第五章 目的基因的获取、扩增与检测及相关技术-之1获取-基因组文库-修改2简洁

第五章 目的基因的获取、扩增与检测及相关技术 1、物理化学方法 2、鸟枪法 3、化学合成法 4、 基因文库 5、逆转录合成 6、 PCR技术 7、 凝胶电泳 8、酵母双杂交系统 9、 杂交技术 10、 生物芯片 11、 DNA测序基因的获得基因的扩增基因的检测第一节 目的基因的获取及相关技术 一、物理化学方法 二、鸟枪法 三、化学合成法 四、凝胶电泳 五、 PCR技术 六、基因文库（基因组文库、 cDNA文库） 七、逆转录合成 八、酵母双杂交系统六、基因文库 1、基因文库的基本概念 2、基因文库的构建过程 3、基因文库中目的基因的筛选 1、基因文库的基本概念 是含有某种生物体全部基因的随机片断的重组 DNA克隆群体。 根据构建方法的不同，基因文库分为： （ 1）基因组文库 （含有全部基因） （ 2） cDNA文库 （含有全部蛋白质编码的结构基因） complementary DNA（互补 DNA）基因组文库的构建基因组文库的构建限制性内切酶限制性内切酶基因组基因组 DNA基因重组基因重组转化细菌转化细菌体外包装体外包装克隆数的确定（基因文库的容量）任一 DNA序列在文库中出现的概率：N:该序列需要克隆的总数；p:任一基因被克隆（或存在于基因文库中）的概率 ，一般为99；I： 待克隆 DNA片段的长度，假定为 17kb;G: 基因组 DNA的总长度，如人类为 3109bp 将数据代入上式= 8.1105N的含义是克隆大小为 17kb的人类 DNA时，所构建的基因文库数必须在 8.110 5以上时，才能以 99的概率得到此克隆。 2、基因文库的构建过程 （ 1）基因组文库的构建 （ 2） cDNA文库 的构建 （ 1）基因组文库的构建 构建基因 组 文库时先提纯生物的总 DNA， 通过机械剪切或酶切使其成为一定大小的片段，连接到适当载体 (常为 噬菌体 )上，经体外包装转染细菌，得到一群含不同 DNA片段的重组噬菌体颗粒。此即是基因文库 。这群 DNA片段含盖基因组全部基因。基因组文库的构建基因组文库的构建限制性内切酶限制性内切酶基因组基因组 DNA基因重组基因重组转化细菌转化细菌体外包装体外包装噬菌体为载体的基因文库的构建 基因组文库的 构建过程 生物基因组 DNA的提取和片段化 载体的选择和制备 DNA片段和载体的连接 重组体转化宿主细胞 初库的扩增 生物基因组 DNA的提取和片段化 用限制酶片段化 ： 1 3kb， 10 30kb 随机片段化：超声波（ 300bp ）、 高速搅拌 （ 8kb ） 载体的选择和制备 -DNA 几种载体的装载量如下： 质粒 柯斯质粒 15 kb 25 kb 45 kb BAC 300 kb YAC 400 kb 2000kb用于基因文库构建的受体则根据载体使用大肠杆菌或酵母菌 DNA片段和载体的连接 重组体转化宿主细胞用于基因文库构建的受体则根据载体使用 大肠杆菌或 酵母菌 初库的扩增柯斯质粒 (cosmid)载体 基础：包含 噬菌体 cos位点的质粒； 导入宿主：经体外包装，再转染宿主细胞； 供体 DNA大小： 30-45kb。插入大小范围被有效形成噬菌斑的野生型基因组 75-105所限制。 主要应用：基因组文库构建。酵母人工染色体 (yeast artificial chromsomes, YAC) 基础：酿酒酵母中心粒、端粒和 ARS 导入宿主：转化酵母原生质体 供体 DNA大小： 2000kb 主要应用：大基因组分析 （ 2） cDNA文库 的构建 cDNA文库是通过反转录 mRNA， 并制备双链 cDNA(double stranded cDNA)来构建的。克隆的重组 cDNA的总和，通常是在细菌或酵母中。这些克隆代表从某个特定物种或器官的所有 mRNA制备得到的 cDNA。cDNA文库的的构建文库的的构建 ：基因重组基因重组反转录酶反转录酶mRNAcDNA （ 2） cDNA文库 的构建 总 RNA