犬瘟热及其诊断与防制

犬瘟热及其诊断与防制预防兽医犬瘟热（ canine distemper， CD）是 CDV引起的犬科、鼬科和浣熊科等动物的一种急性、热性、高度接触性传染性疾病。以早期表现双向热、急性鼻卡他以及随后的支气管炎、卡他性肺炎、严重的胃肠炎和神经症状为特征。犬感染 CDV的死亡率可达 90%，甚至 90%以上。犬瘟热最早发现于 18世纪后叶。 1905年卡尔（ carre）发现其病原为病毒。我国于 1968年首次在黑龙江一野生动物饲养场发现犬瘟热。截至目前 ,世界各国凡是有犬科动物生存的地区都有本病发生。 随着 CDV对动物流行因素的不断适应 ,其自然感染宿主范围在不断扩大 ,加之 CDV变异株的出现 ,犬瘟热的发病率和致死率仍居高不下 ,流行趋势由散发向群发发展 ,临床症状越来越复杂 ,其危害也越来越大。 此外 ,最新研究证实 CDV在体外可感染人的前体破骨细胞 ,在破骨细胞内增殖 ,表明 CDV的自然宿主可能已扩展到了人类。鉴于上述因素 ,国际动物卫生组织 (OIE)始终将其作为重点关注的疫病之一。主要内容n 一、病原与流行病学n 二、发病机理与主要临床特征n 三、诊断技术1、胶体金免疫层析技术2、 RT-PCR和核酸探针技术3、包涵体检查4、血清学技术5、病毒分离n 四、 CD的防制一、病原与流行病学病原 CDV属副黏病毒科，麻疹病毒属， CDV基因组为不分节段的单链负股 RNA,由 15616个核苷酸组成。 CDV由 6个基因组成 ,从 3 端到 5 端依次为N、 P、 M、 F、 H、 L，分别编码核衣壳蛋白、磷酸化蛋白、 C蛋白、基质蛋白、融合蛋白、血凝素蛋白和大蛋白七种主要蛋白分子。N蛋白 1-80或 337-358多肽是 CDV刺激机体抗体的 B细胞表位。 CDV N蛋白的 281-289氨基酸即 Tyr-Pro-Ala-Gly-Leu-His-Gln-Phe连续 9个氨基酸残基高度保守，是 T细胞表位，能诱发 MHC-I类抗原限制性 CTL反应，在细胞免疫中发挥重要作用。研究表明 N蛋白与 CDV的毒力密切相关。F蛋白介导病毒与感染细胞、感染细胞与非感染细胞的融合 ,使病毒具有在体内扩散的能力 ,同时 ,还担负着刺激机体产生中和抗体的职能 ,在抗病毒免疫中具有重要地位。在麻疹病毒属（ MV）成员中 ,MV、 CDV和牛瘟病毒（ RPV）有群特异性表位 ,主要是在 F蛋白上 ,F蛋白存在高度的表位同源性 ,是异型免疫的主要交叉抗原，故可产生交叉免疫。目前研究认为犬瘟热病毒只有一个血清型。但由于CDV可能具有丰富的基因多样性 ,存在着不同的变异毒株。大量研究显示 ,目前流行的野毒株与标准 的 Covac、Rockborn、 Onderstepoort、 Lederle等疫苗株的抗原性、致细胞病变类型 (CPE)、毒力等 生物学特性方面存在部分差异。本病毒在 -10 可生存几个月，在 -70 或冻干条件下长期存活；在 0 以上感染力迅速丧失 ;最适 PH7.0,对热和干燥敏感， 0.1%甲醛或 1%煤酚皂等对本病由消毒效果流行病学传染源 患犬瘟热病动物、潜伏期带毒动物及病死尸体是主要的传染源。 CDV为一种泛嗜性病毒，但亲嗜性最强的淋巴细胞和上皮细胞。 CDV大量存在于感染和患病动物的唾液、眼和鼻分泌物中 ,也见于淋巴结、肝脏、脊髓、血液、脑脊液、心包液及胸腹水中。患犬瘟热的犬是最危险的传染源 ,许多报道显示多数养殖场发病与本场内或附近居民的患病犬有关 ,因此 ,毛皮动物养殖场如需要护场犬时 ,应对进行其定期免疫。患病痊愈动物带毒期可长达 6个月 ,此间 ,仍可通过其排泄物和分泌物中排出病毒 ,污染周围环境。传播途径 试验表明， 犬瘟热主要传播途径为通过消化道、呼吸道以及粘膜直接接触传播。若与病毒携带者直接接触 ,或接触污染的饮水、饲料、垫草、食具、用具、饲养人员的工作服、手套 ,兽医人员的体温计、注射器及注射针头等 ,均可感染此病。犬瘟热也可通过鼠类、禽类、吸血昆虫以及风等媒介作用间接传播。 CDV还可通过胎盘进行垂直感染。易感动物 CDV自然宿主谱十分广泛，目前己知可自然感染 CDv的动物包括食肉目所有 8个科、偶蹄目猪科、灵长目的猕猴属和鳍足目海豹科等多种动物。犬最易感，凡是养犬的地方都有本病的发生，特别常见于城市或犬类集中地的方。不同年龄、性别和品种的犬都可感染，但 2月龄以内的幼犬由于母源抗体的保护， 80%不受感染； 3-12月龄的幼犬易感性最高； 2岁以上犬的易感性逐渐降低。康复犬可获终身免疫力。二、发病机理与主要临床特征n 发病机理 感染后病毒主要从鼻咽和呼吸道散布到支气管淋巴结和扁桃体进行原发性增值，产生初始毒血症，同时伴有第一次体温升高，此时病毒散播到网状内皮系统。在淋巴器官增殖的病毒被淋巴细胞及单核细胞携带进入血液，产生第二次病毒血症，伴有第二次体温升高。 CD病例 CBC可见 WBC计数下降，后可因继发感染导致WBC升高。临床症状与病变 CDV为一种泛嗜性病毒（与机体细胞广泛存在 CDV受体有关） 病变分布广泛， 但亲嗜性最强的淋巴细胞和上皮细胞。 肺脏、肝、脾、骨髓、上皮细胞组织以及全身淋巴结和淋巴器官是病毒易于定居之所 ,病理上表现为呼吸道、肺部和消化道不同程度的卡他性炎症 ,重症病例肺部充血性水肿和坏死性支气管炎 ,肠系膜脱落 ,肠系膜淋巴结肿大。病理组织学检查 ,在呼吸道、膀胧、肾孟上皮细胞中可见到包涵体。临床上犬瘟热主要表现的症状： 1.眼鼻有浆液性或脓性分泌物； 2.呼吸道症状，如咳嗽、流鼻涕等； 3.双向热； 4.血便； 5.神经症状，抽搐，角弓反张等。有些病例皮肤出现水疱性皮疹、有些病例鼻和脚底表皮角质层增生而呈角化病。 CDV主要侵害易感动物的呼吸系统、消化系统以及神经系统。由于受动物免疫状态、野毒株毒力强弱差异等因素影响 ,感染 CDV后动物临床症状不尽相同 ,在临床上可将犬瘟热分为呼吸型、消化型、神精型和混合型四种症候型 ,这四种症候型既可以独立出现 ,又可两种或三种混合在一起。此外犬瘟热的发生常与犬传染性肝炎、犬细小病毒及其他细菌感染并发或继发 ,使病情变得更为复杂。三、诊断技术n 病毒分离n 胶体金免疫层析技术n RT-PCR和核酸探针技术n 包涵体检查n 血清学技术胶体金免疫层析技术胶体金免疫层析法 胶体金免疫层析技术是20世纪 90年代初在免疫渗滤技术的基础上建立的一种简易快速的检测技术 , 由 Beggs等最先用于人绒毛膜促性腺激素 (HCG ) 的测定，用于人的妊娠检查。近年来该技术发展迅速 , 在生物医学领域特别是医学检验中得到了广泛应用。目前，胶体金技术广泛用于小动物传染病如： CDV、 CPV、 CAV（ 传染性肝炎 ）、 CCV、 FPV（ 猫泛白细胞减少症 ）、 FeSV（ 猫白血病 ）、 FIV（ 猫免疫缺陷病 ）等疾病的快速筛选诊断。氯金酸 (HAuCl4)在还原剂作用下 , 可聚合成一定大小的金颗粒 , 它带负电而且疏水 , 由于静电作用金颗粒和水成为稳定的胶体状态称胶体金。胶体金标记技术 , 实质上是蛋白质等高分子物质被 吸附 到胶体金颗粒表面的包被过程。 吸附机理 是胶体金颗粒表面带负电荷 , 与蛋白质的正电荷基团因静电吸引而形成牢固结合。用还原法可以方便地从氯金酸制备各种不同粒径 , 也就是不同颜色的胶体金颗粒。这种球形的粒子对蛋白质有很强的吸附能力 , 可以与葡萄球菌 A 蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白等非共价结合 , 因而在基础研究和临床实验中成为非常有用的工具。显微镜下金标蛋白结合物呈黑褐色颗粒 , 当这些标记物在相应的配体处大量聚集时 , 肉眼可见红色或粉红色斑点 , 因而目前金标被应用于定性或半定量的快速免疫检测方法中。n 例： CDV抗原胶体金快速诊断试纸 胶体金免疫层析技术所应用的主要技术类型是 双抗体夹心法。 如主要是将 CDV抗体以条带状包被在 NC膜的检测线 T上 ,胶体金标记的 CDV抗体吸附在结合垫上 , 当待测样品加到试纸条一端的加样孔上后 , 通过毛细作用向前移动 , 溶解结合垫上的胶体金标记的 CDV抗体 ,如果样品中含有 CDV,则形成金标 CDV抗体 -CDV抗原复合物， 再移动至包被的 CDV抗体的检测线（ T）处 , 包被在检测线上的 CDV抗体和金标 CDV抗体与样品中的CDV结合 , 形成金标 CDV抗体 -CDV抗原 -CDV抗体复合物 , 胶体金富集在检测线处形成一条可见的紫红色线。如果待检血清中没有相应抗体 , 胶体金标记物将不会与包被在检测线上的抗体结合 , 胶体金不会富集 , 检测线上不会出现紫红色色线。当样品与溶化了的胶体金标记物继续往上移动至对照线（质控线 C）时 , 就与包被在对照线处的抗金标抗体结合 , 在对照线上形成免疫复合物 , 出现一条胶体金富集的紫红色色线。试纸条如上图所示。金标抗体金标抗体 -抗原-抗体复合物抗金标抗体 -金标抗体复合物（吸水玻璃纤维）包被抗体处玻璃纤维素膜吸水纸包被抗金标抗体处免疫胶体金抗体包被处RT-PCRRT-PCR 逆转录 -聚合酶链式反应方法具有特异、敏感、快速诊断等优点。提取组织或细胞中的总 RNA，以其中的 RAN作为模板，采用特异性引物利用逆转录酶反转录成 cDNA，再以 cDNA为模板进行 PCR扩增，从而获得目的基因或检测基因表达，再进行电泳检测。如 王凤雪 ,闫喜军 等以 CDV 疫苗株 N蛋白基因为研究对象 ,建立的 CDV的 RT-PCR检测方法用于毛皮动物犬瘟热诊断。P1( 5GATAAAGCATGTCATTATAGTCCTAA3) ; P2 ( 5CTTGAGCTTTCGACCCTTC 3) 1.TRIzol法抽取总 RNA2.病毒 cDNA的合成反转录 ( RT) 20uL反转录反应体系：反转录引物 P2 1uL、 RNA 5uL、 70 加热 10min、冰浴 10min，再加入 5倍PCR buffer 4uL,2.5mmol/L dNTP2uL, RNAisn抑制酶0.5uL,AMV反转录酶 1uL, DEPC H2O 4.5uL, 充分混合后离心 ,经 42 60min,95 灭活 AMV反转录酶 ,立即于冰上冷却 ,进入 PCR。3.PCR反应体系 ： PCR反转录产物 5uL, 10 倍 PCR buffer 5uL, 2.5mmol/ L dNTP4uL,上、下游引物各 1uL, rTaq DNA Polymerase 1uL, 加水补足 50uL。 PCR 的反应程序 : 94 45s, 51.6 45s, 72 45s, 35 个循环后 , 72延伸 5min。取 10uL PCR产物 ,以 100bp Ladder作对照 , 进行 1. 2%琼脂糖凝胶电泳检测。4.结果判定 ： 琼脂糖凝胶电泳，在阳性对照孔出现相应扩增条带，而阴性对照孔无此条带时判定结果。若样品扩增条带与阳性对照扩增条带处于同一位置，则判定为 CDV阳性，否则为阴性n 包涵体检查可刮取鼻、舌、结膜、瞬膜或刮取膀胱、肾盂、胆囊和胆管等粘膜，做成涂片，干燥，甲醛固定，苏木紫和伊红染色后镜检。包涵体红色见以胞浆内，一个细胞内可能有 1-10个，平均 2-3个，椭圆形或圆形，边缘清晰。发现包涵体可以作为诊断依据，但要与细小病毒的核内包涵体区别。有时仅仅根据包涵体的存在可能导致假阳性诊断，最好还要进行病毒分离鉴定或血清学检查。CPVCDV血清学技术n 血清中和试验：将备检血清稀释后加入标准病毒株， 25 作用 2h，与制备好的犬肾或绿猴肾细胞悬液混合接种于微量培养板， 5%CO2条件下 35-36 培养 3d染色检查 CPF。n 荧光抗体检查技术：急性病犬的淋巴细胞、结膜。阴道细胞、脑脊髓液涂片做荧光抗体染色，其阳性胞浆显示弥散性荧光。亚急性或慢性病犬由于产生中和抗体，通常难以查出阳性细胞。n 补体结合试验：多以 CDV的 Vero细胞或鸡胚成纤维细胞培养物为抗原，检查备检血清中的补体结合抗体。因该抗体出现于感染后 2-3周，维持时间也短，所以只能作为一种证明近期感染的方法。预防犬瘟热最有效的办法是接种疫苗 ,常规疫苗有灭活苗、弱毒疫苗 ,新型疫苗有重组苗、亚单位苗、多肤苗等。灭活疫苗能刺激多种动物产生体液免疫 ,但免疫持续时间短 ,免疫途径单一 ,使用范围受到限制。弱毒疫苗免疫效果好 ,目前广泛用于经济动物和犬的免疫 ,但弱毒疫苗也存在着一些弊端 ,一是易受母源抗体干扰 ,能引起的一过性的免疫抑制和血小板减少 ;二是残毒 ,某些疫苗株的毒力残留能导致免疫动物的脑炎 ;三是对一种动物安全的活疫苗对其他食肉动物、野生动物非常敏感 ,易造成散毒的危险 ,如小熊猫接种 CD活苗发生CD甚至死亡 ,接种 CDV致弱的活苗的黑蹄雪貂死于CD。鉴于现行 CDV弱毒疫苗的上述缺陷 ,对犬瘟热的防制目前正致力于重组苗、亚单位苗、多肤苗等新型疫苗的研制犬瘟热的防制n 只有完整的 CDV才能使犬同时产生细胞免疫和体液免疫，而且只有同时具备这两种免疫力的犬才能对 CDV产生完全的免疫。体液免疫主要由中和抗体组成，抑制病毒感染细胞。已经进入细胞内的病毒则需要依靠细胞免疫来清除。n 体液免疫可以通过初乳和胎盘被动传递给新生幼犬，在一定时间内，免受 CDV感染，但也可干扰疫苗的主动免