内源性活性物质ppt课件

体内药物分析内源性活性物质的分析内源性活性物质1、定义内源性生物活性物质是指人类和哺乳动物体内天然存在的具有生理功能和生物学活性的物质，它们可以是小分子化学物质 ，也可能是 糖类 、 生物活性 肽类 、核苷和核酸、生长因子、内源性调节因子、细胞因子 和蛋白质 等 。2、研究意义许多重大的突破都是由于发现了体内那些具有重要生理活性的物质，并发现调节这些物质的其它相关物质。基因克隆使 “ 受体一指导 ” 和 “ 酶一指导 ” 的新药的发现在方法学上得到完善。 D NA 重组和转基因技术的发展已使蛋白质和肽类药物的生产及其它内源性分子作为新药成为可能。蛋白质类内源性活性物质的分析Western BlotWestern Blot中文一般称为蛋白质印迹。它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况的信息。荧光探针定义： 与 蛋白质、核酸 (DNA或 RNA)或其他大分子 结构非共价相互作用而使一种或几种荧光性质发生改变的小分子物质。可用于研究大分子物质的性质和行为。荧光探针荧光探针除应用于核酸和蛋白质的定量分析外，在核酸染色、 DNA电泳、核酸分子杂交、定量 PCR技术以及 DNA测序上都有着广泛的应用。可以分为荧光素类探针、 无机离子荧光探针 、荧光量子点、分子信标几类与 G蛋白偶联受体相关的内源性活性物质对心肌细胞功能和形态的影响免疫组织化学 法免疫组织化学又称免疫 细胞化学 ，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜 (包括荧光显微镜、电子显微镜 )的显像和放大作用， 在细胞、亚细胞水平 检测各种抗原物质 (如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等 )。 免疫化 学 技术近年来得到迅速发展。 50年代还仅限于免疫荧光 技术， 50年代以后逐渐发展建立起高度敏感，且更为实用的免疫酶技术。免疫组织化学染色法免疫组织化学染色法是 指在抗体上结合萤光或可呈色的化学物质 ， 利用免疫学原理中抗原和抗体间专一性的结合反应 ，检测 细胞或组织 中是否有目标抗原的存在，此方式不只可以用来测知抗原的表现量也可观察抗原所表现的位置。只要是能够让抗体结合的物质，也就是具有抗原性的物质包括蛋白质、核酸、多糖、病原体等都可侦测。 免疫组织化学染色法免疫组织化学的优势在于专一性、灵敏度、简便快速以及成本低廉，所以广为医院采用， 通常是借由特定的肿瘤标记来筛选癌症。免疫组织化学染色法对基础研究及预防和诊疗上都是相当重要的一个方法。发光免疫测定luminescence immunoassay;LIA;luminescent immunoassay 将发光系统与免疫反应相结合，用于检测抗原或抗体的技术。 以发光物质标记抗原或抗体，免疫反应后引发发光反应，根据发光强度对抗体或抗原进行的测定。 层析 chromatography 基于不同物质在流动相和固定相之间的分配系数不同而将混合组分分离的技术。当流动相 (液体或气体 )流经固定相 (多孔的固体或覆盖在固体支持物上的液体 )时，各组分沿固定相移动的速度不同而分离。能用于微量样品的分析和大量样品的纯化制备。 层析是应用蛋白质的等电点不同而分析分离蛋白质的。双向凝胶电 泳（ 2D胶电泳）的 基本原理先将蛋白质根据其等电点在 pH 梯度胶内进行等电聚焦，然后按照它们的相对分子质量大小进行 SDS-PAGE 第二次电泳分离。第一向进行等电聚焦 (isoelectric focusing, IEF)，由于蛋白质具有两性解离和等电点特性 ， 将蛋白质样品加载至 pH梯度介质上进行电泳时，会向与其所带电荷相反的电极方向移动 。 移动过程中 ， 蛋白分子可能获得或失去质子 ， 并随着移动的进行，该蛋白所带的电荷数和迁移速度下降。当蛋白迁移至其等电点 pH 位置时，其净电荷数为零，在电场中不再移动。当蛋白扩散到低于其等电点 pH 区域时，带正电荷，在电场的影响下重新向阴极移动 。 同样 ， 如果蛋白质扩散到高于其等电点的 pH 区域时，则带负电，在电场的作用下会向阳极移动。根据各自不同的等电点，蛋白质最终被聚焦在一个很窄的 pH 梯度介质区域内。目前常使用预制胶条 (IPG, immobilized pH gradient) 用于蛋白质的等电聚焦分离，将聚焦好的 IPG 胶条在含有 SDS 的缓冲液中平衡。第二向是将在 IPG 胶条中经过第一向分离的蛋白质转移到 SDS-PAGE凝胶上，根据蛋白质的相对质量或分子量 (MW) 大小与第一向相垂直的分离 。沿垂直的方向进行 SDS-PAGE电泳（ 聚丙烯酰氨凝胶电泳） ， 按分子量大小进行分离。样品经过电荷和质量两次分离后，得到等电点和分子量的信息。 IPG 胶的材料是 Immobilines，为拥有 CH2=CH-CO-NH-R结构的 8种丙烯酰胺衍生物系列，其中 R包含羧基或叔氨基团，它们构成了分布在 pH 310不同值的缓冲体系。根据公布的配方计算后，将适宜的 IPG试剂添加至混合物中用于凝胶聚合 ， 在聚合中缓冲基团通过乙烯键共价聚合至聚丙烯酰胺骨架中而形成 pH梯度。通过这种方式生成的 IPG不会发生电渗透作用， 因而可以进行特别稳定的 IEF分离达到真正的平衡状态。2D胶电泳数据库细胞因子的测定ELISA系列的试剂盒细胞因子绝大部分是蛋白质，并且一般都用 ELISA试剂盒测定。ELISA法酶联免疫吸附剂测定是主要的测蛋白的方法ELISA 的原理 ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合的一种 敏感性很高的实验技术。 基础 :抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。 结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留其酶的活性。 测定时，受检标本与固相载体表面的抗原或抗体起反应，洗涤加入酶标记抗原或抗体，加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，由此进行定性或定量分析。免疫测定在临床检验中的应用 的可行性 由于各种抗原成份，包括小分子的半抗原，均可用以制备特异性的抗血清或单克隆抗体，利用此抗体作为试剂就可检测标本中相应的抗原，尤其 采用基因工程方法制备包被抗原来检测样本中的相应抗体，都大大提高了 ELISA的特异性，加之电脑化程度极高的 ELISA检测仪的使用，使 ELISA更为简便实用和标准化，从而使其成为最广泛应用的检测方法之一。 综上，由于 ELISA具有快速、敏感、简便、易于标准化等优点，使其得到迅速的发展和广泛应用 。举例：多糖蛋白的检测ELISA试剂盒法CRP，肺炎球菌细胞壁 c多糖蛋白，一种急性时相（期）蛋白，亦称 C反应蛋白，正常参考值 10mg/L。本身由肝细胞产生能结合肺炎球菌细胞壁糖蛋白，能监测疾病的发展情况为非特异性的检验指标，很多疾病时都可以表现出来。RIA法儿放射免疫测定 /放射免疫分析(Radioimmunoassay， RIA) RIA法基本原理： 在放射免疫分析的实验中，加入超量的标记抗原 *Ag与未标记抗原 Ag（即：待测抗原）与较少量的抗体（ Ab）竞争性结合。 如果实验结果所计量到的结合物（ *Ag-Ab）放射活性较高，表示待测物的浓度较低。 如果所计量到的结合物放射活性较低，则表示待测物的浓度较高。 藉由标准 曲线图的分析，可以推算出待测物的浓度。 用 ELISA 法及 RIA 法检测活性蛋白及其降解产物的测定血浆纤维蛋白原水平与纤维蛋白 体聚合功能的测定血 浆纤维蛋白原降解产物测定 参考值 5mg/L 意 义 1.增高见于原发性纤溶症 ,DIC(弥散性血管内凝血 ),恶性肿瘤 ,肝脏疾病 ,肾脏疾病 ,肺梗死 ,白血病 ,器