黄芪黄酮干预脾虚水湿不化大鼠血浆代谢组学研究

-精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 1 黄芪黄酮干预脾虚水湿不化大鼠血 浆代谢组学研究 摘要采用高效液相色谱结合飞行 时间质谱检测正常大鼠、脾虚水湿不化 证大鼠及黄芪黄酮组分干预后大鼠血浆 内源性代谢物变化，获取大鼠血浆代谢 图谱，研究黄芪黄酮组分干预脾虚水湿 不化证的作用机制。采用高脂低蛋白饮 食加负重游泳力竭建立脾虚水湿不化证 大鼠模型，选择 HaloC18 色谱柱，流动 相为 0.05%甲酸水与 0.05%甲酸乙腈， 梯度洗，利用液相色谱串联质谱分析 测定大鼠血浆样品。利用主成分分析法 对造模前后大鼠血浆样本进行代谢轮廓 分析，结合变量投影重要性及显著性分 析等筛选对分组贡献最大的差异标志物 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 2 及相关通路，阐明药物的作用机制。结 果表明，黄芪黄酮组代谢轮廓异于模型 组，而接近于正常组，共鉴定出了包含 甘油磷脂类、鞘酯类、氨基酸类等在内 的 11 种潜在生物标志物，其代谢通路 包括三羧酸循环、甘油磷脂代谢、脂肪 酸代谢及氨基酸代谢等，主要涉及体内 能量代谢和脂肪代谢。黄芪黄酮干预脾 虚水湿不化证大鼠后，宏观指标（如体 重、自主活动）和微观指标（如代谢标 志物、血脂）均明显回调，表明黄芪黄 酮可能主要通过调节能量代谢、脂肪代 谢等途径而发挥健脾利水作用。 中国论文网 /8/view-12899705.htm 关键词黄芪黄酮；脾虚水湿不化 证；代谢组学；高效液相色谱飞行时间 质谱 1 引言 黄芪为临床传统用药，始载于 神农本草经 ，具有健脾补中，利水 消肿等功效1。脾虚证是一组能比较集 中反映脾各种生理功能不足表现的综合 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 3 征候群，临床多采用益气健脾法治疗。 黄芪为“补益脾气之要药 ”，故在临床上 主要用于治疗脾虚发热2、脾虚肠易激 综合征3及其它各种脾虚疾病4 ，但 目前其药效的物质基础及作用机制尚不 明确。 黄芪化学成分多而复杂，主要包 括皂苷、黄酮及多糖类。近代药理研究 结果表明，黄芪黄酮具有改善胃肠功能 5促进水液代谢6 、降低血脂、健脾 7及 抗肿瘤8等功效。本课题组前期研究结 果也表明黄芪黄酮组分对脾虚水湿不化 证大鼠一般状况、血脂等指标均有不同 程度的治疗作用9，表明黄芪黄酮组分 可能是黄芪发挥健脾利水作用的物质基 础。 目前，文献报道的黄芪及其主要 活性成分治疗疾病作用机制的研究几乎 都是从药理作用及分子角度出发。近年 来，随着代谢组学的快速发展1013， 越来越多的研究采用代谢组学方法阐释 中药及复方药治疗脾虚证的机制。陈磊 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 4 等14利用代谢组学方法研究了补中益 气汤治疗脾虚的作用机制。但目前尚无 从黄芪黄酮等活性成分角度对治疗脾虚 水湿不化证的作用机制进行研究的代谢 组学研究报道。本研究从代谢组学角度 出发，利用高效液相色谱飞行时间质谱 结合模式识别技术分析鉴定了黄芪黄酮 组分干预前后脾虚水湿不化证大鼠血浆 内源性代谢物，初步探讨黄芪黄酮组分 治疗脾虚水湿不化证的作用机制，为进 一步研究黄芪健脾利水的物质基础及深 入探寻其作用机制提供科学依据。 2 实验部分 2.1 仪器与试剂 Agilent1260 高效液相色谱（美国 AgilentTechnologies 公司） ，配有在线真 空脱气机、四元泵、柱温箱和检测器； Agilent6230 飞行时间质谱仪（美国 AgilentTechnologies 公司） ，配有 ESI 离 子源和在线 MassHunter 数据采集处理 系统；VORTEXGENIE2 涡旋仪（美国 SI 公司） ；凯特 TD5A 离心机（盐城凯 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 5 特实验仪器有限公司） 。乙腈、甲醇 （色谱纯，美国 Merck 公司） ；甲酸 （色谱纯，美国 Tedia 公司） ；实验用水 为超纯水，由美国 Millipore 公司的 MilliQ 系统制得。 2.2 实验动物 健康 Wistar 大鼠 30 只，体重 （15020）g，雌雄各半，购自鲁抗医 药集团股份有限公司实验动物中心（许 可证编号 SCXK 鲁 20130001） 。 2.3 实验药物 黄芪黄酮组分制法及含量测定： 采用传统水煎煮法，浓缩液经 80%乙醇 沉淀，取上清液回收至无醇味，乙酸乙 酯萃取，制备黄芪黄酮组分。 HPLCPDA 含量测定，色谱柱为 ZORBAXSBC18 柱 （250mm4.6mm，5m，美国 Agilent 公司） ；流动相 A：乙腈，B：0.1%甲酸， 流速：0.5mL/min，线性梯度洗脱： 010min，5%A；1030min，5%40%A ；3060min，40%70%A；6070mi -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 6 n，70% 100%A。进样量： 10L，PDA 检测波长：254nm。结果测 得毛蕊异黄酮含量 7.78mg/g，毛蕊异黄 酮苷含量 4.88mg/g，芒柄花苷含量 3.80mg/g，芒柄花素含量 4.79mg/g。 2.4 大鼠造模方法，评价指标及 分组给药 Wistar 大鼠适应性饲养 1 周，随 机分为正常组（10 只，雌雄各半）和实 验组（20 只，雌雄各半） 。正常组以纯 化饲料饲养，实验组依据中药治疗脾 虚证的临床研究指标原则和中医湿 病学15 ，16用“饮食失节（高脂低 蛋白饮食）+劳倦过度（负重游泳） ”复 合因素诱导，建立脾虚水湿不化证大鼠 模型，按毛色、体重消瘦、自主活动等 指标评分，评价模型。造模成功6后将 实验组随机分为模型组与黄芪黄酮组 （每组各 10 只，雌雄各半） ，黄芪黄酮 组根据 2015 版药典成人日服黄芪最高 剂量（30g/70Kg）及等效剂量系数折算 法换算17，给予大鼠黄芪黄酮提取物 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 7 0.07g/kg，正常组与模型组给予等量生 理盐水，每天灌胃给药 1 次，连续 2 周。 实验过程中各组老鼠出现死亡（正常组 1 只（雄性） ，模型组 2 只（1 雄 1 雌） ， 黄芪黄酮组 2 只（2 雌） ） ，造模结束后 25 只老鼠纳入代谢组学实验用。 2.5 血浆样品的采集与处理 大鼠行腹腔麻醉，腹主动脉取血， 肝素钠抗凝，离心 15min，上清液于 80保存。分析前血浆样本室温解冻， 准确吸取 300L，加入 600L 甲醇，涡 旋 1.5min，4000r/min 离心 15min，上清 液经 0.22m 微孔滤膜过滤后分析。 2.6 实验方法 2.6.1 色谱条件色谱柱为 HaloC18 柱（100mm2.1mm，2.7m，美国 AdvancedMaterialsTechonology 公司） ， 经色谱条件优化，流动相 A 为 0.05%甲 酸，B 为 0.05%甲酸乙腈。梯度洗脱： 010min，90%70%A ； 1020min， 70% 40%A；2028min ，40%A；28 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 8 30min，40%36%A 。进样量 5L， 流动相流速为 0.3mL/min，柱温 25。 2.6.2 质谱条件采用 ESI 源，正离子模式， 干燥气温度 350，干燥气流速 10L/min，毛细管电压 4000V，雾化气 压力为 35psi，碎裂电压 140V，质荷比 扫描范围：m/z501000。选取 m/z121.050873 和 922.009798 作为参比 离子。 2.7 代谢组学数据理与分析 2.7.1 数据质量评价所有血浆样本 取 100L，等量混合，制成质控 （Qualitycontrol，QC ）样本，处理方法 同血浆样品。样品检测前进样 5 次 QC 样本，使系统平衡。每隔 6 个样品插入 一个 QC 样本进行检测，将获得的 QC 样本数据矩阵进行数据分析，观察 QC 样品聚类效果从而评估数据质量。 2.7.2 数据处理原始质谱数据采用 ProteoWizard（http ：/proteowizard.sour /）软件转换成“.mzXML”格 式，利用 XCMS 处理软件进行峰识别、 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 9 峰校准、滤噪和数据简化处理。将包含 化合物保留时间、质荷比信息与峰强度 的结果以“.csv”格式导入 Metaboanalyst3.0（http：/www.metaboa nalyst.ca）网络分析平台进行主成分分 析 （Principalcomponentsanalysis，PCA） 和偏最小二乘判别分析 （Partialleastsquaresdiscriminantanalysis ，PLSDA） ，用各组变量投影重要性参 数 （Variableimportancefortheprojection，V IP）筛选潜在的生物标志物，筛选出 VIP118的变量以 xls 格式导入到 MassProfilerProfessional 软件（美国 Agilent 公司，MPP ）中进行 AnalysisofVariance（ANOVA）分析， 筛选 p1、p0.05 的代谢物作为候选的 潜在生物标志物。通过检索 HMDB（http ：/www.hmdb.ca） 、 METLIN（https：/ ） 、 KEGG（http：/www.genome.jp/kegg/） -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 10 数据库，同时参照文献及质谱鉴定结果 而确定标志物结构。 3 结果与讨论 3.1 一般状况 正常组大鼠反应敏捷，体肌健壮， 摄食正常。 模型组大鼠与正常组相比表现出 自主活动降低（p0.01） 、皮毛干枯、 蓬乱、光泽度降低、体重下降 （p0.01）等状况， 表明造模成功。而与模型组相比， 黄芪黄酮组大鼠神倦乏力、体重 （p0.01） 、自主活动（p0.01）等能量 代谢宏观指标均有改善，表明黄芪黄酮 组分对脾虚水湿不化证有一定的治疗作 用。 3.2 血浆样品的分离与分析 图 1 为各组大鼠及 QC 样本正离 子模式下的总离子流图，各组色谱峰保 留时间基本一致，同一时间色谱峰高度 有差别，表明 3 组大鼠体内的代谢模式 发生变化。但图中某些色谱峰的保留时 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 11 间发生漂移，需要进行数据预处理。 3.3 数据质量评价 QC 实验数据导入 MetaboAnalyst3.0 软件进行主成分分析， QC 数据间聚类紧密，并集中分布于 95%可 信区间内，表明数据质量可靠。为进一 步验证数据质量的可靠性，从 QC 样本 中选取质量数从低到高的 10 个离子 （离子信号用 m/z 与保留时间（min） 表示，计算结果显示各离子的 RSD 值 3%）见表 1，说明数据可靠。 3.4 数据结果分析 无监督 PCA 方法对正常组与模 型组大鼠之间的差异进行统计学分析。 PCA 得分图（图 2A）中模型组与正常 组明显分离，表明两组大鼠血浆代谢模 式发生变化。为进一步寻找 3 组之间的 差异变量，利用 PLSDA 进行有监督的 模式识别，PLSDA 得分图（图 2B）中 3 组组内聚类紧密，组间区分良好，黄 芪黄酮组位于两组之间且趋向于正常组， 表明给予黄芪黄酮组分后，脾虚水湿不 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 12 化证大鼠血浆代谢模式趋向正常。为增 加结果准确性、评判模型的有效性以及 防止过度拟合现象，对 PLSDA 模型进 行排列检验，结果见图 2C。在建立的 模型中，原始值 R2Y=0.949，Q2=0.872，说明模型的拟 合能力和预测能力良好（R2Y 表示模型 的拟合能力，Q2 表示模型的预测能力） ， 50 次随机排列后 R2 和 Q2 的截距为 0.225，-0.378（排列检验对应的 R2 和 Q2 的截距应各小于 0.3，0.0519） ，R2 和 Q2 两者皆在规定范围内，表明所建 模型无过度拟合。 PS07402.eps，BP#TS（HK38H T5”SS 图 2（A）正常组、模型组 PCA 得分图；（B）3 组 PLSDA 得分图； （C）代谢组学模型排列检验法的可靠 性验证结果 3.5 潜在标志物的鉴定 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 13 查询 HMDB，METLIN 和 KEGG 数据库，并与质谱图数据及文献 20 22进行比对，3 组共有 11 种 内源性代谢产物具有显著性差异 （p0.05） ，见表 2。与正常组相比，模 型组中乳酸、磷脂酰胆碱、CM（44 溶血磷脂酰胆碱、鞘磷脂、甘油磷酸胆 碱含量升高，而苯丙氨酸、甜菜碱、丙 氨酸、鞘氨醇及缬氨酸含量CM） 模型组 vs 正常组，T/M：黄芪黄 酮组 vs 模型组 p0.05，p0.01上调； 下调。 M/N：Modelgroupvsnormalgroup，T/M ：flavonoidsofAstragalusgroupvsmodelgr oup，p0.05，p0.01up；down.BG ）WHT5HJ 下降（p0.05，p0.01） ；黄芪黄 酮组与模型组相比 11 种内源性代谢物 含量发生不同程度的回调（图 3） ，表明 黄芪黄酮组分对脾虚水湿不化证有一定 的治疗作用。实验鉴别出的代谢产物， -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 14 联系其相关的代谢通路，构建了相关代 谢网络示意图。 3.6 标记物代谢通路分析 脾虚水湿不化证模型大鼠血浆中乳酸含 量升高，见图 3F。乳酸在机体内的代 谢途径大致有两条：一是完全氧化为 CO2 和 H2O 供能，二是通过糖异生途 径转化为葡萄糖，上述两条代谢途径皆 需要氧气23 。本实验模型组中乳酸含 量显著高于正常组，可能是由于对氧的 利用率下降所致。陈磊等14研究发现 乳酸在脾虚证模型大鼠脾K 中也具有 同样的变化趋势。黄芪黄酮组分干预后 大鼠血中乳酸含量下调，表明黄芪黄酮 组分可能通过纠正低氧状态而发挥治疗 作用。 苯丙氨酸、缬氨酸及丙氨酸皆为 生糖氨基酸。在体内酶的作用下缬氨酸 分解产生琥珀酰辅酶 A。苯丙氨酸在酶 的作用下先生成酪氨酸，后者体内继续 分解代谢最终形成乙酰乙酸和延胡索酸， 丙氨酸参与体内丙氨酸葡萄糖循环途径， -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 15 在脱氨酶的作用下生成丙酮酸，亦可转 化为葡萄糖储存能量23 。相关代谢物 的代谢网络示意图如图 4 所示，3 种氨 基酸的代谢产物为三羧酸循环代谢底物。 本实验模型组大鼠体内 3 种氨基酸含量 下调（见图 3H，J 和 K） ，表明脾虚大 鼠体内氨基酸代谢紊乱而间接导致能量 代谢功能下降22 ，黄芪黄酮组分干预 后，3 种氨基酸水平回调，表明黄芪黄 酮组分干预脾虚水湿不化过程中通过调 节体内氨基酸水平而间接调控三羧酸代 谢发挥治疗作用。 溶血磷脂酰胆碱、磷脂酰胆碱、 甘油磷脂酰胆碱三者皆属于胆碱类化合 物。三者在体内能够促进脂肪燃烧24。 实验过程中，高脂低蛋白饮食造成大鼠 脾虚证候，致饮食减少6，糖摄入及运 化不足，导致糖分解供能障碍。机体为 维持基本生命活动，代偿性动员脂肪分 解供能24，脂肪分解供能过程中体内 上述胆碱类物质含量上调（见图 3A，B 和 E） ，但过度动员导致体内脂 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 16 肪代谢紊乱24 。杨宇峰等21 在利用 代谢组学研究脾肾气虚证时发现，患者 血浆中溶血磷 2 脂酰胆碱与正常组相比 有上调的趋势，与本研究结果一致。黄 芪黄酮组分干预后，大鼠脾虚症状缓解， 饮食增加，能量代谢恢复，不再代偿性 分解脂肪。胆碱类物质在干预后下调， 表明黄芪黄酮组分通过健脾利水作用， 恢复能量代谢而使脂肪代谢恢复正常。 棕榈酰肉碱（图 3D） ，体内长链 脂酰 CoA 与肉毒碱结合转化为脂酰肉 毒碱（如棕榈酰肉碱）进入线粒体内膜， 实现脂肪酸在线粒体内进行 氧化，为 机体供能25 。甜菜碱（图 3I） ，体内可 由胆碱转化而来25 。甜菜碱作为一种 甲基供体，可为甲基化产物肉碱提供甲 基，促进肉碱合成。本实验中模型组大 鼠体内脂肪代谢活跃，导致肉碱含量被 动增加，故棕榈酰肉碱含量升高，而甲 基供体的甜菜碱含量下调。这可能与脾 虚导致的运化水谷精微减少相关，体内 代偿性分解脂肪，故棕榈酰肉碱含量升 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 17 高，而甜菜碱含量下调26。黄芪黄酮 组分干预后，糖代谢恢复正常，脂肪动 员减弱，棕榈酰肉碱在大鼠体内含量下 调，而甜菜碱含量上调。 综上所述，脾虚水湿不化证大鼠 代谢组学研究表明，疾病大鼠体内能量 代谢、脂肪代谢、氨基酸代谢等微观指 标代谢异常，这与前期疾病大鼠体重、 自主活动等宏观指标研究结果相符9。 黄芪黄酮组分可能通过调节上述代谢通 路发挥健脾利水作用，使脾虚水湿不化 证大鼠宏观指标恢复正常，上述代谢组 学研究结果表明，黄芪黄酮组分确为黄 芪药材健脾利水的药效成份之一。 References 1PeoplesRepublicofChinaPharmacopoeia Commission.Chinesepharmacopoeia.China MedicalScienceandTechnologyPublishing House， 2015：303 中华人民共和国药典委员会.中国 药典.中国医药科技出版社，2015：303 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 18 2MINa，CHENQiYu ，WUMinYu，SU NWeiMin.WorldChin.J.Digestol.，2005 ，13（8）：963-966 米娜，陈其御，吴敏毓，孙卫民. 世界华人消化杂志，2005，13（8）： 963-966 3WANGGuangMing，JIAiDong.Pharm.C linicsChin.Mat.Med.，2008，24（1）： 54-55 王光明，姬爱冬.中药药理与临床， 2008，24（1）：54-55 4GAOXiuLan，ZHAORongHua，XIEMi ng，ZHANGJingSheng.Pharm.ClinicsChi n.Mat.Med.， 2013，29（ 2）：111-114 高秀兰，赵荣华，谢鸣，张敬升. 中药药理与临床，2013，29（2）： 111-114 5CUINing，HANBingBing，WANGShiJ -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 19 un.J.ShandongUnivers.Tcm.，2014，38 （6）：596-598 崔宁，韩冰冰，王世军.山东中医 药大学学报，2014，38（6）：596-598 6CUINing，ZHAOWenXiao，JIXuMing ，HANBingBing，GAOJie，HANXu， 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