第五章基因克隆-4基因剔除

Genes mRNAs ProteinsLoss-of-FunctionPhenotypesTools for Functional Analysis Knockouts Dominant Negative(显型负 突变 ) Antibodies Aptamers(寡 核苷酸适配子 ) Antisense Ribozymes siRNAsDemonstration of a casual role of a gene in the initiation,maintenance, or modulation of a phenotype by selective decrease (knockdown) or lack (knockout) of gene function. Gene of InterestGain of Function Loss of Function 六、基因剔除技术（一）基因剔除技术的概念基因剔除（ gene knock out） 或基因靶向 (gene targeting)灭活是将生物体中某一特定的基因功能给破坏，再研究当生物体缺少这个基因在生长发育的过成中会有怎样的改变，或是会好发怎样的疾病。n 原理：利用 细胞复制分裂时 ，染色 体 进行联合互换发生同源重组 homologous recombination）Prdx1 geneES cell胚胎杂 合子Prdx+/-纯 合子Prdx-/-Prdx1+/+: wide type mice(N=34)Prdx1+/-： Prdx1 heteroxygous mice(N=88)Prdx1-/-： Prdx1 knock out mice(N=64)Sourthern blot-DNANothern blot-RNAGeneration of Prdx1-/- mice进入多重防护的 SPF动物室 检查受精母 鼠取胚 胚 显微注 射DNA显微 注射 显微 注射完成胚 植入输 卵管 养殖 小鼠动物饲养（二）基因剔除技术的应用 阐明特定基因功能、基因间相互作用 阐明基因结构与功能异常在疾病发生、演进和归转中的作用，即疾病分子调控机制 在精确的时间、组织打开或关闭特定基因 可对基因进行单个碱基或大片段的修饰 确定药物作用的分子靶点，有效筛选新药Model Organisms Used in Functional GenomicsMajor Events in the Development of Gene Targeting骨保护蛋白 (Osteoprotegerin, OPG)+/+ -/-转基因鼠 基因剔除鼠骨硬化 骨质疏松症Procedure of Knockout Mice七、 RNA干扰技术（一） RNA干扰技术的概念生物体内，双链 RNA(double-stranded RNA， dsRNA)， 能识别含有其互补序列的mRNA并与之结合，在酶的作用下降解mRNA， 从而干扰相应基因表达。这一现象称为 RNA干扰 (RNA interference， RNAi)。RNAi在生物抵御病毒感染、维持基因组中转座子的稳定以及某些生物生殖细胞的发育过程中都起着重要作用。（细胞膜）（细胞核）（细胞质）基因的表达转录翻译（转运 RNA）（核糖体 RNA）RNAi现象的发现1995年，康奈尔大学的研究人员 Guo和Kemphues尝试用 反义 RNA去阻断 par-1基因的表达以探讨该基因的功能，结果反义 RNA的确能够阻断 par-1基因的表达，但是奇怪的是，注入 正义链 RNA作为对照，也同样阻断了该基因的表达。Guo S, Kemphues KJ. par-1, a gene required for establishing polarity in C. elegans embryos, encodes a putative Ser/Thr kinase that is asymmetrically distributed. Cell. 1995;81(4):611-20. Section of Genetics and Development, Cornell University, Ithaca, New York 14853, USA. 基因沉默，即性状不表现外源导入或者转基因表达反义RNA， 抑制 rRNA和 tRNA的翻译。Fire等 (1998)发现将 dsRNA注入线虫体内后可抑制序列同源基因的表达 ,并证实这种抑制主要作用于转录之后，所以又称转录后基因沉默 (post transcriptional gene silencing, PTGS)。 该课题组将这一现象称为 RNA干扰（ RNA interference， 简称 RNAi）。 Fire A, et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in C. elegans. Nature. 1998 ;391 (6669):806-11. （二） RNA干扰技术的原理 （ 3步骤）dsRNA的形成 siRNA的形成 RNAi的形成 靶基因 mRNAsiRNA的反义链RNAi是生物体抵御外源遗传物质入侵的自我 保护机制。mRNA被酶切破坏，性状无法表达。dsRNA： 外源或内生，或病毒或其他双链 RNA； 或异常RNA由 RdRP催化合成双链 RNA siRNADicer核酸酶特异性蛋白结合， siRNA解链活化的 siRNA复合体 (RISC)靶基因的 mRNAsiRNADicer核酸酶 核酸酶降解 mRNARdRP催化合成新的双链 RNA（ dsRNA）以反义 siRNA为引物35553 35随机降解性聚合酶链式反应（ random degradative PCR） Initiation StepATPATPADP + ppiADP + ppiDICERKINASERdRPEffector StepsiRNA bindingsiRNA unwindingRISC activationDicersiRNA53 53RNA诱导沉默复合体（ RNA-induced silencing complex， RISC） 的组成 2 RNA binding proteins RNA/DNA Helicase Translation Initiation Factor RNA-Dependent RNA Polymerase (RdRP) Transmembrane ProteinVectors expressing siRNAsU6H1siRNAVectors expressing siRNAsU6Sense sequenceAnti-sense seque