第五章细胞融合和体细胞杂交10-10

第五章 细胞融合与体细胞杂交远源杂交 远缘杂交 ：不同种属之间，或是地理上远缘的种内亚种之间个体的交配称为 远缘杂交 。 由于种属间存在着种种隔离机制，致使远缘杂交常表现 不亲和 或获得的远缘杂种表现 不育 。 不亲和性 ： 在有性生殖过程中，由于个体细胞或组织水平上的 不协调 而使 受精或接合不能正常进行 ，或是 受精后不能产生后代 的现象。 双亲个体间基因型的 不协调或是染色体组非同源性在生殖生理表型上的一种反映。不亲和性是 稳定物种 的重要机理。 种间不亲和性 ： 异种、异属生物个体之间的生殖不亲和现象常由 染色体组的不同 所造成。一般地说，越是 远缘则不亲和性越高 ，直到完全不能受精。第六章 细胞杂交（融合）技术一、定义1，细胞融合 (cell fusion)广义 ：凡是将两个细胞或原生质体融合成一个细胞的过程。包括体细胞、性细胞的融合和自发融合。就植物而言，又称为 原生质体融合 (protoplast fusion)。狭义：狭义： 将不同的体细胞融合在一起，通过对杂种细胞的筛选，培养，期望得到体细胞杂种的一种手段。所以又称为 体细胞杂交 (somatic hybridazation)。细胞融合 =原生质体融合 =体细胞杂交体细胞杂交与有性杂交的异同比较内容 体细胞杂交 有性杂交时间 无季节限制 花期限制，特别是 母本的花期亲缘关系一定程度上可以克服有性 /嫁接不亲和性受亲和性影响结果细胞核、细胞质均可以重组、倍性增加双受精，一般无细胞质重组，倍性不改变第二节 体细胞杂交步骤：1 原生质体的制备2 原生质体的融合3 杂种细胞选择4 杂种细胞培养5 由愈伤组织再生植株6 杂种植株的鉴定原生质体融合自发融合 ： 自然界中：受精、双受精、花粉母细胞融合等。 在原生质体制备和培养过程中：细胞壁被分解后，原生质体的胞间连丝发生膨大，相邻细胞的原生质和细胞器通过胞间连丝流到一起，形成融合。此现象在 同种或同品种 植物间发生 ,但频率极低 。诱导融合： 通过诱导剂的作用，使两个远缘的原生质体产生融合的方法，是细胞融合中常用的手段细胞融合的方法聚乙二醇 PEG）化学方法电脉冲物理方法 生物方法仙台病毒(Sendai virus)NaNO3处理高 PH-高浓度 Ga2+NaNO3处理1909年， Kuster在一个发生了质壁分离的表皮细胞中，低渗 NaNO3溶液可以引起 2个亚原生质体的融合。缺点： 异核体 形成频率不高，对细胞毒害大，融合率低 (0.1%)，重复难 。高 PH-高浓度钙离子处理1973年， Keller和 Melchers，用强碱性 (pH10.5)的高浓度钙离子（ 50mmol.L-1)溶液在 37 下处理约30min，两个品系的烟草叶肉原生质体很容易融合。但对于有些原生质体系统，这样高的 PH值是有毒的。PEG(聚乙二醇 )处理PEG的作用机理：由于 PEG分子具有轻微的负极性，故可以与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成 H键，从而在原生质体之间形成分子桥，其结果是使原生质体发生粘连进而促使原生质体的融合。另外， PEG能增加类脂膜的流动性，也使原生质体的核、细胞器发生融合成为可能。PEG融合所需试剂 融合液： pH 5.6CaCl2 8-10mmolKH2PO4 0.7mmol甘露醇或山梨醇 0.5-1.0mol 诱导液：融合液 PEG 20 45PEG作为融合剂的优点 :异核体形成的频率高，可重复性强。缺点：有一定 毒性 ，容易形成 多个细胞的融合体 ；分裂频率低。电 融 合电场来诱导细胞彼此连接成串，再施加 瞬间强脉冲 促使质膜发生可逆性电击穿，促进细胞融合的技术。 原理： 在直流电脉冲的刺激下，原生质体质膜表面的电荷发生改变，使异种细胞或原生质体粘合并发生 质膜瞬间破裂 ，进而连接，直到闭合成完整的膜形成融合体。 优点 ：融合率高、重复性与可控制性强。 缺点 ：可能会造成不可恢复的细胞损伤。细胞电融合仪生物法 病毒诱导细胞融合： 研究最早的细胞融合诱导方法。主要是由于病毒会与宿主细胞膜直接融合，同时进入两个细胞就会 打破两个细胞膜的隔阂 ，引发细胞质的交流，进而达到细胞融合的目的。 缺点： 要提前大量培养病毒，并且灭活后才能作为融合剂使用，操作繁琐，而且一旦灭活不充分的话，病毒还可能感染亲本细胞。因此，目前已经很少使用病毒诱导法进行细胞融合。 （ 1）足够量的病毒颗粒附着在细胞膜上起 搭桥 作用，使细胞聚集在一起。 （ 2）通过病毒与原生质体或细胞膜的作用使两个细胞膜间互相渗透，胞质互相融合。粘结部位质膜被破坏， 不同细胞间形成通道，细胞质流通并融合 （病毒也随之进入细胞质）。 （ 3）有丝分裂， 细胞核融合 ，形成杂种细胞。原生质体的融合过程异种原生质体先经 膜融合 形成共同的质膜 ，然后经 胞质融合 ，产生 细胞壁 ，最后是 核融合 。 细胞核的融合是异种原生质体融合的关键。融合体只有成为单核细胞后才能继续生长，才能合成 DNA、 RNA，四 异核体的核融合取决于二亲本原生质体 发育周期的同步 程度和系统发育关系的远近以及培养基对二亲本原生质体的有利程度1 异核体的核融合和染色体的行为一般是在两亲本核同步分裂过程中发生的。第一次有丝分裂 ；这就要求两个核必须同步分裂，如果两个核所处时期不同，一个开始合成 DNA， 另一个还处于合成的中途或已完成了复制，它们之间就会相互影响，导致最终不能进行细胞分裂。2 亲缘关系对融合体发育的影响种内和亲和的种间：不亲和属间、科间： 核融合失败，染色体丢失、重排或形成嵌合体。即使属间能发育成植株，也是不育的。海藻 +胡萝卜，在第一次分裂后，一亲本核即退化。 Hela+胡萝卜，胡萝卜核退化。 细胞融合是一个 随机的 物理过程，经融合后细胞将以 多种形式出现 ，需要通过培养和筛选，除去不需要的细胞，分离出需要的杂种细胞，从而解决融合细胞的选择问题。问题： A