甘露消毒丹及其拆方对感染肠道病毒71型细胞mir―146a和toll样受体4 mrna表达的影响

-精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 1 甘露消毒丹及其拆方对感染肠道病 毒 71 型细胞 miR146a 和 Toll 样受 体 4 mRNA 表达的影响 摘要：目的 探甘露消毒丹及 其拆方对肠道病毒 71 型（EV71）感染 后免疫及炎症反应的调节作用。方法 运用细胞培养技术，设甘露消毒丹组 （甘全方组） 、清残方组、利残方组、 病毒唑组、正常组、模型组，进行病毒 毒力和药物细胞毒性测定后，以药物作 用于 EV71 感染后的 RD 细胞，24 h 后 RT-PCR 检测各组细胞 miR-146a、Toll 样受体 4（TLR4）mRNA 表达。结果 与正常组比较，模型组 miR-146a mRNA 表达降低，TLR4 mRNA 表达升 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 2 高；与模型组比较，甘全方组、清残方 组、利残方组 miR-146a mRNA 表达升 高、TLR4 mRNA 表达降低，病毒唑组 与模型组比较差异不明显；与甘全方组 比较，清残方组 miR-146a、TLR4 mRNA 表达降低，利残方组 miR-146a mRNA 表达升高、TLR4 mRNA 表达降 低；与清残方组比较，利残方组 miR- 146a mRNA 表达升高，TLR4 mRNA 表 达无明显差异。结论 甘露消毒丹可能 通过调节 miR-146a、TLR4 mRNA 表达 从而影响 EV71 感染所致免疫反应，其 中清残方与利残方可能存在互相拮抗效 应。 中国论文网 /6/view-12874472.htm 关键词：甘露消毒丹；拆方；肠 道病毒 71 型；miRNA-146a ；Toll 样受 体 4 DOI：10.3969/j.issn.1005- 5304.2017.03.015 中图分类号：R285.5 文献标识 码：A 文章编号：1005-5304（2017） -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 3 03-0061-05 Effects of Ganlu Xiaodu Dan and Its Incomplete Prescription on Expressions of MiR-146a and TLR4 mRNA in Cells Infected by EV71 AI Bi-chen1， HE Yi- rong1， CAO Rong1， HE Dong2， ZHAO Guo-rong1， HE You-shun1 （1. TCM School of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China； 2. Graduate School of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China） Abstract： Objective To observe the effects of Ganlu Xiaodu Dan and its incomplete prescription on expressions of MiR-146a and TLR4 mRNA in RD cells infected by EV71. Methods With technique of cell culturing， Ganlu Xiaodu Dan therapy group， incomplete Qing prescription therapy group， incomplete Li prescription therapy group， normal cells control group， -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 4 model control group and ribavirin control group were set， and tests for virus toxicity and medicine toxicity in cells were taken， then expressions of miRNA-146a and TLR4 mRNA in these RD cells 24 hours after intervention with medicine were detected. Results Compared with normal cells control group， miR-146a in mRNA model control group decreased and TLR4 mRNA increased. Compared with model control group， miR-146a mRNA in Ganlu Xiaodu Dan therapy group， incomplete Qing prescription therapy group and incomplete Li prescription therapy group all increased while TLR4 mRNA decreased， and differences between ribavirin control group and model control group were not significant. Compared with Ganlu Xiaodu Dan therapy group， both expressions of miR-146a and TLR4 mRNA in incomplete Qing prescription therapy group were lower； -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 5 miR-146a increased and TLR4 mRNA decreased in incomplete Li prescription therapy group. Compared with incomplete Qing prescription therapy group， miR- 146a mRNA in incomplete Li prescription therapy group increased， but expression of TLR4mRNA between them was not significant. Conclusion Ganlu Xiaodu Dan can regulate the immune reactions caused by infection of EV71 by increasing expression of miR-146a mRNA and reducing expression of TLR4 mRNA. There may be antagonism effect between incomplete Qing prescription and incomplete Li prescription. Key words： Ganlu Xiaodu Dan； incomplete prescription； EV71； miRNA-146a； TLR4 基金项目：国家自然科学基金 （81173188） ；湖南中医药大学科技创 新团队项目（2016 年） 通讯作者：贺又舜，E- -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 6 mail： 手足口病是由多种肠道病毒引起 的一种婴幼儿和儿童常见传染病，近年 手足口病的发病率及病死率有增高趋势 1。肠道病毒 71 型（EV71 ）及柯萨奇 病毒 A 组 16 型（CoxAl6）为手足口病 最主要的致病病毒，其中重症手足口病 病情进展快，死亡率较高，多由 EV71 感染引起，致死原因主要为脑干脑炎及 神经源性肺水肿。目前缺乏特异高效的 抗手足口病病毒药物，对手足口病尚无 特异性治疗方法，主要以对症治疗为主， 疗效并不理想。中医学者大多认为手足 口病属中医学“ 湿温”“时疫”“春温”等范 畴，提出用卫气营血辨证或三焦辨证进 行辨治，其中湿热困阻中焦或毒在气分 时，甘露消毒丹为临床常用选方之一2- 3。但甘露消毒丹治疗手足口病的作用 机制尚不十分明确。前期研究发现，甘 露消毒丹能影响 EV71 复制的多个环节 而发挥直接抗病毒作用4-5。本研究以 在免疫调节、炎症反应及抗病毒中发挥 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 7 重要作用的 miR-146a 和 Toll 样受体 4（TLR4）mRNA 为切入点，探讨甘露 消毒丹对 EV71 感染免疫与炎症反应的 调节作用；同时，进行拆方研究，希望 有助于阐释方中有效组分或功能团的配 伍机理，全面阐释其多靶点治疗作用， 或可助于科学简化处方行为要素。 1 验材料 1.1 细胞 人恶性胚胎横纹肌瘤细胞（RD 细胞） ，美国 ATCC 公司，DMEM 培养 液（含 10%牛血清）培养，连续传代 3 次。细胞维持液为含 1%双抗（青霉素、 链霉素） 、2%新生牛血清的 DMEM，消 化液为 0.25%胰蛋白酶溶液。 1.2 病毒 EV71 病毒，武汉大学基础医学 院医学病毒学研究所提供。EV71 接种 于单层 RD 细胞上，加维持液后置于 35 、5%CO2 培养箱培养，待出现 75% 以上的病变时收获，冻融 3 次后吹打离 心，4000 r/min 离心 10 min，取上清液， -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 8 分装后-80 冰箱冻存备用。 1.3 药物及制备 甘露消毒丹（以下简称“甘全方” ， 剂量参照方剂学6记载）：滑石 15 g，茵陈 11 g，黄芩 10 g，石菖蒲 6 g，木通 5 g，川贝母 5 g，藿香 4 g，豆 蔻 4 g，连翘 4 g，射干 4 g，薄荷 4 g。 甘露消毒丹清热解毒残方（以下简称 “清残方”）：黄芩 10 g，薄荷 4 g，连 翘 4 g，川贝母 5 g，射干 4 g。甘露消 毒丹化浊利湿残方（以下简称“利残方” ） ：滑石 15 g，茵陈 11 g，木通 5 g，豆 蔻 4 g，石菖蒲 6 g，藿香 4 g。上述饮 片由湖南中医药大学附属第一医院药剂 科提供，湖南中医药大学潘清平教授鉴 定均为正品。中药常规煎煮法煎煮 2 次， 合并药液，制备成含原药材 0.25 g/mL 的药液，滤纸过滤后再以 0.22 m 微孔 滤膜过滤。病毒唑注射液，规格 100 mg/mL，江苏苏星制药有限公司，批号 0110409，以蒸馏水配制成 3 mg/mL 溶 液。 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 9 1.4 主要试剂与仪器 DMEM 培养基，美国 HyClone 公司，批号 SH30243.01B；胎牛血清， 美国 HyClone 公司，批号 SV30087.02；胰蛋白酶消化液，美国 Sigma 公司，批号 11476232；二甲基亚 砜（DMSO） ，上海生工生物工程公司， 批号 2924B239；四甲基偶氮唑蓝 （MTT） ，上海生工生物工程公司，批 号 TB0799；DnaseI，上海生工生物技 术有限公司；SYBR?PremixExTaq?，宝 生物工程（大连）有限公司；Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit，加 拿大 Fermentas 公司；RT-PCR 试剂盒， 上海生工生物技术有限公司； Trizol，Invitrogen 公司；引物由宝生物 工程（大连）有限公司代为设计、合成。 生物安全柜（Haier 公司） ，超微量紫外 分光光度计（Thermo Fisher 公司） ， Centrifuge5415R 高速冷冻离心机 （Eppendorf 公司） ，荧光倒置显微镜 （Olympus 公司） ，7900HT 荧光定量 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 10 PCR 仪（ABI 公司） ，凝胶成像分析系 统（赛百奥科技有限公司） 。 2 实验方法 2.1 病毒毒力测定 计算半数组织培养感染量 TCID50（Reed-Muench 法） ，采用 100TCID50 进行本实验4-5。 2.2 药物细胞毒性测定 MTT 法计算其细胞存活率（以 不同浓度药物的 OD 值计算） ，以细胞 存活率（% ）为纵坐标、药物浓度为横 坐标（g/mL）绘制非线性回归曲线。以 90%细胞存活率浓度为各药的实验浓度 4-5。 2.3 药物干预实验 取 RD 细胞接种于无菌 6 孔细胞 板，100 L/孔，置于 35 、5%CO2 培 养箱培养 24 h，待细胞长成单层后吸弃 培养液，每孔接种病毒液 50 L，轻混， 待吸附 1.5 h 后吸弃病毒液，将 90%细 胞存活率的甘全方、清残方、利残方、 病毒唑药液 50 L 与 50 L 维持液混合， -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 11 分别加到 RD 细胞上，各设 4 复孔。另 每孔均设模型组、正常组，正常组孔内 加维持液 100 L，模型组孔内接种病毒 液 50 L，吸附 1.5 h 后吸弃病毒液，加 入维持液 100 L。24 h 后收集细胞，加 入 Trizol，待 RT-PCR 检测 miRNA- 146a、TLR4 mRNA 的相对表达。 2.4 RT-PCR 检测细胞 miRNA- 146a、TLR4 mRNA 表达 采用 Trizol 法分别提取甘全方组、 清残方组、利残方组、病毒唑组、模型 组、正常组细胞总 RNA，将所提取的 总 RNA 用超微量紫外分光光度计分别 测定酶标仪波长 260 nm 和 280 nm 处吸 光度（A）值，计算各组 OD260/OD280 值，若样品纯度符合实验要求，则行基 因检测。采用反转录试剂盒与 miRNA- 146a、U6、TLR4、-actin 反转录酶引 物，以 37 、30 min，65 、10 min，42 、60 min，70 、5 min 进 行孵育合成 cRNA，-20 保存。采用 miRNA-146a、U6、TLR4 mRNA、- -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 12 actin 的 SYBR?Premix Ex Taq 进行扩增， 总体系 30 L，分三重复孔，95 、30 s，95 、5 s，60 、30 s，共 40 个循 环（荧光定量 PCR） 。采用 2-Ct 法， 以第一个样为 1，计算待测基因的相对 定量（RQ）值。 3 统计学方法 采用 SPSS19.0 统计软件进行分 析。实验数据以xs 表示，进行方差 分析，若方差齐则组间两两比较用 t 检 验，若方差不齐则用非参数检验的 TamhanesT2 法。P0.05 表示差异有统 计学意义。 4 结果 4.1 病毒毒力测定结果 根据 Reed-Muench 法计算得出 TCID50=10-2.89/mL。 4.2 药物细胞毒性测定结果 通过回归曲线获得各实验用药 90%细 胞存活率浓度为甘全方 0.003 7 g/mL、 清残方 0.002 0 g/mL、利残方 0.008 1 g/mL 和病毒唑 0.64 mg/mL。 4.3 RNA 电泳结果 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 13 6 组 28 s、18 s RNA 的条带均比 较清晰，且 28 s RNA 均比 18 s RNA 清 晰，见图 1。 4.4 RNA 鉴定结果 各组 OD260/OD280 在 1.82.0 之间，见表 1。表明提取的 RNA 污染 较少，纯度较高。 4.5 各组细胞 miR-146a、Toll 样 受体 mRNA 相对定量值 miR-146a、U6、TLR4、-actin 的扩增曲线、融解曲线见图 2图 5。 从各基因的扩增曲线和融解曲线可见， 每个基因甘全方组、清残方组、利残方 组明显降低（P0.01） 。各组 TLR4 mRNA RQ 值比较：模型组、甘全方组、 清残方组、病毒唑组较正常组明显升高 （P0.05，P0.01） ，利残方组与正常组 比较无明显差异；甘全方组、清残方组、 利残方组较模型组明显降低（P0.01） ， 病毒唑组与模型组比较差异不明显；清 残方组、利残方组较甘全方组明显降低 （P0.01） ；清残方组与利残方组比较 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 14 差异不明显；病毒唑组较甘全方组、清 残方组、利残方组明显升高（P0.01） 。 结果见表 2。 5 讨论 手足口病患者存在明显的免疫功 能调节障碍，T 淋巴细胞、细胞因子、 免疫球蛋白及补体水平均可能出现异常， 同时患儿细胞免疫发育尚不成熟，感染 EV71 后则更容易进展为重症手足口病， 也可能因为炎症因子分泌增多而激发全 身炎症反应综合征和脓毒症，进而影响 手足口病的转归，免疫调控成为治疗手 足口病的新靶点。miRNA 是一类长约 为 22 个核苷酸的内源性非编码 RNA， 可以调节代谢、免疫、增殖、分化和癌 变等多种生物学过程，是近年免疫研究 的热点。miR-146 是首个发现在免疫系 统中有调节作用的 miRNA，包括 miR- 146a、miR-146b 两个成员，其中 miR- 146a 在调节固有免疫、炎症反应中发挥 重要作用，如髓系细胞中 miR-146a 能 调节肿瘤坏死因子受体相关因子 6 和白 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 15 细胞介素-1 受体相关激酶介导的炎症信 号通路7-8 ，也可作用于相关靶基因进 而调节可以抗病毒的干扰素通路9。另 有研究发现，miR-146a 调节炎症和免疫 反应的途径之一是下调 Toll 样受体10- 11，后者能介导炎症因子的释放从而 启动炎症应答。 我们前期的研究表明，甘露消毒 丹及其拆方能直接对抗病毒4-5，那么 它们是否可通过 microRNA 调节机体免 疫？有研究表明，甘露消毒丹具有免疫 调节作用，能降低湿热证模型大鼠粒细 胞集落刺激因子水平、增加体内一氧化 氮的含量，影响血清酶活性等12-15， 但尚无其是否能调控 microRNA 的报道。 我们的研究结果