ⅱ型td中突变fgfr3干扰了sox9-β链蛋白回路

在致死性型侏儒发育不良中通过突变 Fgfr3 干扰 Sox9- 链蛋白循环 成纤维细胞生长因子（FGFR）中的突变与各种骨骼先天缺陷有关，但其潜在机制仍不清楚。 在致死性型侏儒发育不良小鼠模型中 FGFR3K650E 被引导在四肢骨中表达，利用该模型， 我们显示了突变受体在肥大前期特异性地阻断了软骨细胞分化。分化阻滞造成正常情况下 产生血管内皮生长因子的肥大软骨细胞严重减少，从而造成原始骨化中心血管化程度不良， 软骨内骨化受到扰乱。我们发现分化阻滞与关节形成中的缺陷，与软骨生成因子 Sox9 的持 续表达，以及生长板软骨细胞中 链蛋白水平和活性下调有关系。与这些离体结果相一致， 人们发现在培养的间质细胞中，FGFR3 K650E 的表达增高了 Sox9 并降低了 链蛋白的水平和 转录活性。Fgfr3 K650E 和 Sox9 在细胞中的共表达使得 Sox9 水平非常高，并共同抑制了 链 蛋白依赖性转录。Fgfr3 K650E 对 Sox9 和 链蛋白的稳定性所起的作用是相反的，它促进 Sox9 的稳定化，而使 链蛋白降解。由于 Sox9 过度表达和 链蛋白删除都可以独立性 地阻滞软骨细胞的肥大性分化并引起类似于 FGFR3 突变引起的软骨发育不全，所以我们的 结果提示在生长板软骨中 Sox9 和 链蛋白水平和活性失调是 FGFR3 引起的骨骼疾病的一 种重要的潜在机制。 INTRODUCTION 成纤维生长因子受体 3（FGFR3）是四个 FGFR 家族成员之一，与 FGF 结合而活化。配 体结合刺激了受体酪氨酸激酶活性，其活性起始了细胞内信号传递级联反应，影响一系列 细胞行为。已经识别出 FGFR3 的许多不同突变，这些突变会不适当地激活其酪氨酸激酶活 性，若出现在种系中，则会引起各种相关的先天性出生缺陷综合征。这些突变包括 FGFR3 跨膜区的 G380R 突变，它引起经典的软骨发育不全，受体链接区的 R248C 突变，它引起更 为严重的型致死性发育不良（TD） ，而激酶区域的 K650E 和 K650M 则引起 TD和重型 软骨发育不全性发育延迟与黑棘皮症（SADDAN） 。型 TD 突变（K650E）后果最严重，造 成胚胎或新生儿死亡（1，2） 。各种 FGFR3 突变引起的各种骨发育不良类型中，有可观的 相似性与重复性，它们的严重程度与突变受体的异常过度活跃程度有广泛的联系（3） 。这 些发现提示突变以一种定量的形式影响着一种普遍的潜在机制。 FGFR3 突变引起的骨发育不良的一个标志性特点是长骨出现显著缩短。在正在生长的 骨中，FGFR3 在软骨增殖区表达，很多证据提示由 FGFR3 过度活化性突变引起的骨发育不 良综合征中，骨的纵向生长减弱，至少有部分原因是软骨细胞增殖受到抑制（1） 。对 SADDAN 和 TD小鼠模型（4 ，5 ）的分析提示软骨内骨化和骨生长受到妨碍，跟软骨细胞 终末分化抑制也有关系。尽管有这些发现，但在这些疾病综合征中，处于突变 FGFR3 下游 且与软骨细胞增殖和分化缺陷有关的分子机制仍然不清楚。 在小鼠肢体中，软骨发生大约始于胚胎期第 10 天（E10）的肢芽中心，该处未分化间 质细胞浓密聚集。在软骨前浓集细胞群中高迁移率群体（HMG）转录因子 Sox9 被诱导表达， 并在软骨的形成中起关键作用（6，7 ） 。Sox9 对软骨细胞最初的产生是必需的，而它对软 骨模板的进一步发育和生长也起重要作用（79） 。生长板内软骨细胞增殖扩张并分化，从 而完成软骨模板的生长。在生长板中，Sox9 在软骨祖细胞或 “静息”软骨细胞中，正在增 殖的软骨细胞中，以及处于分化初始阶段的软骨细胞中（肥大前软骨细胞）表达，但在分 化成非增殖性细胞和终末分化的肥大软骨细胞中突然下调了（10，11 ） 。肥大软骨细胞的产 生对软骨内成骨的支持作用，至少有一部分是通过肥大软骨细胞产生一种细胞外基质和诸 如血管内皮生长因子 A（Vegfa）这样的生长因子来实现的，这种生长因子可以引导血管与 成骨细胞侵入软骨中（12） 。肥大软骨细胞中 Sox9 的下调被认为在软骨内生长和骨化过程 中发挥关键功能，因为在生长板软骨细胞中强迫性表达 Sox9 会抑制肥大软骨细胞的产生和 Vegfa 的表达，引起骨化前端血管化程度不够和严重的软骨发育不全（7，8 ） 。这些发现有 许多支持性证据，其中一份近期的研究显示 Sox9 直接抑制 a1 型胶原（Col10a1）基因的 表达，这种基因的表达始于肥大前软骨细胞，同时伴有 Sox9 的下调（13） 。但是，也有证 据表示 Sox9 在促进肥大软骨细胞分化中起作用。Ikegami 等人和 Dy 等人发现在软骨细胞中 删除 Sox9 会引起细胞凋亡，以及 Col10a1 阳性细胞的丧失（9，14） 。总的来说，这些研究 提示维持正常的 Sox9 调控对于生长板的功能十分关键，它的提前终止表达和外源性表达都 可以干扰软骨细胞的分化与软骨内骨化。 Sox9 除了直接调控各种促进和确定软骨细胞特性与行为的基因以外（15） ，还与 链 蛋白间接作用， 链蛋白是一种多目标蛋白质，它的作用是充当 Tcf/Lef 转录因子的辅因 子，驱动经典 Wnt 信号传递（16） 。Sox9 和 链蛋白之间的相互作用可以引起它们彼此呈 蛋白酶体降解（mutual proteasomal destruction） ，并且人们发现 Sox9 在细胞中过度表达可 以有效地抹掉 链蛋白（17，18） 。Sox9 也可以不依赖 链蛋白降解而抑制 链蛋白转 录活性，这可能是通过干扰 链蛋白与 Tcf/Lef 相互作用来实现的（18） 。Sox9 下调 链 蛋白水平的能力与它的活性可能在骨骼发育早期是相关的，在骨骼发育早期 Wnt/ 链蛋 白信号传递对引导间质祖细胞向成骨细胞谱系进行命运决定起着重要作用（19-21） 。但是， 尽管 链蛋白在未分化肢芽间质中起着抑制软骨细胞谱系的作用（19，20 ） ，但之后它在 生长板中正在增殖和正在分化的软骨细胞中表达，在促进肥大性分化和软骨内骨化方面起 作用（17，22 ） 。与 Sox9 在软骨细胞中强迫表达所造成的后果类似，在生长板软骨细胞中 条件性删除或抑制 链蛋白会引起软骨细胞增殖减少，肥大软骨细胞分化延迟，Vegfa 表 达受抑制（17， 23，24） 。将上述 Sox9 删除与过表达的结果综合起来，这些研究支持了 Sox9 与 链蛋白相互作用调控生长板中软骨细胞扩张与适当分化的观点。除此之外，FGF 信号传递可以调控 Sox9 表达，这一发现唤起了这样一种可能性，即生长板中 Sox9 表达的 失控及其对 链蛋白水平和活性的影响，可能参与造成了软骨内骨化缺陷，从而与由 FGFR3 突变引起的骨骼发育不良有关。 利用 TD小鼠模型，我们发现突变 Fgfr3 引起 Sox9 阳性软骨细胞开始扩张，而生长板 软骨细胞不能向肥大软骨细胞进展，以及软骨内骨化不良与 Sox9 持续表达和原始骨化中心 血管化程度很差有关。TD 小鼠生长板和关节软骨中，Sox9 持续表达与 链蛋白水平降 低和经典 Wnt 转录活性降低有关，而生长板中出现软骨内骨化缺陷，关节软骨中出现关节 形成缺陷。与这些活体数据相一致，人们发现在培养的细胞中 Fgfr3K650E 的表达通过增加 Sox9 蛋白的稳定性并有效阻滞 链蛋白依赖性转录活性，促进了 Sox9 的累积。我们的数 据提示 链蛋白-Sox9 之间的动态平衡被过度活化的 FGFR3 突变破坏，这构成了 TD的一 个重要的潜在机制，并可能是 FGFR3 突变引起的其它骨骼疾病的潜在机制。 RESULTS 肢芽间质中 FGFR3K644E 条件性活化 为了研究 TD 中软骨内骨骼发育，我们使用了含有 K644E（相当于人类中的 K650E） 敲入突变的小鼠，这种突变在 Stop/flox 盒被 Cre-依赖性移除时开始表达（5 ） 。这些小鼠与 Prx1-Cre 小鼠交配（26）以优先靶向（for preferential targeting to）早期肢芽间质。在 E15.5 和 E18.5 时用阿尔新蓝/茜素红对 Prx1-Cre;TD 小鼠的肢体骨骼染色分析（Fig.1A，1B ） ，结 果显示骨骼成分缩短，其特点是原始骨化中心非常小，长骨中软骨与矿化骨之比很大。 Prx1-Cre;TD 小鼠胫骨的整个生长板中，从骨骺头部和关节区域到邻近原始骨化中心的区 域，含有紧密填塞的软骨细胞，邻近原始骨化中心的区域正常情况下可以找到独特的肥大 细胞（Fig.1C） 。这些表型类似于在那些从种系细胞开始表达 Fgfr3K644E 的小鼠中已经描述过 的表型（5） ，除此之外，Prx1-Cre;TD 小鼠的肱骨与尺骨（肘关节）和胫骨与股骨（膝关 节）的关节面之间，还一致出现融合（Fig.1A-C） 。尺骨/ 桡骨和胫骨 /腓骨远端的关节没有 融合（Fig.1B） 。与 FGFR3K644E 在种系中的活化不同，Prx1-Cre;TD 小鼠可以成活，在出生后 5 天（P5）和 P20 时的骨染色显示软骨模板完全骨化，但长骨成分仍然非常的短，并且还 是存在膝关节和肘关节融合（未显示） 。 在骨骼发生早期，Fgfr3 和 Sox9 表达失控，软骨细胞分化受到干扰 Iwata 等人的研究显示 TD小鼠在 E14.515.5 时肢体骨骼成分中有软骨分化缺陷和形 态学缺陷。这些数据提示 TD中疾病过程开始的时间早于软骨内骨化开始的时间。为了探 究这种可能性，我们在 E11.5 和 E12.5 时用原位杂交技术检测了 Fgfr3 和软骨细胞与成骨细 胞标志物的表达情况，那是肢芽期，软骨性浓集细胞正在扩张并排列形成一定模式的软骨 成分。这种阶段中表达 Fgfr3 的位置也表达 Sox9，Sox9 的表达定义了正在发育中的软骨 （Fig.2A-D） 。事实上，在 E12.5 而非 E11.5 时，Sox9 在末段（autopod）软骨原基中表达范 围更广，这提示 FGFR3K644E 促进了 Sox9 的表达，以及/ 或细胞定型为软骨生成性谱系后的软 骨形成。Runx2 ，编码成骨谱系的核心调控因子，以及 Gdf5，编码转化生长因子 超家族 的一种配基，涉及软骨生成和关节形成，这两种基因的表达情况，对照组与 Prx1-Cre;TD 小鼠组都是一样的（Fig.2E-H） 。 在 E14.5 时，对照组胫骨中生长板结构已经确定，其特点是出现已经分化的 Col10a1 阳 性增大/肥大软骨细胞，并且通过 von Kossa 染色可见骨领开始矿化（Fig.2I，2J ） 。同龄的 Prx1-Cre;TD 小鼠的胫骨更大，其中段也同样表现出强烈的 Col10a1 表达，但矿化比较少， 并且 Col10a1 阳性细胞保持着更为紧密的排列，没有成功地完全变成对照组胫骨中所见的 那种增大的肥大形态（Fig.2I， 2J，还可见 Fig.1C，3L，M ） 。这一阶段的对照组和 Prx1- Cre;TD 小鼠组中胫骨中，都不见软骨旁 Col1a1 阳性成骨细胞的侵袭及其相关性软骨内骨 化（Fig.2J ） 。在对照组与 Prx1-Cre;TD 小鼠组胫骨中，Fgfr3 和 Sox9 都是共表达的，在生 长板增殖区表达程度最高（Fig.2K，2L） 。在对照组胫骨中，Fgfr3 和 Sox9 的表达仅在肥大 前细胞中与 Col10a1 的表达相重叠，肥大前细胞的识别特点是表达 Indian Hedgehog（Ihh） 和型甲状旁腺素受体（Pth1r） （Fig.2M，2N，见虚线所示区域） 。与之相比，Prx1- Cre;TD 小鼠组胫骨中 Fgfr3 和 Sox9 的表达进一步扩展到了中段，并与全部或大部分 Col10a1 阳性细胞重叠（Fig.2K，2L） 。Prx1-Cre;TD 小鼠组胫骨中呈 Col10a1 阳性的整个中 段都表达 Ihh 和 Pth1r（Fig.2M，2N ） 。这些数据提示突变 Fgfr3 的功能是特异性地抑制肥大 前细胞向肥大细胞的分化。 Iwata 等人之前注意到 E15.5 时 TD模型小鼠中股骨生长板增殖增加，他们用的方法 是 3H胸腺嘧啶结合与增殖细胞核抗原标记（5） 。但是，我们用 BrdU 结合技术发现 E14.5 时的 Prx1-Cre;TD 小鼠组胫骨生长板的增殖情况仅有些许或没有变化（ Supplementary Material Fig.S1） 。因此，在 E14.5 时的 TD胚胎中观察到的软骨成分的大小增加，可能与 增殖轻微增加与分化阻滞都有关系，这造成肥大前细胞大量累积。另外，这些数据提示在 E14.5 时（以及之后的阶段；Fig.1A，1B）TD近端骨骼成分观察到的明显曲度可能与软骨 细胞分化缺陷有联系，这种缺陷开始于软骨内骨化之前。 Sox9 持续表达，Vegfa 表达减少，血管化程度减少，与 Prx1-Cre;TD 小鼠的软骨内骨化缺 陷有关 在 E16.5 时，功能完全的生长板驱动软骨内骨化以及旺盛的骨生长。在这一阶段，对 照组胫骨从静息区到肥大前区的这个范围中，FGFR3 RNA 和蛋白质与 Sox9 RNA 和蛋白质共 表达，这一范围的识别特点是表达 Ihh 和 Pth1r，但这种表达绝不扩展到肥大区（ Fig.3A-F， 红线区分出肥大区） 。在 Prx1-Cre;TD 小鼠生长板中，Fgfr3 RNA 与蛋白质和 Sox9 RNA 与蛋 白质也是共表达的，但它们的表达异常扩展到了骨化前端（Fig.3A-D，H ，I） 。另外，在 Prx1-Cre;TD 小鼠生长板中表达 Ihh 和 Pth1r 的细胞数量上有增加，这一细胞群也扩展到了 骨化前端（Fig.3E，3F） 。Vegfa 是 Sox9 抑制的直接靶点，正常情况下主要在 Sox9 阴性的肥 大细胞中表达（8） ，对 E16.5 时 Prx1-Cre;TD 小鼠生长板中 Vegfa 的表达情况进行检测， 发现它仅在紧邻骨化前端的少量细胞中表达（Fig.3G） 。这些结果提供了更多的证据证明突 变 FGFR3 在肥大前阶段引起分化阻滞，从而造成肥大前细胞不能产生肥大软骨细胞，而是 堆积起来。 与 Vegfa 产量减少相一致，E16.5 和 E18.5 时，在对照组小鼠中原始骨化中心特征性表 达 PECAM（CD31）的丰富的脉管系统，在 Prx1-Cre;TD 小鼠中也大量消失（Fig.3J，3K） 。 对 E16.5 时的 Prx1-Cre;TD 小鼠进行组织切片还发现，软骨-骨连接处附近缺乏含有红细胞 的血管（Fig.3L ） 。位于软骨旁的成骨细胞迁入软骨模板中， 这种软骨模板是由肥大软骨细 胞沿血管痕迹铺开而成。与血管化程度降低和成骨细胞缺陷性迁移相一致，TD小鼠胫骨 原始骨化中心的成骨细胞标志基因 Col1a1 和 骨钙素 （Osc ）也减少了，特别是在软骨-骨连 接处（Fig.3M，3N） 。MMP13 编码一种在长骨发育期间涉及肥大软骨重吸收和新沉积骨小 梁重构的蛋白酶（28，29 ） ，在 Prx1-Cre;TD 小鼠胫骨中它的表达似乎没有变化 （Supplementary Material Fig.S2） 。Prx1-Cre;TD 小鼠胫骨的原始骨化中心有很多被抗酒石 酸磷酸酶染色的破骨细胞（Supplementary Material Fig.S2） ，但之前没有被注意过（5） ，这 可能是骨化不良的一个间接后果。 综合起来，这些数据提示 TD小鼠中软骨内骨化不良背后的一个关键机制是肥大前阶 段的分化阻滞，使得 Vegfa 阳性肥大细胞不能充分产生，并阻止了血管化，还伴有成骨细 胞迁移到软骨模板中。 生长板与关节软骨细胞中 链蛋白和经典 Wnt/ 链蛋白活性下调 上面描述的数据提示了 TD中 Sox9 持续表达与肥大前分化阻滞有关。之前的研究显 示 Sox9 蛋白水平受 链蛋白负性调节，而在生长板中删除 链蛋白可以阻止软骨细胞肥 大，引起与 TD类似的软骨发育不全表型（17，18 ） ，这唤起了这样一种可能性，即 TD 生长板中异常的 链蛋白活性可能参与产生了分化阻滞。因此我们做了含有 -半乳糖苷 酶报道基因（TOPGal） （30）的 Prx1-Cre;TD 小鼠，它可以指示经典 Wnt/ 链蛋白活性， 然后我们在发育阶段的肢体骨骼中检测了 TOPGal 活性。在 E12.5 时，对照组胚胎中 TOPGal 活性最强的区域是前肢肢芽和后肢肢芽的中部与近端（Fig.4A） ，正好是桡骨/尺骨和胫骨/ 腓骨软骨模板正在形成的区域，这个区域 Sox9 水平低（ Fig.2D） 。与之相比，对照组小鼠肢 芽末段（autopod ）正在发育的骨骼中，染色程度就最低，而这一区域 Sox9 水平很高 （Fig.4A ） 。与 Fgfr3K644E 抑制 链蛋白活性相一致，E12.5 时 Prx1-Cre;TD 小鼠肢芽与对照 组小鼠肢芽相比，TOPGal 染色较低（Fig.4A） 。在 E14.5，而软骨内骨化还没有开始的时候， 对照组胚胎近端胫骨切片显示广泛 TOPGal 染色，而在同龄 Prx1-Cre;TD 小鼠胫骨切片中 染色程度降低（Fig.4B） 。E15.5 时前肢全组织染色显示骨骼成分中 TOPGal 染色广泛减少 （Fig.4C ） ，而 Prx1-Cre;TD 胚胎 E15.5 切片显示生长板软骨细胞和关节软骨细胞中染色都 减少了（Fig.4D） 。E18.5 时近端胫骨全组织染色同样显示生长板区域和胫股骨关节区域 TOPGal 染色减少（Fig.4E） 。 对 E16.5 胫骨近端生长板的进一步分析显示，有 TOPGal 和 -链蛋白染色的细胞出现 在增殖区，紧邻骨化前端的肥大区，在该区中 链蛋白被认为有助于 Vegfa 转录（24） ， 还有骨骺头部区域，该区域是一般情况下关节软骨和关节发生的位置（Fig.4F，4G，更多图 片见后） 。c-Myc 是 链蛋白的一个靶标基因（31） ，也是生长板中软骨细胞增殖的一个关 键调控者（32） ，在 E16.5 的 Prx1-Cre;TD 胚胎生长板中其表达是下降的（ Fig.4H） 。与 链蛋白和 c-Myc 的低水平相一致，E16.5 时的 TD生长板中的增殖显著降低（ Fig.4I） 。由于 E14.5 时细胞增殖没有受到显著影响（Supplementary Material, Fig.S1） ，这些数据提示软骨 细胞增殖下降需要的是慢性 FGFR3 信号传递。也许更重要的是，这些数据显示突变 Fgfr3 表达， 链蛋白表达水平和活性降低，以及 Sox9 下调失败之间存在很强的联系。 Prx1-Cre;TD 小鼠中关节形成缺陷与 链蛋白下调和 FGFR3 及 Sox9 没有恰当地表达有关 系 为了探究 Prx1-Cre;TD 胚胎中膝关节缺陷性形成，我们检测了关节形成与关节软骨的 标志基因，同时还另外做了组织学鉴定。在 E14.5 时的对照组和同龄 Prx1-Cre;TD 胚胎中， 其膝关节的细胞都表达关节特异性标志基因 Gdf5，但在 TD关节中这种表达更为分散， 更不明确（Fig.5A） 。对照组胚胎关节腔中有凋亡细胞，但在 E14.5 时的 Prx1-Cre;TD 胚胎 预定膝关节形成区域非常清晰地缺少 TUNEL 染色（Fig.5B ） 。组织学检验发现形态学变化在 Prx1-Cre;TD 胫骨的膝关节形成起始部位是一致的，但胫骨软骨与股骨软骨无法分开 （Fig.5C ，5D） 。关节软骨有独特的形态，在关节表面结构更为紧密，而 Prx1-Cre;TD 小鼠 预定膝关节形成区域没有这些特征（Fig.5C,5D，红箭头所示） 。这些数据与之前显示转基因 表达 Fgfr3G380R 引起关节融合的研究结果相一致（33） ，提示突变 Fgfr3 可以阻止软骨细胞在 预定形成关节的区域进入关节软骨命运，这种细胞命运是关节形成所必需的。 除了其在生长板中的功能，经典 Wnt/ 链蛋白活性在滑液关节软骨发育和维持方面 也起重要作用。在缺乏 链蛋白的情况下，关节软骨易于分化成另一种软骨细胞，这种细 胞的形态学特点和分子标志物都更像是生长板软骨细胞，并且引起关节融合（3335） 。前 面的结果显示 链蛋白水平和经典 Wnt/ 链蛋白活性在生长板中是下调的，与这些结果 相一致，TOPGal 染色以及 链蛋白水平在预定形成关节的区域也是下调的，特别是在肱 骨和尺骨的骨骺表面，在该处有关节软骨细胞（Fig.5E，5F） 。除了 链蛋白减少，关节软 骨标志基因润滑素（蛋白多糖 4）和黏着斑蛋白在 Prx1-Cre;TD 胚胎预定关节形成区域的 表达程度也是较低或缺失的（Fig.5G，5H） 。在对照组胚胎正在形成的关节附近的细胞中可 以散发性发现 FGFR3，但在关节边界的关节软骨处没有发现 FGFR3（Fig.5I ） 。与之相比， Prx1-Cre;TD 胚胎预定形成关节的区域中，即使不是全部，也是大部分细胞都强烈表达 FGFR3（ Fig.5I） 。Sox9 RNA 及蛋白质，以及 Sox9 靶标基因 Col2a1 的表达模式与 Fgfr3 类似 （Fig.5J-L） 。最后，Wnt/ 链蛋白活性在促进关节软骨细胞增殖方面起重要作用（35） ，但 对照组膝关节形成区域独特的细胞增殖模式在 Prx1-Cre;TD 胚胎中丧失掉了（Fig.5M） 。总 的来说，这些结果表明 TD 中，Sox9 的表达和 链蛋白缺失伴关节形成失败之间有联系。 Fgfr3K650E 增加了等待降解的磷酸化 链蛋白的储存量，降低了总体 链蛋白水平 TD生长板和关节中 链蛋白水平和经典 Wnt 信号传递被下调了，这一观察结果促 使我们探究在小鼠多能间质细胞系 C3H10T1/2 中，外源性 FgfrK650E 对 链蛋白水平与活性 以及 Sox9 表达所产生的作用。Fgfr K650E 对 链蛋白 mRNA 水平影响很小或没有（数据未列 出） ，但它引起内源性 链蛋白水平下降（Fig.6A） 。 链蛋白在 S33，S37 ，T41 处的磷酸 化促使其蛋白酶体性降解（proteasomal degeneration） （原文为 proteosomal，意为变幻虫 的，应为作者笔误译者注） ，并且尽管在表达 FgfrK650E 的细胞中总体 链蛋白水平很 低，磷酸化的 链蛋白（p-catenin）的水平还是可以与对照组相比（Fig.6A） 。 C3H10T1/2 细胞中 Sox9 水平较低，与之相比表达 FgfrK650E 的细胞中 链蛋白水平轻度增高。 表达 FgfrK650E 的细胞中 Tcf4 和 Tcf1 的表达程度下降，但 Lef1 表达水平增高（Fig.6A） ，并且 出现在细胞核中（Supplementary Material, Fig.S3） 。 FgfrK650E 除了减少 链蛋白的产量，还改变其在亚细胞水平上的分布（ Fig.6B） 。对照 组细胞中 链蛋白大部分扩散在胞浆中，以及在质膜上局限分布，与对照组细胞不同，表 达 FgfrK650E 的细胞中 链蛋白往往异常地跟胞内小泡有关系（ Fig.6B） 。在未转染的细胞和 表达 FgfrK650E 的细胞中，大部分但不是全部细胞的细胞核中可见 Sox9，但在表达 FgfrK650E 的 细胞中染色一般更强烈些（Fig.6B） 。另外，稳定表达 FgfrK650E 的 C3H10T1/2 细胞其形态有 很大的变化。这些细胞更小，核质比更大，通过 Tubulin 免疫荧光染色提示其细胞骨架结 构高度无组织（Fig.6B） 。 为了进一步探究表达 FgfrK650E 的细胞中不稳定的 p- 链蛋白与总 链蛋白之比的明显 升高，是如何与这些细胞中观察到的（ 链蛋白）水平降低联系起来的，我们在用蛋白酶 体抑制剂 epoximycin 处理细胞后，首先检验了 p- 链蛋白的累积。与对照组细胞相比，表 达 FgfrK650E 的细胞中 链蛋白显著减少，而在添加 epoximycin 后 5 小时 链蛋白水平增 高（Fig.6C ） 。与表达 FgfrK650E 的细胞中 p- 链蛋白产量旺盛相一致，表达 FgfrK650E 的细胞 与对照组细胞相比，p- 链蛋白与总 链蛋白相比累积程度高得多（ Fig.6C and D） 。为了 检验表达 FgfrK650E 的细胞中不稳定的 p- 链蛋白储量增加是否与 链蛋白降解增加有关， 我们用放线菌酮（CHX）阻断蛋白质合成，从而确定了蛋白质的半衰期。表达 FgfrK650E 的细 胞中的结果再次表明总 链蛋白水平强烈下降，但降解速率并未明显加快（Fig.6E，以及 其它未列出的数据） 。但是，表达 FgfrK650E 的细胞中 p- 链蛋白消失的速度（比 链蛋白 降解速度）快了大约 7 倍（Fig.6F） 。这些结果提示 FgfrK650E 至少在一定程度上，通过更为 迅速地产生和降解不稳定的 p- 链蛋白来降低 链蛋白水平。 间质细胞中 FgfrK650E 抑制 链蛋白依赖性转录 之前已经有人发现突变活化的 FGFR3，和 FGF2 刺激一样，可以诱导软骨细胞和 C3H10T1/2 细胞中的 Sox9 转录（25） 。但是，我们发现 C3H10T1/2 细胞中 FgfrK650E 只是轻微 升高了 Sox9 RNA 水平，同时发现 FGF2 刺激在对照组细胞或表达 FgfrK650E 的细胞中对 Sox9 RNA 水平影响很小或没有（Fig.7A）。与之相比，表达 FgfrK650E 的细胞在缺乏配体的情况下 Sox9 蛋白质水平增高，在那些受 FGF2 刺激的细胞中 Sox9 进一步增高（Fig.7A）。在表达 FgfrK650E 的细胞中 链蛋白处于低水平，FGF2 刺激后其水平仍然很低。在对照组细胞中 FGF 信号传递如预期的那样诱导了 Sprouty2（1），而在表达 FgfrK650E 的细胞中这种诱导更 强烈（Fig.9A），这与 FgfrK650E 维持配体结合强反应性的能力是一致的（ 5）。 为了评估 FgfrK650E 和 FGF2 刺激对 链蛋白依赖性转录活性的影响，我们在 C3H10T1/2 细胞中做了 FgfrK650E 表达载体和 TOPFlash 报导基因（受三处近端经典 TCF/LEF 结 合位点调控的荧光素酶）的一过性转录。Fgfr K650E 强烈抑制了这个报道基因以及另一个受 c- Myc 驱动的报道基因的 链蛋白依赖性转录活性（36）（Supplementary Material, Fig.S4）。 TOPFlash 活性抑制相当于 链蛋白依赖性降低以及 Sox9 丰度增加（Fig.7B）。FGF2 的加 入本身抑制了 链蛋白活性，并增强了由 FgfrK650E 驱动的抑制（Fig.7B ）。更为强力的 链蛋白活性抑制伴有 Sox9 的增高和 链蛋白的降低（Fig.7B）。使用突变 TCF/LEF 结合位 点的报道基因（FOPFlash），发现其对 链蛋白或 FgfrK650E 没有反应（数据未列出）。 为了确定 C3H10T1/2 细胞中内源性 Sox9 是否参与了由 FgfrK650E 驱动的 链蛋白活性 抑制，我们利用连续转染流程做了报道基因分析，在该流程中细胞首先转染 链蛋白， FgfrK650E 和 TOPFlash 报导基因结构，然后转染 Sox9 特异性或非特异性 siRNA。之所以需要 这种连续转染策略，是因为需要不同的转染流程来诱导质粒和 siRNA 在 C3H10T1/2 细胞中 表达。利用这一策略 FgfrK650E 介导的 链蛋白活性抑制没有那么强烈，但可以敲减 Sox9， 并减少 链蛋白驱动的对 TOPFlash 活性的抑制，特别是在共转染了 FgfrK650E 的细胞中 （Fig.7C）。这些数据提示 Sox9 至少部分参与了 FgfrK650E 介导的 链蛋白抑制。 Fgfr3K650E 稳定 Sox9 蛋白，并与 Sox9 协同抑制 链蛋白依赖性转录 Fgfr3K650E 和/或 FGF2 刺激引起 Sox9 蛋白质在 Sox9 RNA 不升高的情况下升高（ Fig.7A） ， 这唤起了一种可能性，即突变受体可能在转录后水平调控 Sox9。为了进一步验证这个问题， 我们将表达 Sox9 的质粒单独转染到 C3H10T1/2 细胞中，或与拷贝数增加的，表达 Fgfr3K650E 的质粒一起转染。额外加入 Fgfr3K650E 以剂量依赖型方式显著诱导了 Sox9（Fig.8A） 。Sox9 增 高伴有 链蛋白丰度的下降（Fig.8A） 。为了确定 Sox9 的增高是否跟 Sox9 蛋白稳定程度增 高有关，我们用 CHX 蛋白酶体抑制做了一系列实验，确定了有或无外源性 Fgfr3K650E 细胞中 Sox9 的半衰期。这些实验结果显示 Fgfr3K650E 使 Sox9 的半衰期增加了约 3 倍（Fig.8B and C） 。 为了更加直接地检验 Fgfr3K650E 对 Sox9 和 链蛋白交叉调控的影响，我们将细胞单独 转染 Sox9，或转染 Sox9 与 链蛋白，或转染 Sox9 与 链蛋白和 Fgfr3K650E。与之前的结 果相一致（17， 18） ， 链蛋白抑制了 Sox9 水平，这种抑制可以通过表达更多的 Sox9 来 克服掉（Fig.8D） 。但是，在有 链蛋白的情况下，转染共表达 Sox9 与 Fgfr3K650E 的质粒， 与单纯转染更多表达 Sox9 的质粒相比，更能升高 Sox9（Fig.8D） 。Sox9 如预料的那样减少 了 链蛋白，而加入 Fgfr3K650E 进一步减少了 链蛋白（ Fig.8D） 。将共转染 Fgfr3K650E 和 Sox9 质粒的细胞用蛋白酶体抑制剂 MG132 处理，与单纯表达 Fgfr3K650E 的细胞相比， 链 蛋白增高程度更强劲（Fig.8E） 。总而言之，这些结果提示间质细胞中 Fgfr3K650E 和 Sox9 可以 协同降低 链蛋白的丰度。 为了确定 Fgfr3K650E 和 Sox9 是否也可以协同抑制 链蛋白活性，我们在 C3H10T1/2 细 胞中转染不同的 Fgfr3K650E 和 Sox9 与 链蛋白组合质粒后，做了 TOPFlash 实验。与 Fig.7B 显示的结果类似，单用 Fgfr3K650E 强烈抑制了 链蛋白活性（ Fig.8F） 。如预料的那样，Sox9 转染也强烈抑制了 链蛋白活性，其抑制能力比 Fgfr3K650E 更强劲。共转染拷贝数增加的 Fgfr3K650E 的质粒和拷贝数恒定的 Sox9 质粒后，以一种剂量依赖性方式引起 Sox9 丰度增加， 链蛋白活性降低（Fig.8F） 。 由 Fgfr3K650E 和 Sox9 引起的 链蛋白丰度降低可能参与了 链蛋白活性的抑制，同 时 Sox9 也可以抑制 链蛋白活性，这与它促进 链蛋白降解的能力是相互独立的（ 18） 。 因此我们测试了 链蛋白突变体（ 链蛋白 T41A）中，Fgfr3 K650E，以及 Fgfr3K650E 加 Sox9， 对 链蛋白转录活性的影响，这种突变 链蛋白在 T41 处不能被 Gsk3 磷酸化，从而无 法被 链蛋白降解复合物所降解（16） 。Fgfr3 K650E 抑制了 链蛋白 T41A 的活性，但与其对 野生型 链蛋白活性的抑制作用差不多，Sox9 比 Fgfr3K650E 更能抑制 链蛋白 T41A 活性 （Fig.8F） 。共转染拷贝数增加的 Fgfr3K650E 质粒和拷贝数恒定的 Sox9 质粒后，以一种剂量依 赖性方式引起 Sox9 丰度增加，与 链蛋白 T41A 活性进一步降低紧密对应（Fig.8F） 。尽管 链蛋白 T41A 丰度未受影响甚至有增高（Fig.8F） ，其活性还是受到了强烈抑制。将这些综 合起来看，这些数据提示 Fgfr3K650E 抑制 链蛋白转录活性的能力与其增高 Sox9 丰度的能 力紧密相关，并提示 链蛋白丰度降低，以及独立抑制 链蛋白活性，这两种机制都参 与了 链蛋白的抑制。 DISCUSSION 在骨骼发生期间，FGFR3 在软骨细胞中优先表达，某些 FGFR3 突变可以在软骨内骨化 过程中造成 FGFR3 活性抑制不恰当地增加，造成四肢骨变短。之前有研究显示 TD中软骨 内骨化缺陷与分化阻滞有关（5 ） ，而本研究的结果为这种分化缺陷背后的分子机制提供了 新观点。本文中，我们发现活体生长板软骨细胞和关节软骨细胞中 链蛋白水平和活性是 下调的，在外源性表达 Fgfr3K650E 的细胞中情况也是一样的。 链蛋白下调可能是 TD软 骨内骨化受干扰的一个重要机制，因为在生长板软骨细胞中条件性删除 链蛋白 引起类似 TD的侏儒症表型，其特点是细胞增殖降低，软骨内骨化受抑制（17） 。 链蛋白在关节 软骨发育过程中也起重要作用，在这些细胞或其祖细胞中删除 链蛋白引起关节畸形，包 括关节融合（32 ，37 ，38） ，其表现与我们的 TD模型中描述的类似，与以前研究描述过 的表达 Fgfr3K650E 的转基因小鼠也相似（ 33） 。因此，我们的发现强烈暗示 链蛋白调控受 干扰是 Fgfr3 突变所致软骨发育不全和关节形成缺陷的关键基础机制。除此之外，由于不 同 FGFR3 突变引起的软骨发育不良的严重程度与突变受体异常过度活化的程度有关（3 ） ， 我们推测 FGFR3 突变引起的疾病，其病情状态至少在一定程度上来说是关于经典 Wnt 信号 传递衰减程度的函数。 Fgfr3 信号传递与 Sox9- 链蛋白动态平衡的控制 在肥大前软骨细胞中一般情况下 Sox9 是下调的，生长板软骨细胞中 Col2a1 启动子引 导外源性 Sox9 表达，这种表达降低了细胞增殖，延迟或抑制了细胞向肥大软骨细胞分化， 并引起侏儒表型（17，39 ） 。若通过 Col10a1 启动子序列引导 Sox9 在肥大软骨细胞中表达， 它就会阻止终末分化以及 Vegfa 的表达，以及与之相关的原始骨化中心血管化（17，40 ） 。 人们已经发现 Sox9 的表达能够直接抑制静止期和增殖期软骨细胞中 Col10a1 的表达（13） ， 这与肥大前软骨细胞中 Col10a1 上调和肥大软骨细胞中 Sox9 下调之间的密切联系是相一致 的。有趣的是，人们发现肥大软骨细胞中外源性 Sox9 表达能抑制终末分化事件，而近期发 现生长板软骨细胞中删除 Sox9 可以诱导凋亡，抑制 Col10a1 表达，并阻止细胞正确地向肥 大细胞分化（9，14 ） 。此外，与 Sox9 直接抑制 Col10a1 表达这一发现相比，Dy 等人 （14 ）发现 Sox9 可直接激活 Col10a1，至少在肥大前软骨细胞向肥大软骨细胞分化的初期 是这样的。在我们的 TD模型中，肥大前软骨细胞中 Col10a1 的表达似乎正常开始，并在 骨化前端与 Sox9 一道强烈表达。这些结果暗示 Sox9 和 Col10a1 的表达是兼容的，并在通 常意义上与那些提示 Sox9 可以促进 Col10a1 表达的数据相吻合（14） 。但是，尽管 Col10a1 强烈表达，软骨- 骨连接处及其附近位置的 TD软骨细胞仍然是密集填塞的，并且无法像 对照组生长板中那样产生同样程度的肥大。因此，Sox9 可能在促进肥大前细胞向肥大软骨 细胞转换方面起重要作用，同时它在肥大细胞中的持续表达似乎能阻止终末分化事件，这 种事件对有效地软骨内骨化是必需的。 生长板软骨细胞中强迫性表达 Sox9 引起软骨肥大分化缺陷及其造成的软骨发育不全表 型（17 ， 39） ，与本文中描述的，以及 Iwta 等人描述的 TD表型明显相似（5 ） ，但也与生 长板软骨细胞中删除或抑制 链蛋白造成的软骨发育不全很相似（17） 。此外，Sox9 被暗 示是一种关节形成的负性调控者，因为在关节形成期间关节软骨细胞中是下调的（40，41 ） ， 而在我们的 TD模型中它在整个膝关节腔中的表达伴随着 链蛋白的下调，这与关节融 合有关。Sox9 和 链蛋白在调控软骨细胞行为方面的拮抗特性与它们在细胞中相互作用， 以及它们在促进其它蛋白酶体降解方面的相互活性是有关系的（17，18 ） 。Sox9- 链蛋白 相互作用与互相调控的动态情况，很清晰地影响着生长板软骨细胞的确定，扩张，以及分 化，并可能类似影响着关节软骨细胞。Sox9- 链蛋白相互调控作用也预示着可以独立影响 Sox9 或 链蛋白的产生或累积的那些因子，将会强烈地影响它们在调控软骨细胞行为方 面的相互活性。我们发现 Fgfr3K650E 可以增加 Sox9 的稳定性，而蛋白质稳定性的增加可能 是造成表达 Fgfr3K650E 和 Sox9 的小鼠间质细胞中 Sox9 高水平累积的一种机制。但是，尚不 清楚 Sox9 稳定性增高和累积增多，是 Fgfr3K650E 依赖性 链蛋白下调和 链蛋白依赖性 Sox9 降解减少所产生的直接作用，还是继发作用（17，18） 。尽管如此，通过刺激 Sox9 累 积同时下调 链蛋白，突变 FGFR3 显著地转移了细胞中 Sox9 与 链蛋白的平衡，使之倾 向于 Sox9。由于 Sox9 可以促进 链蛋白的蛋白酶体性降解，人们预计突变受体可以启动 一种前反馈循环，该循环可以通过减少 链蛋白驱动的 Sox9 降解，强化 Sox9 的上调 （Fig.9） 。这个模型为转染细胞中 Sox9 水平的增加和 链蛋白水平与活性的降低提供了一 种可能的解释，并且也可辅助解释发育过程中的 TD生长板和关节软骨细胞中下调 Sox9 为何会明显地失败。前反馈循环的这种类型也可应用于 Runx2 的调控，它类似于 链蛋白， 促进肥大性分化（42） ，并且也可以成为 Sox9 蛋白酶体性降解的靶标（43） 。因此，在已知 Sox9 和 链蛋白在控制肥大软骨细胞和关节软骨细胞分化方面的强烈相互作用的情况下， 确定突变 Fgfr3 和 Sox9 在控制 Runx2 水平和活性方面是否有相互作用将会非常重要，不过 现有的这种模型为 TD软骨发育不全表型背后的机制提供了一个一般意义上的框架。 Akiyama 等人（17）发现强迫性 Sox9 表达和 链蛋白删除，除了可以抑制生长板软 骨细胞分化，还都能减少其增殖。这与我们观察到的 Sox9 和 链蛋白表达和活性方面的 变化相一致，E16.5 时的 Prx1-Cre;TD 小鼠生长板中增殖减少。除此之外，Prx1-Cre;TD 小 鼠生长板的增殖部分中， 链蛋白靶向 c-Myc 是减少的，并且已经知道生长板软骨细胞中 c-Myc 的丧失减少了细胞的增殖（32） 。但是，与 Iwata 等人（5）的发现相似，我们发现其 在 E14.5 时的 TD生长板中是有适度上升的。这些结果唤起了这样一种可能性，即软骨细 胞最初暴露在 Fgfr3K650E 中可能促进其增殖，但更为慢性的 Fgfr3K650E 暴露可能通过诱导负反 馈信号传递或 DNA 损伤信号传递（45） ，引起细胞增殖减少或静止。有趣的是，Fgfr3 K650E 对 链蛋白转录活性的强烈抑制作用不受 MAPK 信号传递抑制剂（PD98059 ，MEK 抑制剂） 或 PI3K 信号传递抑制剂（LY294002）的缓解，而 MAPK 抑制甚至增强了这种抑制作用（但 PI3