质粒的酶切—琼脂糖凝胶电泳分离dna

实验二实验二 质粒的酶切、琼脂糖凝质粒的酶切、琼脂糖凝胶电泳分离胶电泳分离 DNA 1. 实验目的2. 实验原理 3. 实验仪器、材料与试剂 4. 实验步骤 5. 实验结果及讨论 实验目的实验目的 l 限制性内切酶切割出目的 DNAl 了解琼脂糖凝胶电泳的原理l 掌握琼脂糖凝胶的制作及进行电泳的方法 实验原理实验原理 l 利用限制性内切酶具有特定的识别及切割位点，定点切割环状质粒 DNA。l 琼脂糖凝胶电泳是基因工程操作中常规的实验方法，它能检测少量的 DNA（如用肉眼观察，可检测到 10 ng的 DNA），且检测的范围很广。pBC SK mapl 它的原理是溴化乙锭在紫外光照射下能发射荧光，当 DNA样品在琼脂糖凝胶中从负极向正极泳动时，溴化乙锭从正极向负极移动，这样溴化乙锭分子就会嵌入 DNA分子中形成络合物，使 DNA在紫外光下发射很强的荧光。在溴化乙锭足够的情况下，荧光的强度正比于 DNA的含量，这样就可以检测 DNA的浓度。实验仪器、材料与试剂实验仪器、材料与试剂 （一） 仪器 l1. 水平式凝胶电泳槽 l2. 稳压电泳仪 l3. 电炉 l4. 紫外检测仪 l5. 台式离心机 （二） 材料 l 实验一中提取的质粒 DNA和酶切后的质粒 DNA。 （三） 试剂 l 1.限制性内切酶 EcoRI，l 2. TAE电泳缓冲液 (50) （ pH8.0） Tris 242g 冰醋酸 57.1ml 0.5mol/L EDTA（ pH8.0） 100ml l 3. 溴化乙锭溶液 10mg/ml水溶液，室温，棕色瓶或铝铂纸包装保存。 l 4. 10DNA样品上样缓冲液 l 5. 琼脂糖实验步骤实验步骤酶切体系l 调制酶切体系如下 : (共 20L)无菌水 6L，质粒 10 LBuffer K 2L, EcoR I 1L,BamH I 1 L37 酶切 1.5小时。 琼脂糖凝胶制备琼脂糖凝胶制备l 1. 洗净电泳槽、制胶槽、梳子、挡板，晾干。 l 2. 插好挡板、梳子。 l 3. 根据实验所需称取 0.4克琼脂糖，放入制胶 的容器中（一般用三角瓶），然后加入 40ml电泳缓冲液（ 1TAE）。 l 4. 加热煮沸，使琼脂糖 完全 溶解。 l 5. 溶液冷至约 60 时，加入溴化乙锭 4 L (终浓度为 0.1 g/l)，轻轻摇匀，倒入制胶槽上，检查有无气泡。l 6. 室温下约 30-45分钟后，琼脂糖溶液完全凝固，小心垂直拔出梳子和挡板，清除碎胶，将凝胶放入电泳槽中。 l 7. 加入电泳缓冲液（ 1TAE）至电泳槽中，使液面高于胶面约 1mm。l 8.在 DNA样品中加入 2 L (1/10体积 )的 10 DNA上样缓冲液 (loading buffer)，混匀，稍甩一下，使溶液都处于离心管底。 l 9.用移液器吸起离心管中溶液，移入凝胶的梳孔中。l10.插上导线，打开电泳仪电源，按照需要调节电压至 120V，电泳开始，观察电流情况或电泳槽中负极的铂金丝是否有气泡出现。 l11. 等溴酚蓝泳动至凝胶前沿后，将电压（或电流）回零，关闭电源，停止电泳。 l12. 取出凝胶，在紫外观测仪上观察电泳结果。 l13 根据需要切下 DNA条带，放入 1.5ml Ep管中，放于 4 保存，以备下周实验用。实验结果及讨论实验结果及讨论l 质粒 DNA在琼脂糖凝胶中一般为三条带，最前面的条带为超螺旋构型，中间为线型，最后为单链有缺刻的构型。l 如提取过程中有机械损伤，可能在胶上出现弥散。l 影响 RE(限制性内切酶 )活性的主要因素： DNA的纯度； DNA的甲基化程度；温度；缓冲液成分（DDT， BSA）等。使用 3 mg的 DNA Marker DL 2,0