斑茅成熟种子愈伤诱导及再生体系的建立

-精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 1 斑茅成熟种子愈伤诱导及再生体系 的建立 旭 中国论文网 /8/view-12932609.htm 摘要：为建立斑茅Erianthus arundinaceum （Retz.） Jeswiet.的组织 培养再生体系，以斑茅的成熟种子为材 料，对愈伤组织诱导、芽分化和根分化 中的植物生长调节剂配比及浓度进行了 筛选。结果表明，MS 中添加 0.10.2 mg/L 的 6-BA 与 1.03.0 mg/L 的 2，4-D 愈伤诱导率最高；MS 中添加 0.5 mg/L 的 2，4-D 时胚性愈伤诱导率 达 54.29%。MS 中添加 0.5 mg/L 的 6- BA 与 12 mg/L 的 KT 更易促进芽的 分化，芽分化率 71.11%。1/2MS 中 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 2 添加 20 g/L 的蔗糖促进生根效果最好， 根分化率 96.97%。 关键词：斑茅Erianthus arundinaceum （Retz.） Jeswiet.；愈伤 诱导；再生体系；6-BA；2，4-D；KT 中图分类号：S566 文献标识码： A 文章编号： 0439-8114（2017）08- 1570-03 DOI：10.14088/ki.issn0439- 8114.2017.08.043 Callus Induction of Mature Seed of Erianthus arundinaceus and Establishment of the Regeneration System ZHANG Yu1， YAN Jia-jun1， MAHAI Tian-cai2， BAI Shi-qie1， ZHANG Jian-bo1， ZHANG Jin1， PENG Yan3， Li Da-xu1 （1.Sichuan Grassland Science Academy， Chengdu 611731， China； 2.Sichuan Sihai Brilliant Ecological Environment Engineering Co.， Ltd.， Chengdu 610041， China；3.Department -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 3 of Grassland， Sichuan Agricultural University， Yaan 625014， Sichuan， China） Abstract： For establishing the regeneration system of Erianthus arundinaceus， mature seed of Erianthus arundinaceus was used as test material， the phytohormone combination and phytohormone concentration of callus induction， bud initiation and striking root of Erianthus arundinaceus were screened. The results showed that： The highest callus induction efficiency used the MS-medium adding 0.10.2 mg/L 6-BA and 1.03.0 mg/L 2，4-D. Induction rate of embryonic callus was 54.29% using MS-medium adding 0.5 mg/L 2，4-D. Bud initiation was 71.11% using MS-medium adding 0.5 mg/L 6-BA and 12 mg/L KT. Striking root initiation was 96.97% using 1/2 MS- -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 4 medium adding 20 g/L Cane sugar. Key words： Erianthus arundinaceum（Retz.） Jeswiet.； callus induction； regeneration system； 6- BA； 2，4-D； KT 斑茅Erianthus arundinaceum（Retz.） Jeswiet.是蔗茅 伲Erianthus ）多年生草本植物，具 有适应性强、生物量大、富含纤维素等 特性，为潜在的能源植物。以斑茅作为 能源植物代替玉米、甘蔗、高粱等粮食 作物来生产新型清洁能源燃料乙醇，具 有不与人畜争粮、不与粮争地，降低碳 排放，打破目前以不可再生的石油为主 要能源的局面，缓解能源危机。在美国 与欧洲，柳枝稷（Panicum virgatum） 、 芒属（Miscanthus）作为能生产燃料乙 醇的能源草研究较多1-4；而在中国， 柳枝稷也被引进作为能源草研究5-8， 但对于在中国广泛分布、具有本土优势 的斑茅用于能源开发的研究起步较晚。 Tew 等 9将斑茅植物基因用于改良能源 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 5 用甘蔗，Santiago 等10 就甘蔗及其近 缘种斑茅等作为能源用植物进行了系统 阐述。2009 年，四川草原科学研究院能 源草研究团队开始对中国国内大部分地 区的斑茅资源进行了广泛收集与评价 11，12，同时从斑茅的外部形态13 、 遗传多样性14，15 、能源用潜力评价 方面16做了大量研究，宁祖林等17 、 曾汉元等18 对斑茅进行能源用潜力评 价，但对斑茅纤维发酵工艺研究仍处在 探索性研究阶段19 。 斑茅虽富含纤维素，但其木质素 的特殊结构，使得纤维素酶呈不可逆状 态吸附在木质素上，降低纤维素酶的活 性，使得纤维素本身难以分解20，木 质素含量高成为其生产燃料乙醇的主要 障碍。本研究旨在筛选愈伤组织诱导、 愈伤组织分化的最佳植物生长调节剂配 比及浓度，优化斑茅再生体系，为利用 RNAi 技术创制低木质素斑茅材料提供 技术支撑。 1 材料与方法 1.1 材料 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 6 斑茅野生植株采集于海南昌江路 边荒地（1919N，10858E） ，保存于 四川省大邑县韩场镇四川省草原科学研 究院基地内；斑茅种子于 2013 年 9-12 月收集。 1.2 方法 1.2.1 外植体的处理 以斑茅种子 为外植体，将采集回的斑茅成熟种子用 镊子剥出，无菌水浸泡 12 h 备用。消毒 处理为 70%乙醇浸泡 30 s，无菌水漂洗 23 次，用 0.1% HgCl2 溶液表面灭菌 710 min，无菌水漂洗 35 次。 1.2.2 愈伤组织的诱导 愈伤组织 诱导采用培养基配方为 MS+A（0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/L 2，4-D ） +B（0、0.5、1.0、1.5、3.0、6.0 mg/L 6-BA）+ 蔗糖 30 g/L+琼脂 7 g/L，调节 培养基 pH 为 5.8。其中 6-BA 和 2，4-D 的处理浓度共计 36 个处理组合，每瓶 接种 20 块外植体，每个处理 5 个重复， 置于 25 下暗培养，每隔 20 d 左右更 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 7 换一次新鲜培养基。暗培养 20 d 左右后 统计愈伤诱导率；再培养 4 周后统计胚 性愈伤率，胚性愈伤为颗粒状、致密的 淡黄色或者淡绿色的愈伤组织。愈伤诱 导率=（出愈数/接种数）100%；胚性 愈伤诱导率=（胚性愈伤数/出愈数） 100%。 1.2.3 愈伤组织的继代培养 在暗 培养条件下，将培养出的胚性愈伤组织， 剥离后转到 2，4-D 1 mg/L、6-BA 0.2 mg/L 的培养基上进行继代培养，温度 （251） ，每隔 20 d 左右更换一次 新鲜培养基。 1.2.4 芽分化 经过继代培养，将 结构致密、颗粒状、淡黄色的胚性愈伤 组织转移至分化培养基上，芽分化培养 基为 MS+C（ 0.5、1.0 mg/L 6-BA） +D（0.5 、1.0、2.0 mg/L KT）+ 蔗糖 30 g/L+琼脂 7 g/L，调节培养基 pH 为 5.8，共计 6 个处理组合，每瓶接种 10 块愈伤，每个处理 5 个重复。置 （251）、2 000 lx 下光照培养。每 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 8 隔 20 d 左右更换一次新鲜培养基，逐渐 生出丛生芽，形成无根幼苗，统计分化 率。芽分化率=（分化出芽的愈伤数/接 种的愈伤数）100% 。 1.2.5 根分化 将幼苗转移至生根 培养基中，根分化培养基为 E（MS、1/2MS）+F（10、20、30 g/L 蔗糖）+琼脂 7 g/L，调节培养基 pH 为 5.8，6 个处理组合，每瓶接种正常芽分 化愈伤 10 块，每个处理设 5 次重复。 置（251）、2 000 lx 下光照培养， 每隔 20 d 左右更换一次新鲜培养基，统 计生根率。根分化率=（生根苗数/接种 的幼苗数）100% 。 1.3 数据处理 利用 SPSS 软件对数据进行显著 性分析。 2 结果与分析 2.1 不同浓度的 2，4-D 和 6-BA 对斑茅愈伤组织诱导的影响 从表 1 中可以看出，在 36 个处 理中，有 17 个处理的愈伤诱导率在 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 9 76.67%以上，且 17处理差异不显著； 2，4-D 浓度为 0 mg/L 的 6 个处理未能 诱导出愈伤组织，说明在斑茅的愈伤诱 导中不能缺少 2，4-D；愈伤诱导率在 93.00%以上的处理共有 6 个，其中 6- BA 浓度为 0.2 mg/L 有 4 个，说明该浓 度的 6-BA 更有利于斑茅愈伤组织的形 成。A2B5、A3B3、A3B4 的愈伤诱导 率均为 100.00%，说明这 3 个处理的愈 伤诱导的效果最好，即 2，4-D 浓度为 1.03.0 mg/L。从产生胚性愈伤个数来 看，处理 A1B2 高达 5.00 个，其次是处 理 A4B3（4.67 个）以及 A4B4 和 A3B3（3.33 个） ，除 2，4-D 浓度为 0 mg/L 的 6 个处理没有形成胚性愈伤外， 还有处理 A2B6 未形成胚性愈伤，说明 适宜浓度的 2，4-D 是形成胚性愈伤的 关键。从胚性愈伤诱导率来看，50.00% 以上的处理只有 A1B2；40.00%以上的 处理有 A4B3、A6B2 和 A6B5；2，4-D 浓度为 0 mg/L 的 6 个处理与 A2B6 胚 性愈伤诱导率为 0.00%。故 MS 中添加 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 10 0.10.2 mg/L 的 6-BA 与 1.03.0 mg/L 的 2，4-D 是诱导斑茅愈伤组织的最佳 配比。 2.2 不同浓度的 6-BA 和 KT 对 斑茅愈伤分化成芽的影响 从表 2 中可以看出，处理 C1D2 和 C1D3 的芽分化率最高，均为 71.11%，显著高于其他处理；其后依次 为 C1D1（46.67%） 、C2D1（35.56%） 、 C2D2（33.33%）和 C2D3（28.89%） ， 4 个处理均差异不显著。故 MS 中添加 0.5 mg/L 的 6-BA 与 1.0 2.0 mg/L 的 KT 是促进斑茅愈伤组织分化成芽的最 佳配比。 2.3 不同培养基和不同浓度蔗糖 对斑茅愈伤分化生根的影响 以 1/2MS 和 MS 培养基添加不同 浓度的蔗糖来诱导幼苗生根。从表 2 中 可以看出，分化率最高的处理是 E1F2（ 96.97%） ，其后依次是 E1F3（ 89.75%） 、E1F1（77.78%） 、 E2F1（ 72.22%） 、E2F3（60.61%）和 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 11 E2F2（ 53.33%） 。E1F2 和 E1F3 差异不 显著，但是显著高于其他 4 个处理。故 1/2MS 中添加 20 g/L 的蔗糖促进生根效 果最好。 3 小结与讨论 生长调节剂在组织培养中有着重 要的作用。在斑茅的再生体系研究中， 通过在 MS 培养基中调整生长调节剂种 类和浓度来研究其对斑茅愈伤组织诱导 的影响。结果表明，2，4-D 是斑茅形 成愈伤的限制性因子，即所有 2，4-D 浓度为 0 mg/L 的处理均未产生愈伤， 这与前人的研究结果一致21。斑茅愈 伤组织诱导率与 2，4-D 浓度呈一定相 关性22，在添加 03.0 mg/L 2，4-D 的范围内愈伤诱导率随着 2，4-D 浓度 的增高而增高，当超过 3.0 mg/L 则出现 了抑制现象，且随着浓度的增高，抑制 现象更加明显；同样添加 6-BA 对愈伤 诱导有促进作用，但浓度超过 0.3 mg/L 后也出现了抑制现象。本研究还发现 MS 中添加 0.10.2 mg/L 的 6-BA 与 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 12 1.03.0 mg/L 的 2，4-D 愈伤诱导率最 高， 6-BA 浓度为 0 mg/L、2，4-D 浓 度为 0.5 mg/L 的胚性愈伤诱导率最高， 愈伤诱导率则约为 90.00%，2，4-D 和 6-BA 配合使用的愈伤组织诱导率要高 于单独使用 2，4-D23 。但愈伤诱导率 越高不等于可用的胚