2细胞培养及建立泡沫细胞模型

2)实验手段 (1)细胞培养及建立泡沫细胞模型 将 THP-1 细胞置于含 10%胎牛血清的 RPMI1640 培养基中，于 370C, 5 CO:培 养箱静置培养。该细胞株属人类单核细胞系，在培养液中呈簇集状悬浮生长，倍增时间 大约在 26 h 后。细胞浓度控制在 106/mL，每两天换液一次，每四天传代一次。细胞复苏 后，传至 3 = 5 代后方可用于建模。 (2)建立巨噬细胞模型 取对数生长期的细胞，分为正常组和模型组，调整细胞浓度为 106/mL，接种于 6 孔培 养板，每孔 2 mL。正常组在含 10%胎牛血清的 RPMI 1640 完全培养液中培养。模型 组先 置于含 160 nmol/L PMA 的 RPMI 1640 基础培养液中培养 72 h，贴壁后轻轻吸去上清 液， PBS 洗 3 遍，更换 10%胎牛血清的 RPMI 1640 完全培养液，即得巨噬细胞。巨噬细胞 的鉴 定己在发表文献中完成。 (3)建立巨噬源性泡沫细胞模型 将获得的巨噬细胞更换含 3%胎牛血清的 RPMI 1640 培养液，并加入终浓度为 80 mg/L 的 Ox-LDL，共同孵育 48 h，油红。染色后，镜下观察细胞内充满橘红色脂滴，即得 泡沫 细胞模型，此过程即为泡沫化。 (4)针对 CaSR 的 si RNA 的构建及转染 根据公认的 si RNA 设计原则(Nat Biotech 2004; 22: 326-330)设计针对 CaSR 的 3 条 siRNA，选用验证后效果最好的一条。同时合成阳性对照和阴性对照。转染试剂选 用 Invitrogen 公司生产的 LipofectamineTM RNAiMAX Transfection Reagento siRNA 目标序列的选取原则: 工从转录本(mRNA) 的 AUG 起始密码开始，寻找AA 二连序列，并记下其 3 端的 19 个碱基序列，作为潜在的 siRNA 靶位点。注意:GC 含量在 4_5 070-_5 _5%左右的 siRNA 要比那 些 GC 含量偏高的更为有效;在设计 siRNA 时不要针对_5和 3端的非编码区 Cuntranslated regions UTRs)，原因是这些地方有丰富的调控蛋白结合区域，而这些 UTR 结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响 siRNP 核酸内切酶复合物结合 mRNA 从而 影响 siRNA 的效果。 1)细胞总 RNA 提取:按 Trizol 试剂盒说明书进行，具体操作步骤如下:在细胞 中加入冰预冷的 Trizol 试剂，室温静置_5 min;加 200 1 氯仿，充分摇匀 1_5sec，室 温静 置 2-3 min ; 4 0C，12000rpm 离心 1 _5 min，取上层无色水相层转移至新 EP 管;加等 体积 异丙醇，室温静置 l Omin 4 0C 12000rpm 离心 l Omin，管壁底处可见乳白色沉 淀，即 为 RNA;弃上清，加 7 _5%乙醇 1 ml 4 0C 7_500rpm 离心_5 min，洗涤二次; 弃上 层乙 醇，无菌环境风干 RNA 沉淀。用 20 州 DEPC 处理的双蒸馏水(ddH20)溶解 RNA 沉淀， -80 0C 备用;取 4 川总 RNA 加至 200 川灭菌水中，在紫外分光光度仪上测定其 ODZo 和 ODZSo，计算 ODZo/ODZSo。样品总 RNA ug 枢 1) = OD26ox40x 稀释倍数(50 ) /1000 o OD26o /ODZgo 在 1.8-2.0 之间为样品较纯。 2)反转录反应:在 20 川反应体积中进行，成分如下: 总 RNA tug (5 川)，随机引 物 1 1 DEPC 处理的 ddH20 4.51 70 0C 冰浴 l Omin;加 10 林 1 逆转录反应液(l Oxbuffer 21 MgCL241 dNTP21 inhibitor0.51，逆转录酶 11) 420C 冰浴 60min 99 0C 冰浴_5 min -20 0C 保存备用。 3)引物扩增设计:根据 Genebank 序列，设计各个引物序列并合成。 4)实时定量 PCR 实验方法: 使用宝生物工程( 大连)有限公司的 SYRB. Premix Ex TaqTM 和 Light Cycler PCR 扩增仪(Roche)进行荧光扩增;求出 CT 值。 (6)激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)测定 THP-1 细胞内游离钙的变化 取 6 孔板进行 THP-1 细胞培养，事先在 6 孔板中加入盖玻片。取 6 孔培养板中的 盖玻 片，D 一 Hanks 液冲洗 2 遍，用 1OOL 的钙离子探针 Fluo-3 /AM 与 F-127 混合工作 液(10 mol/L Fluo-3 /AM, 0.02070 F-127)滴于盖玻片上， 370C 避光 40 min D 一 Hanks 液再次冲 洗玻片 3 遍，洗去多余染料，保留少许 D-Hanks 液平衡细胞 10 min，分组施加因素后，于 10 min 内利用 LSCM 进行细胞内 Ca2+浓度检测。 (7)油红 O 染色 油红 O 属于偶氮染料，是很强的脂溶剂和染脂剂，与甘油三醋结合呈小脂滴状。 脂 溶性染料能溶于组织和细胞中的脂类，它在脂类中的溶解度比在溶剂中大。当组织切 片 置人染液时，染料则离开染液而溶于组织内的脂质(如脂滴) 中，使组织内的脂滴呈橘 红 色。 细胞接种于 6 孔培养板内，诱导建模结束后，吸去上清液，用 PBS 洗三次，冰冻 的 4 多聚甲醛固定_5 min， PBS 洗一次，再置于丙二醇中固定_5 min，轻轻吸去丙二醇， 加入 0. _5%油红 O 的丙二醇溶液，置 60烤箱中染色 1 _5 min，用 8_5%丙二醇冲洗_5 min，再用 PBS 洗三次，蒸馏水清洗 1 次，苏木素复染 2-5 min 1 07oHCL 分色及返蓝后封片。 置显微 镜下观察并摄像，细胞内脂质为红色，胞核为蓝色。 参考文献:Zheng XD, Li Q, Tang XB, Liang SJ, Chen LP, Zhang S, Wang ZG, Guo L, Zhang R, Zhu DL. Source of the elevation Ca2+ evoked by I S-HETE in pulmonary arterial myocytes. European Journal of Pharmacology 2008;601:16-22 (8)细胞内胆固醇含量的测定 细胞内胆固醇的提取:细胞接种于 6 孔培养板内，培养结束后，吸去上清液，冰预 冷 PBS 洗三次，用细胞刮刀刮取细胞，加 1 mL 冰预冷 0.9%生理盐水重悬细胞，反复冻 融三 次，冰浴中超声破碎_5 min，得细胞裂解液，分装，每份 200 匹，-700C 贮存，用于 测定 总胆固醇和游离胆固醇。 总胆固醇的提取:取 160L 上述细胞裂解液，加 300L 15 KOH 乙醇溶液，_50 0C 水 解 2h，加正己烷一异丙醇(4:1)SOOL涡漩 30 s 40C 下 3600 r/min 离心_5 min，取上 层。继 用正己烷一异丙醇(4:1)如上法抽提两次，合并三次抽提的有机相，减压真空干燥，加 20L 内标储备液，用甲醇并定容至 2 mL，摇匀，作为总胆固醇供试品溶液。 游离胆固醇的提取:取 160L 上述细胞裂解液，加 300L 乙醇，加正己烷一异丙醇 (4:1)500 匹涡漩 30 s 40C 下 3600 r/min 离心_5 min，取上层。继用正己烷一异丙醇 (4:1)如上 法抽提两次，合并三次抽提的有机相，减压真空干燥，加 20L 内标储备溶解并定容 至 2mL，摇匀，作为游离胆固醇供试品溶液。 HPLC 测定胆固醇: 色谱柱:Hypersil C 18 柱(2.1 mmx150 mm 3m);流动相:甲 醇一水(90:10);流速:0.5 mL/min;柱温:室温; 进样量:10 Lo 参考文献:唐朝克，王佐，易光辉，万载阳，刘录山，袁中华，王燕，危当 亘，阮长耿，杨永宗.Rolipram 对 THP-1 巨 噬细胞源性泡沫细胞胆固醇流出和 ABCA1 表达的影响.中国药理学通报.2003 oct;19(10):1177-82 (9) ELISA 法检测细胞因子的分泌情况 按每孔 2x1 护个细胞接种于 24 孔板中，含有 160nmo1/L PMA 的培养液培养 72 小时后， PBS 洗三遍，各组加入处理因素，继续培养 24 小时。收集细胞培养上清液。从平衡 至室 温的密封袋中取出实验所需板条，留空白孔。加 O.lml 离心后的细胞培养上清液于反 应 孔中，置 370C 孵育 90 分钟。然后洗板 _5 次。(同时做空白孔，标准品空)。于各反应 孔中， 加入新鲜稀释的生物素化抗体工作液 0.1m1 370C 孵育 1 小时，洗板_5 次。加酶结 合工作 液 O.lml 370C 避光孵育 30 分钟，洗板_5 次。加入 O.lml 显色底物液，370C 避光孵 育 1 _5 分钟于各反应孔中加入终卜液 O.lml混匀后即可测量 ODq50 值。 (10)Western Blot 检测蛋白表达变化 1)总蛋白的提取:收集细胞，加入冰预冷的蛋白裂解液(lmmol/L PMSF pH7.4) 混匀，超声破碎细胞;4 0C 12000rpm，离心 1 _5min，取上清液，用考马斯亮蓝法 染色， 测定蛋白含量;取上清加入_5* 上样缓冲液(体积比 4: 1) 1000C 沸水中煮_5 min ，-20 0C 备用。 2 ) SDS-PAGE 电泳:按照胶配置方法配制不同浓度 PAGE 胶，电泳置染料抵达分 离胶底部，断开电源，取下凝胶。切下带有要转移蛋白泳道的凝胶，右下角作一标记 以 确定方向及正反而。 3)转膜:剪 1 块与凝胶大小相同的 NC 膜(不能大于凝胶) ，右下角作一标记，浸 泡于转移缓冲液中，大约_5 min o 剪 8 块滤纸，右下角作一标记，其大小略与凝胶相 同 (不能大于凝胶)。将剪好的滤纸在转移缓冲液中浸泡，按阳极到阴极 (从下至上)川页 序安装转移装置:平放底部电极，在底部电极上放置 4 张浸泡好的滤纸，精确对齐，将 NC 膜放在滤纸上，排除气泡。把 SDS-PAGE 电泳凝胶转移到去转移缓冲液中漂洗， 平 放于 NC 膜上，用玻棒挤出所有气泡，在其上再放置 4 张浸泡好的滤纸，排出气泡。 将 上层电极放于夹层物上，连接电源，根据凝胶而积按 1 mA/cm2 接通电源。 4)封 17:转移结束后，在 TBS-T 液内清洗 20min，加 _5%脱脂奶粉，37 0C 封闭 lho _5)一抗孵育:封闭结束后，用 TBS-T 稀释第一抗体，将 NC 滤膜置于其中，4 0C 震荡过夜。 6)显迹:TBS-T 液漂洗 NC 膜 3 次/l Omin，将膜与 TBS-T 稀释二抗孵育，室温下 振荡 1h; TBS-T 漂洗 NC 膜 3 次/lOmin; TBS 液漂 NC 膜 3 次/l Omin X 光胶片 上曝光， 随后显影、定影，用图像分析系统测定蛋白条带的光密度，进行定量分析。 (11)免疫荧光技术检测蛋白表达定位 1)细胞生长贴在玻片上，细胞密度适中，大约 60-7_5%满片即可。 2)取出细胞后用 4%多聚甲醛固定 1 _5 分钟，现用现配。 3) PBS 冲洗。 4) 0.107oTriton 作用 20 分钟。 5) PBS 冲洗。 6) 10%正常血清封闭 10 分钟。: 7)加入一抗，4 度孵育过夜。 8) PBS 冲洗 4 次，各_5 分钟。 9)加入荧光二抗，室温 30 分钟。 10) PBS 冲洗 4 次，各_5 分钟。 11) 90%甘油封片。 12)避光保存，荧光显微镜下观察并照相记录。 3)关键技术( 详见:2) 实验手段 ) (1) CaSR 的 siRNA 的设计及转染平台的建立 由于巨噬细胞是终末分化的细胞，转染相对较难。siRNA 的转染需要注意如下几点: 工纯化 siRNA II 避免 RNA 酶污染 III 避免使用抗生素 W 通过看家基因作为 阳性对照优化转染和检测条件。 (2)细胞内游离钙的测定 激光共聚焦显微镜用于细胞内游离钙的测定，由于钙离子探针 Fluo-3 /AM 是荧光 染料，所以处理后细胞需要避光放置，并减少各组监测时间差，尽量消除染料自身淬 灭 而产生的误差。 (3)细胞内胆固醇的测定 细胞内胆固醇的测定需用高效液相色谱，对于这一设备的应用，安静稳定的检测 环 境、恒流恒温的流动项对于获得可信的实验结果是必须的。胆固醇检测所需的色谱柱 为 Hypersil C 18 柱 (2.1 mmx150 mm 3m)，其运行条件是 :流动相:甲醇一水(90:10);流 速:0.5 mL/min;柱温:室温;进样量:10 匹。 2.可行性分析 (1)理论的可行性众多研究业己证明，巨噬细胞的泡沫化和致炎细胞因子的过度释放 在动脉粥样硬化的发生中起关键作用。我们的前期实验结果己揭示 CaSR 在巨噬细胞 有 功能性表达，并且激活后可以促进巨噬细胞细胞因子的释放。可见，我们的假说在理 论 上是可行的。 C2)研究方法和实验条件的可行性本项目采用的所有实验手段是国内外研究中广泛 采用方法，技术十分成熟，申请者及其他主要实验者己熟练掌握相关技术。哈尔滨医 科 大学病生教研室及基础医学院己具备开展本课题研究所需的实验条件及仪器设备。 (3)研究队伍的可行性本课题组所在研究室在 CaSR 与心血管相关疾病的研究上居 国内外领先水平。到目前为卜，我们实验室己经发现 CaSR 在心肌细胞、血管平滑肌 细 胞、肝细胞和巨噬细胞均有表达，在缺血再灌注损伤、心肌肥大、动脉粥样硬化多种 病 理过程中发挥重要作用。本课题组成员由具有多年分子生物学和细胞生物学科研经验 的 中青年学者组成，前期试验结果己发表 SCI 论文多篇。 (四)本项目的特色与创新之处。 1.本项目首次在巨噬细胞水平将动脉粥样硬化这一病理过程与 CaSR 的功能联系起 来，国内外尚未见类似报道。研究结果将从新的视角进一步动脉粥样硬化的发生机制， 为其有效防治提供新思路和新靶点。 2.本试验采用抑制剂的应用与 siRNA 技术作为平行观察手段，为以上的结论打下夯 实的基础。 (五)年度研究计划及预期研究结果。 1.年度研究计划 1 2012 年 1 月一 2012 年 12 月完成 CaSR 沉默 SiRNA 的构建，并建立稳定的转 染平台，完成对在沉默 CaSR 后 THP-1 源性巨噬细胞的 CaSR 活性的检测。 2) 2013 年 1 月一 2013 年 12 月完成观察 Ox-LDL 对 THP-1 源性巨噬细胞 CaSR 的表达和活性的影响，以及检测 CaSR 的活化是否影响巨噬细胞泡沫化过程。 3) 2014 年 1 月一 2014 年 6 月观察 CaSR 的活化对泡沫化巨噬细胞合成分泌细胞 因子功能的影响 4) 2014 年 7 月一 2014 年 12 月完善研究内容，根据需要补充试验。统计资料， 撰写论文，结题。 2.预期研究结果 (1)研究工作将能够比较系统地阐明 CaSR 与巨噬细胞泡沫化，以 及细胞因子分泌功 能之间的联系，进一步说明 Ca