后，怎样才能合成或改造目的基因（DNA）？,确定目的基因的碱基序列后，就可以根据人类的需要改造它，通过人工合成的方法或可以通过基因的定点诱变技术来改变后从基因文库中获取。,29,蛋白质工程举例1水蛭素改造水蛭素是水蛭唾液腺分泌的凝血酶特异抑制剂，它有多种变异体，由65或66个氨基酸残基组成。水蛭素在临床上可作为抗栓药物用于治疗血栓疾病。为提高水蛭素活性，在综合各变异体结构特点的基础上提出改造水蛭素主要变异体HV2的设计方案，将47位的Asn（天冬酰胺）变成Lys（赖氨酸），使其与分子内第4或第5位Thr（苏氨酸）间形成氢键来帮助水蛭素N端肽段的正确取向，从而提高凝血效率，试管试验活性提高4倍，在动物模型上检验抗血栓形成的效果，提高20倍。,30,2生长激素改造生长激素通过对它特异受体的作用促进细胞和机体的生长发育，然而它不仅可以结合生长激素受体，还可以结合许多种不同类型细胞的催乳激素受体，引发其他生理过程。在治疗过程中为减少副作用，需使人的重组生长激素只与生长激素受体结合，尽可能减少与其他激素受体的结合。经研究发现，二者受体结合区有一部分重叠，但并不完全相同，有可能通过改造加以区别。由于人的生长激素和催乳激素受体结合需要锌离子参与作用，而它与生长激素受体结合则无需锌离子参与，于是考虑取代充当锌离子配基的氨基酸侧链，如第18和第21位His（组氨酸）和第17位Glu（谷氨酸）。实验结果与预先设想一致，但要开发作为临床用药还有大量的工作要做。,31,3胰岛素改造天然胰岛素制剂在储存中易形成二聚体和六聚体，延缓胰岛素从注射部位进入血液，从而延缓了其降血糖作用，也增加了抗原性，这是胰岛素B23-B28氨基酸残基结构所致。利用蛋白质工程技术改变这些残基，则可降低其聚合作用，使胰岛素快速起作用。该速效胰岛素已通过临床实验。,32,4治癌酶的改造 癌症的基因治疗分二个方面：药物作用于癌细胞，特异性地抑制或杀死癌细胞；药物保护正常细胞免受化学药物的侵害，可以提高化学治疗的剂量。疱疹病毒（HSV）胸腺嘧啶激酶（TK）可以催化胸腺嘧啶和其它结构类似物磷酸化而使这些碱基3-OH缺乏,从而阻断DNA的合成，杀死癌细胞。HSVTK催化能力可以通过基因突变来提高。从大量的随机突变中进行筛选出一种酶,在酶活性部位附近有6个氨基酸被替换，催化能力20倍以上。蛋白质工程的发展很快，研究工作很多，以上仅介绍了几个例子。蛋白质工程除了用于改造天然蛋白质或设计制造新的蛋白质外，其本身还是研究蛋白质结构功能的一种强有力的工具，它在解决生物理论方面所起的作用，可以和任何重大的生物研究方法相提并论。,33,生物和材料科学家正积极探索将蛋白质工程应用于微电子方面。用蛋白质工程方法制成的电子元件，具有体积小、耗电少和效率高的特点，因此有极为广阔的发展前景蛋白质工程目前的现状：成功的例子不多，主要是因为蛋白质发挥其功能需要依赖于正确的空间结构，而科学家目前对大多数蛋白质的空间结构了解很少。,34,你知道酶工程吗？绝大多数酶都是蛋白质，酶工程与蛋白质工程有什么区别？,酶工程就是指将酶所具有的生物催化作用，借助工程学的手段，应用于生产、生活、医疗诊断和环境保护等方面的一门科学技术。概括地说，酶工程是由酶制剂的生产和应用两方面组成的。酶工程的应用主要集中于食品工业、轻工业以及医药工业中。 通常所说的酶工程是用工程菌生产酶制剂，而没有经过由酶的功能来设计酶的分子结构，然后由酶的分子结构来确定相应基因的碱基序列等步骤。因此，酶工程的重点在于对已存酶的合理充分利用，而蛋白质工程的重点则在于对已存在的蛋白质分子的改造。当然，随着蛋白质工程的发展，其成果也会应用到酶工程中，使酶工程成为蛋白质工程的一部分。,35,酶工程就是指将酶所具有的生物催化作用，借助工程学的手段，应用于生产、生活、医疗诊断和环境保护等方面的一门科学技术。概括地说，酶工程是由酶制剂的生产和应用两方面组成的。酶工程的应用主要集中于食品工业、轻工业以及医药工业中。-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和葡萄糖异构酶这三个酶连续作用于淀粉，就可以代替蔗糖生产出高果糖浆；蛋白酶用于皮革脱毛胶以及洗涤剂工业；固定化酶还可以治疗先天性缺酶病或是器官缺损引起的某些功能的衰竭等。至于我们日常生活中所见到的加酶洗衣粉、嫩肉粉等，就更是酶工程最直接的体现了。,36,通常所说的酶工程是用工程菌生产酶制剂，而没有经过由酶的功能来设计酶的分子结构，然后由酶的分子结构来确定相应基因的碱基序列等步骤。因此，酶工程的重点在于对已存酶的合理充分利用，而蛋白质工程的重点则在于对已存在的蛋白质分子的改造。当然，随着蛋白质工程的发展，其成果也会应用到酶工程中，使酶工程成为蛋白质工程的一部分。,37,38,思考与探究1.蛋白质工程是应怎样的需求而崛起的？下面举一个如何通过蛋白质工程来提高重组-干扰素专一活性和稳定性的例子。干扰素是一种抗病毒、抗肿瘤的药物。将人的干扰素的cDNA在大肠杆菌中进行表达，产生的干扰素的抗病毒活性为106 U/mg，只相当于天然产品的十分之一，虽然在大肠杆菌中合成的-干扰素量很多，但多数是以无活性的二聚体形式存在。为什么会这样？如何改变这种状况？研究发现，-干扰素蛋白质中有3个半胱氨酸（第17位、31位和141位），推测可能是有一个或几个半胱氨酸形成了不正确的二硫键。研究人员将第17位的半胱氨酸，通过基因定点突变改变成丝氨酸，结果使大肠杆菌中生产的-干扰素的抗病性活性提高到108 U/mg，并且比天然-干扰素的贮存稳定性高很多。在基础理论研究方面，蛋白质工程是研究多种蛋白质的结构和功能、蛋白质折叠、蛋白质分子设计等一系列分子生物学基本问题的一种新型的、强有力的手段。通过对蛋白质工程的研究，可以深入地揭示生命现象的本质和生命活动的规律。,39,2.蛋白质工程操作程序的基本思路与基因工程有什么不同？答：基因工程是遵循中心法则，从DNAmRNA蛋白质折叠产生功能，基本上是生产出自然界已有的蛋白质。蛋白质工程是按照以下思路进行的：确定蛋白质的功能蛋白质应有的高级结构蛋白质应具备的折叠状态应有的氨基酸序列应有的碱基排列，可以创造自然界不存在的蛋白质。,40,3.你知道酶工程吗？绝大多数酶都是蛋白质，酶工程与蛋白质工程有什么区别？提示：酶工程就是指将酶所具有的生物催化作用，借助工程学的手段，应用于生产、生活、医疗诊断和环境保护等方面的一门科学技术。概括地说，酶工程是由酶制剂的生产和应用两方面组成的。酶工程的应用主要集中于食品工业、轻工业以及医药工业中。-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和葡萄糖异构酶这三个酶连续作用于淀粉，就可以代替蔗糖生产出高果糖浆；蛋白酶用于皮革脱毛胶以及洗涤剂工业；固定化酶还可以治疗先天性缺酶病或是器官缺损引起的某些功能的衰竭等。至于我们日常生活中所见到的加酶洗衣粉、嫩肉粉等，就更是酶工程最直接的体现了。通常所说的酶工程是用工程菌生产酶制剂，而没有经过由酶的功能来设计酶的分子结构，然后由酶的分子结构来确定相应基因的碱基序列等步骤。因此，酶工程的重点在于对已存酶的合理充分利用，而蛋白质工程的重点则在于对已存在的蛋白质分子的改造。当然，随着蛋白质工程的发展，其成果也会应用到酶工程中，使酶工程成为蛋白质工程的一部分。,41,1. 蛋白质工程中直接需要进行操作的对象是（）A. 氨基酸结构B. 蛋白质空间结构C. 肽链结构D. 基因结构,练习：,D,42,2. 下列关于蛋白质工程的说法错误的是（）A. 蛋白质工程能定向改造蛋白质分子的结构，使之更加符合人类的需要B. 蛋白质工程是在分子水平上对蛋白质分子直接进行操作，定向改变分子的结构C. 蛋白质工程能产生出自然界中不曾存在过的新型蛋白质分子D. 蛋白质工程与基因工程密不可分，又被称为第二代基因工程,43,2. 下列关于蛋白质工程的说法错误的是（）A. 蛋白质工程能定向改造蛋白质分子的结构，使之更加符合人类的需要B. 蛋白质工程是在分子水平上对蛋白质分子直接进行操作，定向改变分子的结构C. 蛋白质工程能产生出自然界中不曾存在过的新型蛋白质分子D. 蛋白质工程与基因工程密不可分，又被称为第二代基因工程,B,44,3. 以下关于蛋白质工程的说法正确的是（）A. 蛋白质工程以基因工程为基础B. 蛋白质工程就是酶工程的延伸C. 蛋白质工程就是用蛋白酶对蛋白质进行改造D. 蛋白质工程只能生产天然的蛋白质,45,3. 以下关于蛋白质工程的说法正确的是（）A. 蛋白质工程以基因工程为基础B. 蛋白质工程就是酶工程的延伸C. 蛋白质工程就是用蛋白酶对蛋白质进行改造D. 蛋白质工程只能生产天然的蛋白质,A,46,4. 蛋白质工程的基本流程正确的是 （）蛋白质分子结构设计DNA合成预期蛋白质功能根据氨基酸序列推出脱氧核苷酸序列A. B. C. D. ,47,4. 蛋白质工程的基本流程正确的是 （）蛋白质分子结构设计DNA合成预期蛋白质功能根据氨基酸序列推出脱氧核苷酸序列A. B. C. D. ,C,48,5. 蛋白质工程是在基因工程基础上，延伸出来的第二代基因工程，其结果产生的蛋白质是（）A. 氨基酸种类增多 B. 氨基酸种类减少C. 仍为天然存在蛋白质 D. 可合成天然不存在蛋白质,49,5. 蛋白质工程是在基因工程基础上，延伸出来的第二代基因工程，其结果产生的蛋白质是（）A. 氨基酸种类增多 B. 氨基酸种类减少C. 仍为天然存在蛋白质 D. 可合成天然不存在蛋白质,D,50,1 关于生物体内存在的天然蛋白质，下列说法不正确的是（ ）A是生物在长期进化过程中形成的B它们的结构和功能符合特定物种生存的需要C构成天然蛋白质的氨基酸目前发现的有20种D一定完全符合人类生产和生活的需要,练习检测,D,51,练习检测,2、以下关于蛋白质工程的说法正确的是A、蛋白质工程以基因工程为基础B、蛋白质工程就是酶工程的延伸C、蛋白质工程就是用蛋白酶对蛋白质进行改造D、蛋白质工程只能生产天然的蛋白质,52,3、关于蛋白质工程的进展和应用，下列说法不正确的是（ ）A科学家通过对胰岛素的改造，已使其成为速效药品B生物和材料科学家正积极探索将蛋白质工程应用于微电子方面C蛋白质工程技术已经非常成熟，目前正被大力推广应用D蛋白质工程是一项难度很大的工程，目前成功的例子不多,练习检测,C,53,4、关于基因工程和蛋白质工程的说法正确的是（ ）A都是分子水平上的操作B基因工程就是改造基因的分子结构C蛋白质工程就是改造蛋白质的分子结构D基因工程能产生自然界根本不存在的基因，蛋白质工程能产生自然界根本不存在的蛋白质,A,54,1、枯草杆菌产生的蛋白酶具有催化分解蛋白质的特性，但极易被氧化而失效。1985年，美国的