第13章 生物制品分析研讨概论

药物分析课件,第十三章 生物制品分析概论,基本要求,掌握：常用的定量分析方法中的色谱分析法。 熟悉:该类药物的质量检验的基本程序与方法。 了解：生化药物和基因工程药物定义、种类和特点。,基本内容,一、概述 二、鉴别试验 三、杂质检查 四、含量（效价）测定 练习与思考,1、生物制品药物分析有那些特点？ 2、为什么必须对生物制品进行全程质量控制？,问题,生物药物 （来源和生产方法）,生化药物生物合成药物生物制品,第一节 概述,2005年版药典分为几部？每部的收载内容？,生物药物,利用生物体、生物组织或组成生物体的各种成分，综合运用生物学、生物化学、微生物学、免疫学、物理化学和药学的原理与方法制得的一大类药物。,生物药物发展过程：,第一代：利用生物材料加工制成的含有某些天然活性物质与混合成分的粗提取物制剂：鱼肝油、胰酶及其肠溶、甲状腺粉及其制剂等。,第二代：根据生物化学和免疫学原理，应用近代生化分离纯化技术从生物体制取的具有针对性治疗作用的特异生化成分。如：尿激酶、胰岛素、人血白蛋白等。,第三代：应用生物工程技术生产的天然生理活性物质，以及通过蛋白质工程原理设计制造的具有比天然物质更高活性的类似物，或与天然物质结构不同的全新的药理活性成分。如：重组人生长激素、重组人胰岛素等。,生化药物,定义：指从动物、植物及微生物提取的，也可用生物-化学半合成或用现代生物技术制得的生命基本物质及其衍生物、降解物以及大分子的结构修饰物等，如氨基酸、多肽、蛋白质、酶、多糖、脂质、核甘酸类。,生物制品,定义 用普通的或以基因工程、细胞工程、蛋白质工程、发酵工程等生物技术获得的微生物、细胞及各种动物和人源的组织和体液等生物材料制备，用于人类疾病预防、治疗和诊断的药品。包括：细菌类疫苗、病毒类疫苗、抗毒素及免疫血清、血液制品、细胞因子、体内及体外诊断制品以及其他活性制剂 微生态制剂:双歧杆菌,生物制品的种类和特点,根据所采用的材料、制法或用途不同，可分为六类: 疫苗类药物:人用狂犬病疫苗 抗毒素及抗血清类药物:流感全病毒灭活疫苗;抗蝮蛇毒血清 血液制品:人血白蛋白 重组DNA制品 诊断制品 其他制品,由于有效结构或分子量不确定，其结构的确证很难沿用化学药物或结构已知的生化药物所常用的方法，还需要生物化学分析如：氨基酸组成、N末端氨基酸序列、肽图等。,大部分生物制品的活性组分均为大分子的生命物质（如蛋白质、多肽、核酸、多糖类等）。组分相同，但相对分子量不同而产生不同的生理活性，因此常需进行相对分子量的测定。,（二）生物制品的特点,分子量不是定值。,生化法结构确证。,需检查生物活性。,生物制品对热、酸、碱、重金属及pH等变化敏感，各种理化因素的变化易对生物活性产生影响。特别是多肽和蛋白质。除理化分析，还需生物检定，防止蛋白质失活。,要求安全性检查。,生物制品组分复杂，有效成分浓度很低，生物大分子杂质含量比较高，生产工艺复杂，易引入特殊杂质和污染物。如重组乙型肝炎疫苗涉及的安全性检查包括：细胞外源因子检查、原液、半成品、成品中有关血清白蛋白残留量、CHO细胞DNA残留量检查、热原检查、过敏试验、异常毒性检查等。,需做效价测定。,对于生物制品有效成分的检测，除应有一般化学方法或理化分析进行有效成分含量测定外，更应根据产品的特异生理效应或专一化反应拟定其专属性的生物效价测定方法，以表征其所含生物活性成分的含量。 例：人凝血酶原复合物的效价测定。,三、生物制品的全程质量控制,生物制品化学性质与生物学性质都很不稳定，又易受微生物污染，故对生物制品的均一性、有效性、安全性和稳定性等应有严格要求，以生产出具有药理活性高、针对性强、毒性低、副作用小，疗效可靠及营养价值高等特点的安全、高效的生物制品。为此，必须进行原材料、生产过程和最终产品的全程质量控制，以确保产品符合质量标准要求。,生物制品及检定规程草案（1952年）,生物制品制造检定规程（1959年）,中国生物制品规程（2000年）,中华人民共和国药典三部（2005年）,收载生物制品101种,生物制品 品名 定义、组成及用途 基本要求 制造 检定（原液、半成品、成品） 保存运输及有效期 使用说明（仅预防类含此项）,化学药品 品名 化学结构、分子式 性状 鉴别 检查 含量测定,药典三部各论内容,药典二部各论内容,生物制品质量控制重点,有效成分的同一性、结构确证 有效成分的均一性、纯度检查 有害物质及残余杂质等的控制 高效、灵敏的生物活性及比活性等实验方法,生物制品质量控制基本方法： 鉴别试验 杂质检查 安全性检查 含量测定（生物活性或效价）,第二节 鉴别试验,依据生物制品的化学结构、理化性质和生物学特点，利用化学法、物理法及生物学方法进行某些特殊反应，或测定某些专属的理化常数如紫外吸收系数、等电点、电泳迁移率、色谱保留时间和肽图等，判断与确证产品的真伪。（一组实验）,一、理化鉴别法,1、化学鉴别法利用药物与某试剂在一定条件下反应，生成有颜色的产物或沉淀进行鉴别。如胰岛素的沉淀反应。 2、紫外分光光度法蛋白质生物制品主要由芳香族氨基酸侧链如酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸产生紫外吸收。如重组人促红素最大吸收279nm。 3、高效液相色谱法 （主峰保留时间和肽图的一致性）例如 重组人粒细胞集落刺激因子的肽图分析,二、生化鉴别法,1、酶法利用酶对底物特异性的催化活力，做为酶类生物制品简便、快速鉴别方法。 如尿激酶的鉴别,2、电泳法等电点聚焦电泳、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳等。可用于蛋白质类生物制品的鉴别。,三、 生物鉴别法,（一）血清学法-体外抗原抗体试验 抗原抗体类生物制品的鉴别抗原抗体在体外结合时，可因抗原物理性状不同或参与反应的成分不同而出现各种类型的反应，如凝集反应、沉淀反应、中和反应和补体结合反应，即经典血清学反应，在此基础上，又衍生出免疫扩散、免疫电泳、荧光标记、酶标记等高度敏感的检测技术。,（二）生物学法,利用生物体对生物制品特定的生物活性的反应为基础进行供试品的鉴别。 例如: 小鼠惊厥试验鉴别胰岛素肝素延长血凝鉴别肝素,第三节 杂质检查,可用来判断药品的优劣。由于生物制品来自生物体，生物活性特异性强，制造与纯化工艺复杂，分子结构常常不确定，有时产品并非单一，极微量杂质可能产生显著的效应，因此，其杂质检查显得尤为重要。 主要包括： 一般杂质检查 特殊杂质检查 安全性检查,一般杂质检查氯化物、硫酸盐、磷酸盐、铵盐、铁盐、重金属、酸度、溶液的澄清度、溶液的颜色、水份及干燥失重、炽烧残渣等。,一、特殊杂质检查,从原料中带入或生产工艺中或贮藏过程中引入的杂质根据生物制品的生产工艺特点与产品的稳定性，其特殊杂质分为： 生物污染物：微生物污染、宿主细胞蛋白、外源性DNA、培养基成分等 产品相关杂质：二聚体和多聚体、脱氨或氧化产物、突变物、裂解产物等 工艺添加剂：残余抗生素、蛋白分离剂聚乙二醇、乙醇、佐剂氢氧化铝，产品稳定剂如辛酸钠、肝素，防腐剂苯酚、硫柳汞，细菌与病毒灭活剂甲醛、戊二醛等。,（一）宿主细胞蛋白残留量测定,生物制品生产用细胞、工程菌相关的特殊杂质。 目的：控制异源蛋白含量以防超量后引起机体免疫反应 测定法：酶联免疫吸附剂测定法ELISA,（二）外源性DNA残留量的检查,测定方法： 分子杂交技术 基于DNA结合蛋白分析系统 实时定量PCR方法,（三）产品相关杂质检查,生物制品在生产制造、分离纯化和贮藏保存过程中产生的与产品结构类似的同系物、异构体、突变物、氧化物、聚合体或降解物。 常用HPLC法和电泳法。 如重组人生长激素中相关蛋白质的测定总相关蛋白质含量不超过10%。,（四）残余抗生素的检查,如果生物制品在生产过程中使用了抗生素，则不仅要在纯化工艺中除去，而且要在原液检定中增加残余抗生素活性的检测方法。 常用方法：抑菌圈测量。 结果判定：对照溶液有抑菌圈，阴性对照无抑菌圈，供试品溶液抑菌圈的直径小于对照溶液抑菌圈的直径时判断为阴性；否则为阳性。,二、安全性检查,（一）热原检查法和细菌内毒素检查 法 （二）异常毒性检查 （三）过敏试验检查异性蛋白 （四）降压试验检查组胺、类组胺或其他导致血压下降的物质 （五）无菌试验 检查药品及敷料是否有活菌的一种方法,含量测定,HPLC SDS-PAGE,效价测定,第四节：含量（效价）测定,常用的定量分析方法及应用,理化分析法 生化分析法 生物检定法,理化分析法,化学分析方法 电化学分析法 光谱分析法 色谱分析法,重量法 容量分析法,比色法,利用样品与显色剂发生现色反应，根据反应产物的颜色强度来测定含量。Elson-Morgan,硫酸软骨素的比色法测定：在酸性条件下使样品水解成氨基己糖，再在碱性条件下与乙酰丙酮和二甲氨基苯甲醛反应生成红色的产物，该产物在525 nm处有最大吸收。,光谱分析方法,具体试验操作： 1、制备对照品溶液盐酸氨基葡萄糖 2、制备供试品溶液硫酸软骨素 3、反应和测定缩合反应和比色测定,A平为供试品溶液的吸收度 As平为对照品溶液的吸收度 Ws为对照品溶液的浓度（mg/ml） W为称样量（mg） 0.8309为校正因子 500为稀释倍数,以氨基葡萄糖计24.0,高效液相色谱法,反相高效液相色谱法 RP-HPLC Reversed-phase high-performance liquid chromatography 高效离子交换色谱法 HPIEC High-performance Ion-exchange chromatography 高效凝胶过滤色谱法 HPGFC High-performance Gel-filter chromatography,反相高效液相色谱法,基本原理：利用ODS或C18等极性较小的键合硅胶为填料，以极性较大的methanol-water、CH3CN-H2O为流动相，根据样品在固定相和流动相中的不同保留行为而实现高效分离的一种方法。,可以应用UV、DAD、FD、ELSD、ECD、MS等作为检测器，分离化合物范围广泛。,生白能（重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子）的RP-HPLC测定,色谱条件 色谱柱：TSK ODS-120T(1504.6 mm, I.D.,5m) 流动相:（A）0.1的三氟乙酸,（B）乙腈1三氟乙酸（90：10），梯度洗脱 检测波长：214 nm 柱温：室温 流速：1.0 ml/min,重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子（GM-CSF),添加剂(人血白蛋白）,生白能的HPLC图,高效凝胶过滤色谱法,根据生物药物的分子量及其极性来对成分进行分离测定，主要用于生化药物的分离和分子量的测定研究。分离产物可以回收、可以用少量表面活性剂来改善分离效果、可根据化合物的形状和分子量大小来预测出峰顺序。具有简便、快速、重现性好、样品用量少等优点。,HPGFC法测定重组人肿瘤坏死因子（rh-TNF）衍生物的分子量,色谱条件 色谱柱：Beckman SEC 3000 (3007.5 mm) 流动相:0.1mmol/lKH2PO4:0.1mmol/lNa2SO4(1:1) 检测波长：280 nm 柱温：室温 流速：1.0 ml/min,Standards: 醛缩酶-2、血清白蛋白-3、碳酸肝酶-4、抑蛋白酶肽-5 Inter standard（IS）:右旋糖酐蓝-1、酪氨酸-6,二、生化分析法,（一）酶法,酶法 酶活力测定法以酶为分析对象酶分析法以酶为分析工具或分析试剂酶活力测定法酶催化一定化学反应的能力。测定一个被酶所催化的化学反应速度。酶反应速度以单位时间底物的减少或产物的增加来表示。,酶活力,酶促反应的影响因素,（1）底物浓度的影响：选择Km小的作底物 （2）pH的影响 （3）温度的影响：温度控制在0.1度 （4）辅助因子的影响 （5）空白和对照试验空白：杂质反应和自发反应引起的变化量对照实验：用纯酶或标准酶制剂测定。用 于比较或测定的标准。,酶法测定方法,（1）取样测定法停止酶反应的方法：添加变性剂加热使酶失效 （2）连续测定法,检测方法,1、UV-VIS根据产物和底物特征吸收 差别 2、荧光 3、旋光法 4、酶偶联测定法 例如：ELASA 5、其他：电化学法、离子选择电极测定等,酶分析法,以酶为分析工具的方法。分析的对象可以是酶的底物、辅酶活化剂或酶抑制剂。影响因素：酶和作用物的浓度、反应时间、温度和pH,（二）电泳法,生物制品药物分析的重要手段。在电解质溶液中，带电粒子或离子在电场作用下，以不同的速度向其所带电荷相反方向迁移。1、自由界面电泳 2、区带电泳:纸电泳、醋酸纤维素薄膜电泳、PAGE、SDS-PAGE。 3、HPCE：CZE、MECC、CGE、CIEF,电泳原理,电泳分类,常用电泳法的类型和应用,1、纸电泳法：（1）操作方法；（2）定量方法：同纸色谱（3）应用：蛋白质、核苷酸类,2、醋酸纤维素薄膜电泳,应用：血清蛋白、脂蛋白等的分离测定 3、PAGE法聚丙烯酰胺凝胶，分离效果取决于分子所带电荷与分子大小的比例及分子筛效应。4、SDS-PAGE法测定酶和蛋白等大分子物质分子量，蛋白分子相对迁移率的大小完全取决于分子量的高低，从