DB 37T 3127—2018 禽波氏杆菌凝集试验和间接ELISA抗体检测技术规范

ICS 11.220B 41DB 37山 东 省 地 方 标 准DB37/T 31272018禽波氏杆菌凝集试验和间接 ELISA 抗体检测技术规范Technical Guideline of Agglutination Test and Indirect ELISA for Antibody Detection of Bordetella avium2018-02-02 发布 2018-03-02 实施山 东 省 质 量 技 术 监 督 局   发 布DB37/T 31272018I前 言本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出。本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。本标准主要起草单位：山东农业大学、山东省动物疫病预防与控制中心。本标准主要起草人：朱瑞良、魏凯、胡莉萍、黄河、杨萍萍、柳洪洁、刘红红、王敏。DB37/T 312720181禽波氏杆菌凝集试验和间接 ELISA 抗体检测技术规范1 范围本规范规定了禽波氏杆菌凝集试验和间接ELISA抗体检测技术的术语和定义、试剂或材料、仪器设备，利用平板凝集试验、试管凝集试验和间接酶联免疫吸附实验（iELISA）检测禽波氏杆菌抗体的方法和技术要求。本规范适用于禽场禽波氏杆菌的流行病学调查、诊断和疫情监测。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 603 化学试剂 试验方法中所用制剂及制品的制备GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法GB 14925 实验动物 环境及设施3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1 禽波氏杆菌 Bordetella avium, B. avium是波氏杆菌属（The genus Bordetella）四个种中的一个新种，1984年由Kersters确认。3.2 试管凝集试验 tube agglutination test常用已知已定量的抗原与一系列稀释的禽的血清混合，在保温放置后观察结果，以判定受检血清有无相应抗体及其效价。多用于半定量和定量试验。3.3 间接酶联免疫吸附实验 indirect enzyme-linked immunosorbent assay, iELISAELISA是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行的技术。iELISA是基于ELISA反应原理设计的，包被抗原后加入待测抗体，反应后洗板，加入酶标二抗，反应后再洗板，加入底物显色。4 试剂或材料4.1 禽波氏杆菌标准株DB37/T 312720182禽波氏杆菌P5株，购自中国兽医药品监察所。4.2 禽波氏杆菌阳性血清SPF鸡经免疫禽波氏杆菌抗原三次后获得的血清，每次免疫间隔两周。4.3 阴性血清从SPF鸡分离的血清。4.4 待检禽血清采集禽的血液，于37 温箱中静置2 h，收集析出的血清。4.5 生化试剂灭菌0.5 %石炭酸生理盐水、PBS、PBST、Tris-HCl、牛血清白蛋白（BSA）、底物反应液（具体配制方法见附录A）。5 仪器设备5.1 平板（玻板、白瓷板或载玻片）。5.2 微量移液器：量程为 20 L100 L。5.3 接种环。5.4 试管架。5.5 小试管（口径 8 mm10 mm）。5.6 灭菌吸管（1 mL）。5.7 恒温培养箱。5.8 匀速振荡器。5.9 96 孔 ELISA 酶标板。5.10 酶标仪（波长范围 340 nm850 nm）。6 禽波氏杆菌抗体检测平板凝集试验6.1 用 20 L 微量移液器分别吸取三滴禽波氏杆菌 P5 株标准抗原于平板上。6.2 再分别取禽波氏杆菌阳性抗体、阴性血清和待检禽血清各一滴加入上述抗原液中，并用接种环混合均匀，3 min5 min 观察结果。6.3 平板凝集试验可参考图 1：DB37/T 312720183图 1 平板凝集试验图示6.4 结果判定：6.4.1 阳性血清与阳性抗原作用后出现明显凝集颗粒，阴性血清与阳性抗原作用后仍均匀混浊，试验结果有效。6.4.2 待检禽血清与阳性抗原作用后出现明显凝集颗粒，则判为阳性。6.4.3 待检禽血清与阳性抗原作用后均匀混浊，则判为阴性。6.4.4 待检禽血清与阳性抗原作用后介于阴阳性之间，判为可疑。7 禽波氏杆菌抗体检测试管凝集试验7.1 被检禽血清稀释度设定通常情况下，用1:25、1:50、1:100、1:200四个稀释度；大规模检疫时，可只用前两个稀释度。7.2 血清的稀释及抗原的加入7.2.1 血清的稀释7.2.1.1 为每份血清准备小试管 5 支，第一管加入 2.3 mL 石炭酸生理盐水，第二管不加，第三、四、五管各加入 0.5 mL 石炭酸生理盐水。7.2.1.2 用 1 mL 吸管吸取被检血清 0.2 mL，加入第一管中，并混合均匀，然后用吸管吸取混合液0.5 mL，加入到第二管中，混合均匀，再吸取混合液 0.5 mL 加入到第三管，同样混匀，从中吸取 0.5 mL 加入第四管混匀，再从第四管吸取 0.5 mL 加入第五管，第五管混匀后弃去 0.5 mL。这样稀释之后，从第二管到第五管，血清稀释度分别为 1:12.5、1:25、1:50、1:100。7.2.2 加入抗原先用含0.5 %石炭酸生理盐水，将抗原原液作20倍稀释，然后从第二管起每管加入抗原稀释液0.5 mL（第一管不加，作血清蛋白凝固对照），振荡均匀。加入抗原后，第二至第五管各管混合液的容积均为1 mL，血清稀释度依次变为1:25、1:50、1:100、1:200。7.2.3 对照管的制作每次试验均须作阳性血清（Ab +）对照、阴性血清（Ab -）对照、抗原（Ag +）对照。试管凝集试验操作过程可参考表1：表 1 试管凝集试验方法试 管 号 1  2  3   4  5   6   7    8血清终稀释度 1:12.5 1:25  1:50  1:100  1:200  Ag+ 对照 Ab+对照 Ab- 对照0.5%石炭酸生理盐水待检血清2.3      0.5   0.5   0.5    0.5       0.2   0.5   0.5   0.5   0.5       0.5(Ab+)  0.5(Ab-)舍去 0.5阳性抗原（1:20） 0.5   0.5   0.5   0.5   0.5    0.5    0.5    0.5DB37/T 3127201847.2.4 凝集反应全部试管于匀速振荡器充分振荡后置于37 38 温箱中22 h24 h，然后检查并记录结果。7.3 结果判定7.3.1 判定依据根据各管中上清液的透明度、抗原被凝集的程度及凝集块的形状，来判定凝集反应的程度。7.3.2 凝集程度判定标准100 %抗原凝集（+）：抗原全部凝集，呈伞状沉于管底，上清液完全清亮透明；75 %抗原凝集（+）：约有3/4的抗原被凝集，管底凝集物与+相同，只是上清液稍混浊；50 %抗原凝集（+）：约1/2的抗原被凝集，管底有中等量的凝集物，上清液混浊半透明；25 %抗原凝集（+）：约1/4的抗原被凝集，管底有少量凝集物，上清液完全混浊不透明；0 %抗原凝集（-）：抗原完全未凝集，上清液完全混浊不透明，但由于菌体抗原自然下沉，在管底中央出现规则的菌体自沉圆点。试管底部凝集程度判定可参考图2： 图 2 试管底部凝集现象图示7.3.3 凝集价判定能使50 %抗原凝集的血清最高稀释度称为该血清凝集价（或称滴度）。7.3.4 待检血清样本结果判定标准血清凝集价大于或等于1:50，判为阳性；血清凝集价为1:25，判为疑似反应。疑似反应者，3周后须重新采血，再次进行试验，如果仍为疑似反应时，可判为阳性。8 禽波氏杆菌间接酶联免疫吸附实验（iELISA）抗体检测方法8.1 禽波氏杆菌外膜蛋白（OMP）的提取8.1.1 将保存的禽波氏杆菌株接种于 200 mL 肉汤培养基中，37 振荡培养过夜后，离心收集过夜培养的细菌。8.1.2 用 10 倍体积的含有 10 mM MgCl2的 Tris-HCl（100 mM pH7.8）缓冲液悬浮，超声波破碎（功率为 500 W、破碎时间 60 s、间隙 60 s、反复破碎 10 次）。8.1.3 通过 1000g 低速离心去除细胞核，上清液高速离心，10000g，20 min。8.1.4 含全膜蛋白的沉淀，用同体积的含 2 % Triton X-100 的 Tris-MgCl2缓冲液溶解，室温下孵育30 min 降解内膜蛋白后，再进行 100000g，30 min 超速离心。8.1.5 沉淀用缓冲液再悬浮，置-20 保存备用。DB37/T 3127201858.2 禽波氏杆菌外膜蛋白（OMP）抗血清的制备8.2.1 将提取的禽波氏杆菌 OMP 蛋白液与弗氏不完全佐剂混合（V:V=1:1），用漩涡振荡器乳化，制备禽波氏杆菌 OMP 免疫用抗原。.8.2.2 选取体重 1 kg 以上的健康鸡 4 只，肌肉注射免疫 OMP 抗原，共免疫 4 次，每次间隔 1 周，OMP免疫剂量为 320 g/只/次。实验鸡的饲养符合 GB 14925 的要求。8.2.3 最后 1 次免疫后 7 d 采血，用上述试管凝集试验检测血清中鸡抗禽波氏杆菌抗体的凝集价，凝集价高于 1:256 以上时采血，分离血清，-20 保存备用。8.3 阴性血清制备采集SPF鸡的血液，制备阴性血清。8.4 间接酶联免疫吸附实验（iELISA）检测方法8.4.1 包被将禽波氏杆菌OMP用包被液（0.05 mol/L碳酸盐缓冲液，pH9.6）稀释成10 g/mL，包被酶标板。8.4.2 封闭用PBST洗涤酶标板5次。每孔加入封闭液（含1 BSA的PBS）200 L，置湿盒内，4 封闭过夜。8.4.3 加一抗用PBST洗涤酶标板5次。取1孔加入1:10倍稀释鸡抗禽波氏杆菌高免血清（作阳性对照），取1孔加入1:10倍稀释的鸡阴性血清（作阴性对照）；其它孔加1:10稀释的待检血清，置湿盒内37 作用60 min。抗体稀释液为1 BSA的PBS。8.4.4 加二抗用PBST洗涤酶标板5次。加入1:5000稀释的HRP标记的羊抗鸡IgG（抗体稀释液为1 BSA的PBS），置湿盒内37 作用45 min。8.4.5 底物显色用PBST洗涤酶标板5次。加底物反应液，置湿盒内37避光显色20 min。8.4.6 读数用2 mol/L的H 2SO4溶液终止反应，用酶标仪检测反应孔的OD 490值。8.4.7 结果判定以待测孔的OD值大于或等于阴性对照孔的2倍者，即P/N大于或等于2判为阳性，重复3次计算平均值。DB37/T 312720186A A附 录 A（资料性附录）溶液的配置A.1 试管凝集试验中灭菌 0.5%石炭酸生理盐水的配制称取9 g氯化钠（NaCl）溶于水，定容到1 L，再加入5 mL苯酚。配制后高压灭菌器灭菌后使用。A.2 禽波氏杆菌间接酶联免疫吸附实验中相关试剂的配制A.2.1 磷酸盐缓冲液（PBS）的配制1 mol/L PBS（pH 7.2）的配方：氯化钠（NaCl）     8.0 g氯化钾（KCL）      0.2 g磷酸氢二钠（Na 2HPO4）  1.44 g磷酸二氢钾（KH 2PO4）   0.24 g双蒸水（H 2O）       定容至1000 mLA.2.2 PBST缓冲液的配制1 L PBS + 1 mL Tween-20A.2.3 牛血清白蛋白（BSA）将100 mg的牛血清白蛋白加入9.5 mL水中（须将蛋白加入水中，而不是将水加入蛋白中），盖好盖后，轻轻摇动，直至牛血清白蛋白完全溶解为止。加水定容到10 mL，然后分装成小份，贮存于-20 。A.2.4 Tris-Hcl缓冲液的配制Tris 碱         121.1 g浓盐酸（1mol/L HC