质谱技术在临床微生物检验中的应用

质谱技术在临床微生物 检验中的应用 （一）、现代感染性疾病和 临床微生物检测现状 耐 药 菌株 增多 疑 难 菌株 增多现 代感 染性疾 病新特 点 条件致 病菌增 多 人 员 少、 鉴 定 速度 较 慢 感染 菌种 类 增 多 临床微生物当前现状 病原 生长时间 报告时间 需氧菌 24h 2-3个工作日 厌氧菌 48h 酵母菌 2-5天 2-5个工作日 丝状真菌 2-5天 常 规微生物 检 验遇 到 的 困 惑 ： 呼吸道、 肠 道 标 本的 细 菌种 类 繁多，常 规 的 鉴 定成本高或者操作麻 烦 ， 容易漏掉或者忽 视 某些 细 菌。 厌 氧菌、弯曲菌、分枝杆菌和真菌： 细 菌 鉴 定的死角，技 术 上不好掌 握或者目前的方法 难 以 实 施。 微生物的分 级报 告制度：存在很多 变 数，使得初次 报 告的 结 果可靠性 得不到 临 床的 认 可。（ 比如：直接涂片，初步能估 计细 菌大 类 ，但是 无法确切的到种，和耐 药 情况。） 实验 室要求 ：操作方便的，成本便宜的，性价比高的， 临 床迫切需要的。 临床微生物实验室自动化 将实验室人员从一些技术要求较低的、 能由仪器完成的工作中解脱出来，提高 标本处理效率，缩短 TAT时间。 临床的需求 安 图 生物 Autof ms1000 MALDI- TOF 革命性 临 床微生 物 兽 医微生 物 食品微生物（食品安全与 质 控 ） 环 境微生物 监 测 质谱 的 应 用 领 域 （二） 、 基质辅助激光解吸电离 飞行时间质谱仪 MALDI-TOF MS 的组成 飞行时间质量 检测器（ TOF） 基质辅助激光解吸 电离离子源（ MALDI） 数据库 MALDI-TOF MS 主机 （三 ） 、 MALDI-TOF MS 的原理 基本原理是将样品分散在基质分子中并形成晶 体。当用激光照射晶体时，基质从激光中吸收能 量，样品解吸附，基质 -样品之间发生电荷转移 使得样品分子电离，电离的样品在电场作用下飞 过真空的飞行管，根据到达检测器的飞行时间不 同而被检测，即通过离子的质量电荷之比（ M/Z ）与离子的飞行时间成正比来分析离子，从而测 得并绘出样品分子的质谱图。 蛋白质是生命的物质基础。不同的细菌或 不同疾病的样品，其蛋白质的种类和含量 不同。不同的蛋白质解析后形成的多肽片 段的种类、数量和分子量也不一样，因而 在一定的条件下，在电离空间的运动速度 和距离不同。用质谱仪将各种蛋白质解析 后在电离空间的运动速度和距离的轨迹记 录和描绘下来，则会形成不同的曲线图 形 。 （四）、操作简便 样 品靶 板 细 菌与基质 飞 行 管 检测 器 质谱图 真空系 统 样 品靶 板 入口 几秒 钟 即可得到 结 果 基 质辅 助激光解吸 电 离 -飞 行 时 间质谱 (MALDI-TOF MS) MALDI-TOF MS蛋白质指纹特征 MALDI TOF 检测 挑取部分菌 落点样至靶 板 加基质液 生成图谱 搜库 鉴定 质谱 检测流程 鉴 定 结 果 显 示 绿 色并且分数 最高的 为该样 品的 鉴 定 结 果 。 Bruker的 结 果 报 告： 得分范 围 分数的解 释 2.300-3.000 highly probable species identification完全可靠地 鉴 定到种的水平 2.000-2.299 secure genus identification, probable species identification可靠 鉴 定到属的水平，有可能 鉴 定到种的水平 1.700-1.999 probable genus identification 有可能 鉴 定到属的水平 0.000-1.699 no reliable identification 没有可信的 鉴 定 结 果 AnalyteName Organism(best match) Score Organism(second best match) Score Sample1 Pseudomonas aeruginosa 19955 1 CHB 1.906 Pseudomonas aeruginosa DSM 1117 DSM 1.881 Sample2 Proteus mirabilis DSM 18254 DSM 1.774 no reliable identification 1.631 Sample3 Klebsiella pneumoniae ssp pneumoniae 9295 1 CHB 2.064 Klebsiella pneumoniae ssp pneumoniae DSM 30104T HAM 1.994 Sample4 Enterobacter cloacae MB11506-1_CHB 2.299 Enterobacter cloacae 13159_1 CHB 2.072 优 点：直接可以打印 缺点：目前没有做接口 连 接到 实验 室的 LIS系 统 与现有传统的鉴定诊断技术相比，具有操作简 单、快速、通量高、灵敏度高、准确度好、试剂 耗品非常经济等优势。 准确度 时间 成本 MALDI-TOF 90% 5 min 2元 常 规 方法 80% 548 h 50元 对临床的意义： 分级报告，缩短了 TAT时间，尤其是厌氧 菌、奴卡菌等非常难鉴定的菌提供巨大的帮 助。 五、实现血培养的三级报告 微生物诊断技术不断发展给临床带来 了什么？ 1、非培养 /难培养微生物的检测能力大大 提高 2、缩短了常规微生物培养鉴定诊断药敏 时间 (即 TAT时间 ) 3、从微生物检验角度提供精准的诊断 六、安图微生物质谱 Autof ms1000 的优势 1、本土 产 品 维护 保养 方便及 时 试剂 、耗 材供 应 及 时 价格便宜 数据库主要包含： 474个属、 2613多种、 9531株（包含 细菌、真菌等） 正在开发的数据库： 生物反恐 、肠 道微生物、海洋致病微生物、肉类 蛋白数据库 操作 简 便 中文界面， 单 个 软 件 即可完成 编辑 、采 集、 鉴 定；快速 鉴 定 功能方便使用。 准 确度高，重复性 好 上海临检中 心评估项目 总结： 01 ATCC标准菌株鉴 定准确性 安图质谱检测微生物的结果与 172株 ATCC国际标准菌株的一致 性为 97.67%，高于布鲁克的 93.60%。 02 临床菌株鉴定准 确性 安图质谱 Autof ms1000对 176株临床菌株的鉴定准确性 为 100%，高于布鲁克的 98.30%。 04 鉴定重复性 安图质谱 Autof ms1000对 65株实验菌株的鉴定结果全 部可靠，重复性较好。 03 不同前处理方法的鉴 定准确性 三种前处理方式安图质谱 Autof ms1000的鉴定准确性均高于布鲁克 质谱，其中甲酸裂解法更适于临床使 用。 Autof ms1000鉴定结果准确、可靠，适于临床 微生物检测 。 中国检验检 疫科学研究 院评估结论 Autof ms1000鉴定结果 准确性、重复性可靠 MALDI-TOF MS对 血培养阳性 样 本的直接 检测 优 点 ：快速。 缺点 ：操作麻 烦 ，且抽 滤 容易 产 生气溶胶， 污 染 环 境。不易于在 临 床推广。 鉴 定的缺陷： 多重菌感染不能 鉴 定，或者 鉴 定有 误 ， 链 球菌等 难 于区分的菌 是最大的 问题 。 MRSA的 鉴别 和分 型 Edwards-Jones et al. J Med Microbiol. 2000 MRSA的 鉴别 和分型 Wolters et al. IJMM. 2011 从 图 中可 见 ， 可 以做同源性 的比 较 使用体会 成本低，快速，鉴定结果准确，性价比高。 可以聚类分析，即同源性的研究，在耐药上有优 势。 可以建立库中没有的细菌的数据库，有地域性的数 据库。 最好 选择 血平板上的菌落，含指示 剂 的平板容易 降低 检 出得分， 鉴 定准确性受影