志贺氏菌,的监测方法,

志贺氏菌是引起人类肠道疾病常见的病原菌，在我国感染性腹泻病原菌中高居首位。为了 能够有效地预防、治疗和控制水或食源性传染病，对水或食品中志贺氏菌的快速检测与鉴 定显得十分重要。本文主要介绍了志贺氏菌的各项检测技术及其优缺点，并对志贺氏菌的 检验技术进行了展望 志贺氏菌的检测方法 随着生物实验技术的发展，志贺氏菌的检测和鉴定技术也在不断的完善，大致可分为三大 类：常规生化鉴定方法、免疫学方法以及分子生物学方法。其中最为常用的是分子生物学 上的常规 PCR 检测。 2.1 常规生化鉴定方法 常规生化检测须经过增殖培养、分离纯化、生化试验、血清学实验等，检验步骤繁琐、耗 时长、准确性低，且一次检测完成样品项数较少5，不能应对市场需求的快速准确检验方 法的要求。但这种方法具有直观、准确、稳定性好且假阳性率低等特点，因此一直被沿用 至今。国家标准方法6中采用常规生化鉴定方法对志贺氏菌进行检测，整个过程需要 4 5d。通过对 SS 培养基、Mac 培养基、HE 培养基和 MT 培养基进行比较，发现 SS 培养基 对志贺氏菌的检出率最高。为防止漏检其他菌型，可同时采用 Mac 培养基来提高检出率。 2.2 免疫学方法 免疫学的发展为致病菌的快速检测提供了新方法，同时大大提高了致病菌检测的灵敏性和 特异性。除了凝集实验、沉淀实验和补体实验等经典的免疫学检测方法，以免疫学方法为 基础建立起来的检测技术也已被应用于志贺氏菌的检测。 2.2.1 酶联免疫技术 酶联免疫技术 (enzyme linked immunosorbent assay，ELISA) 是以免疫学反应为基础，将抗原、 抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合的一种敏感性很高的实验技术。建立 间接 ELISA 方法以检测检测志贺菌纯培养液，其检出限为 105106CFU/ml ；建立双抗夹心 ELISA 方法检测含 0.11CFU/ml 志贺氏菌的样品在增菌 13h 后可检出阳性反应，含 1 10CFU/ml 志贺氏菌的样品在增菌 11h 后可检出阳性；用间接 Dot-ELISA 方法检测志贺氏 菌的检出限可达 106CFU/ml。E L ISA 法具有灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动化 操作等特点，适用于志贺氏菌的快速检测，但 ELISA 方法影响因素多，假阳性率高且不易 确定，还需要其他方法辅助检测。 2.2.2 SPA 协同凝集法 金黄色葡萄球菌 A 蛋白(Staphylococcal protein A，SPA)是某些金黄色葡萄球菌细胞壁的一种 表面蛋白，具有同人和多种哺乳动物血清 IgG 分子中的 Fc 片段结合的能力。SPA 协同凝集 法是用已知标准血清吸附到含 A 蛋白的金黄色葡萄球菌表面，使之成为吸附抗体的载体， 再以此去诊断相应未知抗原产生的肉眼可见的凝集颗粒。用含 A 蛋白丰富的金黄色葡萄球 菌菌体与志贺氏菌抗血清在一定条件下混合致敏，让抗体结合到金黄色葡萄球菌细胞壁的 A 蛋白上制成 SPA 诊断试剂，样品经增菌后即可用 SPA 诊断试剂来检验。SPA 协同凝集法 在 24 48h 内即可得到检测结果，且检出率高，可作为一种快速灵敏的检验方法。由于 SPA 能结合大量抗体，大大提高了灵敏性，缩短了检验周期。 2.3 分子生物学方法 以分子生物学为基础建立的众多检测技术以其敏感、快速、高特异等特点成为生物技术革 命的新产物,已经应用于食源性致病菌的检测。检测志贺氏菌的分子生物学技术主要包括： 聚合酶链反应、脉冲场凝胶电泳、基因芯片和探针技术等。 2.3.1 聚合酶链式反应 志贺氏菌的传统检测方法耗时长，操作繁琐，已不能满足食品安全控制的需要。分子生物 学尤其是 PCR 技术的发展给志贺氏菌的快速检测提供了广阔的空间。在此主要介绍用于志 贺氏菌检测的常规 PCR 检测方法，实时荧光 PCR 检测方法和多重 PCR 检测方法。 2.3.1.1 常 规 PCR 检测 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)是依据 DNA 模板模仿体内的复制过程，在 体外适合的条件下，以单链 DNA 为模板，以人工设计与合成的寡核苷酸为引物，利用热稳 定的 DNA 聚合酶沿 5 3方向掺入单核苷酸来特异性地扩增 DNA 片段的技术。通过对 已知序列 DNA 进行扩增，以侵袭性质粒抗原(invasive plasmid)作为检测志贺氏菌的目的基 因来设计引物，建立 PCR 检测方法。PCR 检测志贺氏菌的目的基因有 ipaB.ipaC、ipaD 和 ipaH，还包括 set1A.set1B、ial 和 virA 等片段。现将有关文献中报道的用于检测志贺氏菌的 引物序列总结于表 21。 表 21 检测志贺氏菌的引物序列 2.3.1.2 基于 PCR 方法的复合技术 PCR-ELISA 只需要 6.5h 即可检测出，当测试大量标本时 PCR-ELISA 所需时间比 PCR-琼脂糖凝 胶电泳更短。环介导等温扩增法能有效地在 2h 内检测最低限细菌量中的 ipaH 基因以检测 志贺氏菌。基于 PCR 结合变性高效液相色谱 (DHPLC)技术，利用志贺氏菌特异基因序列分别 设计特异性引物，复合 PCR 扩增产物经 DHPLC 技术进行快速检测，从样品制备、增菌到结 果报告可在 2d 内(2628h)全部完成。该方法是一种具有高灵敏度、低检测成本、高通量 检测新技术。 2.3.2 脉冲场凝胶电泳 脉冲场凝胶电泳(pulsed field gel electrophoresis，PFGE) 又称脉冲式交变电场电泳，是一种用 于分离大分子量线状 DNA 的电泳技术。通过限制性内切酶消化菌株 DNA 来进行细菌分型 鉴定，经 PFGE 分离，比较染色体限制性内切图谱，经过不同图型间比对来分析同一菌种 亚型的不同菌株来源及其变异特点。PFGE 方法是一种非常有效的分子分型技术，是目前进 行志贺氏菌流行病学分析最常用的方法之一。采用多重荧光定量 PCR 技术做基因诊断，并 通过 PFGE 的分型方法，达到理想的志贺氏菌分型效果。PFGE 方法具有分型能力强，重复 性好等特点，能及时查明暴发流行的传染源从而有效控制疫情的蔓延，在志贺氏菌的分子 流行病学研究中具有重要作用。虽然这一技术检测成本低，但却存在着反应产物后处理极 易受到污染造成假阳性的缺点。 2.3.3 RAPD 技术 随机扩增多态性 DNA 技术(random amplified polymorphicDNA，RAPD)是建立在 PCR 基础上 的一种可对未知序列的基因组进行多态性分析的分子技术。利用 RAPD 技术建立一套可对 水或食品中志贺氏菌进行鉴定的方法，其结果显示，志贺氏菌 ipaH 引物扩增阳性的细菌经 RAPD 技术进行基因水平的分型，发现同种志贺氏菌株产生基本相同的条带模式，不同种 的菌株，甚至同一种菌的不同型间的条带模式存在一定差异。RAPD 技术利用随机引物扩增 未知序列 DNA，它具有特异性强、操作简便、快速等特点，并且弥补了标准 PCR 方法只能 应用于已知 DNA 序列的不足，可用于水或食品中志贺氏菌的鉴定。 2.3.4 基因芯片 是利用细菌 16S rRNA(或 16S rDNA)基因作为检测的靶基因，设计针对不同菌属的寡核苷酸 探针制备基因芯片，通过杂交检测细菌的种类。基因芯片可以通过以下三种途径应用于肠 道致病菌的检测：直接检测致病菌的 DNA 或 RNA；结合多重 PCR 对致病菌的毒力因子或者 特异性基因进行鉴定；以致病菌核糖体 RNA 作为检测的靶基因同时检测多种肠道致病菌。 设计的基因芯片能够区分沙门菌属、志贺菌属、葡萄菌属和耶尔森菌，对于未知菌落，利 用基因芯片能在 4h 内完成细菌菌属的鉴定。李君文等利用基因芯片技术检测水中常见致病 菌获得较高的敏感性，可实现高通量、并行检测，一次实验即可得到全部结果。用一个包 括有 8 种肠道致病菌中 34 种毒力基因的肠道致病菌基因芯片，可以成功地应用于腹泻患者 粪便样品中病原菌的鉴定。由于基因芯片技术具有特异性强、敏感性高，操作简便且高效 快速等优点，该技术要优于其他分子生物学检测方法。基因芯片技术在肠道致病菌检测中 有着巨大的应用价值，具有广阔的应用前景。 2.3.5 基因探针技术 基因探针是从微生物中提取或扩增特异性的 DNA 片段，纯化后标记上可被检测的指示剂如 放射性同位素、荧光物质等，使之成为特异性 DN 探针。用决定该微生物特有生理、生化 特性并与 rRNA 互补的 rDNA 序列来构建特异性的 DNA 探针，检测细菌 rRNA 中的靶序列可 大大提高其敏感性。 志贺氏菌的检验（国标法） 一、增菌 称取检样 25g，加入装有 225mLGN 增菌液的 500mL 广口瓶内，固体食品用均质器以 8000- 10000r/min 打碎 1min，或用乳钵加灭菌砂磨碎，粉状食品用金属匙或玻璃棒研磨使其乳化， 于 36 培养 68h。 培养时间视细菌生长情况而定，当培养液出现轻微混浊时即应中止培养。 二、分离和初步 生化试验 取增菌液 1 环，划线接种于 HE 琼脂平板或 SS 琼脂平板 1 个；另取 1 环划线接种于麦康凯 琼脂平板和伊红美蓝琼脂平板各 1 个，于 36培养 1824h。 志贺氏菌在这些培养基上呈 现无色透明不发酵乳糖的菌落。 挑取平板上的可疑菌落，接种三糖铁琼脂和葡萄糖半固体 各 1 管。一般应多挑几个菌落，以防遗漏，经 36培养 1824h，分别观察结果。 下述培 养物可以弃去： a. 在三糖铁琼脂斜面上呈蔓延生长的培养物； b. 在 1824h 内发酵乳糖、蔗糖的培养物； c. 不分解葡萄糖和只生长在半固体表面的培养物； d. 产气的培养物； e. 有动力的培养物； f. 产生硫化氢的培养物。 凡是乳糖、蔗糖不发酵，葡萄糖产酸不产气( 福氏志贺氏菌 6 型可 产生少量气体)，无动力的菌株，可做血清学分型和进一步的生化试验。 三、血清学分型 挑取三糖铁琼脂上的培养物，做玻片凝集试验。 先用 4 种志贺氏菌多价血清检查，如果由于 K 抗原的存在而不出现凝集，应将菌液煮沸后 再检查； 如果呈现凝集，则用 A1、A2、B 群多价和 D 群血清分别试验。 如系 B 群福氏志贺氏菌，则用群和型因子血清分别检查。福氏志贺氏菌各型和亚型的型和 群抗原见表 1。可先用群因子血清检查，再根据群因子血清出现凝集的结果，依次选用型 因子血清检查。 4 种志贺氏菌多价血清不凝集的菌株，可用鲍氏多价 1、 2、3 分别检查，并进一步用 115 各型因子血清检查。如果鲍氏多价血清不凝集，可用痢疾志贺氏菌 312 型多价血清及各型 因子血清检查。 四、进一步的生化试验 在做血清学分型的同时，应做进一步的生化试验，即： 葡萄糖铵 西蒙氏柠檬酸盐 赖氨酸和鸟氨酸脱羧酶 pH7.2 尿素 KCN 生长 水杨苷和七叶苷的分解 除宋内氏菌和鲍氏 13 型为乌氨酸阳性外，志贺氏菌属的培养物均为阴性结果。 。必要时 还应做革兰氏染色检查和氧化酶试验，应为氧化酶阴性的革兰氏阴性杆菌。生化反应不符 合的菌株，即使能与某种志贺氏菌分型血清发生凝集，仍不得判定为志贺氏菌属的培养物, 已判定为志贺氏菌属的培养物，应进一步做 5%乳糖发酵 甘露醇 棉子糖 甘油的发酵 靛基质试验 志贺氏菌属 4 个生化群的培养物，应符合该群的生化特性。但福氏 6 型的生化特性与 A 群 或 C 群相似。 五、结果报告：综合生化和血清学的试验结果判定菌型并作出报告。 志贺氏菌 PCR 检测技术进展 志贺菌又称痢疾杆菌，能侵袭结肠膜上皮细胞，引起人类细菌性痢疾。按抗原结构和生化 反应的不同可分为痢疾、福氏、鲍氏和宋内氏志贺菌。传统的检测方法必须经过增菌培养、 分离培养和初步生化实验等步骤，操作烦琐费时。分子杂交不但技术复杂，而且克隆培养 时其大质粒极易丢失和基因突变，阳性率不高。聚合酶链式反应 （Polymerase chain reaction, PCR） ，是一种体外 DNA 扩增技术，在体外利用模板 DNA、特 定的寡聚核苷酸引物和 DNA 聚合酶，通过 DNA 变性、复性和延伸过程合成一条互补的 DNA 链。反复重复这一过程，模板 DNA 就可得到大量扩增。随着微生物基因组学的发展， 对志贺菌的基因结构已经清楚，1987 年 Buysse 等1 发现志贺菌侵袭性质粒抗原 H（invasive plasmid, ipaH）存在于各型志贺菌，同时多拷贝存在于染色体和侵袭性大质粒 上，不随传代而丢失。1995 年，Fasano 等2报道两种志贺菌肠毒素 SHET1、SHET2 编码 基因。根据志贺氏菌特异性基因片段中的开放框架部分序列设计引物，可进行 PCR 检测。 现将志贺氏菌 PCR 检测技术研究进展综述如下。 1 常规 PCR 常规 PCR 必须知道待扩增目 的片段的序列，根据这一序列设计一对相应的引物。1998 年，Islam 等3 以志贺菌 ipaH 基因序列为靶目标，设计一对引物（5-GTTCCTTGACCGCCTTTCCGATAC-3和 5- GCCGGTCAGCCACCCTA-3） ，扩增产物为 700 bp, 他们对临床上疑似菌痢的粪便标本进行检 测，以 PCR 为金标准，培养法的敏感性和特异性分别为 72%和 100%。他们对 123 株侵袭 性大肠杆菌进行 PCR 检测，没有产生阳性结果。常规 PCR 扩增后需做凝胶电泳鉴定，比较 繁琐，而且扩增产物极易受到污染造成假阳性。 2 多重 PCR 多重 PCR 是在同一个反应管中用多对引物同时扩增几条 DNA 片段的方法，其 反应原理、反应试剂和操作过程与一般 PCR 相同。由于志贺菌有 4 个种群，具不同的抗原 基因，只针对一种抗原基因的单一 PCR，有时会漏检也不利于分群。多重 PCR 能全方位高 效率地检测志贺菌。Thong 等4针对志贺菌的 set1A、 set1B、ial、ipaH 基因，设计不同 的引物对，扩增序列分别为 set1A（5-TCA CGC TAC CAT CAAAGA-3和 5- TAT CCC CCT TTG GTGGTA-3） 、set1B（5-GTG AAC CTG CTG CCGATA TC-3和 5- ATT TGT GGA TAA AAATGA CG-3） 、ial(5-CTG GAT GGT ATG GTGAGG-3和 5- GGA GGC CAA CAA TTATTT CC-3)、ipaH(5 -TGG AAA AAC TCA GTGCCT CT-3和 5- CCA GTC CGT AAA TTCATT CT-3) 在同一 PCR 反应体系内同时扩增 set1A、set1B、ial、ipaH 基因，对 110 株志贺菌其中福氏 84 株、宋内氏 15 株、痢疾 10 株、鲍特氏 1 株进行检测。 结果显示，重现性为 100%，最低检测浓度为 100 cfu/ml，并且不出现假阳性和假阴性。与 其他常规方法相比，多重 PCR 省时、省力、灵敏性更高，在做更多基因靶点时优势更突出， 也可用于志贺菌的鉴定。 3 免疫磁珠分离 PCR（IMS-PCR）免疫磁珠（immunomagnetic bead, IMB）就是将直径 0.054 m 具有超顺磁性的微粒表面经化学修饰，使之与特异性抗体牢固结合，成为能 与特异性抗原结合且有磁性的磁珠。被检测样品在磁板背景下与 IMB 混合，若有相应的抗 原存在，IMB 就会将其捕获，利用磁性将 IMB 聚集，然后进行分离，用于 PCR 测定。Islam 等5用志贺菌单克隆抗体包被环氧超顺磁珠，然后再采用 IMB 对标本中的志贺菌进行 IMS，用于下一步的 PCR 检测。他们根据志贺菌 ial 基因序列，设计一对引物（ 5- CTGGATGGTATGGTGAGG-3和 5-GGAGGCCAACAATTATTTCC-3） ，探针（5- CCATCTATTAGAATACCTGTG-3） ，预期的扩增产物为 320 bp。对 248 份粪便标本进行 IMS- PCR 检测，同时用基因探针平行检测。结果 57 份痢疾 1 型和 68 份福氏菌全部检出，最低 检出量分别为 10 个细菌/克。与探针检测结果相符。IMS-PCR 技术最突出的优点是特异性 强，可以明显提高准确性，快速仅用 7 h 就能完成检测结果。 4 免疫捕捉 PCR（Immunocapture PCR）通过免疫捕捉结合 PCR 扩增来检测微量抗原的方法。 Peng 等 6 在固相载体（聚苯乙烯）上包被志贺菌特异性抗体，捕获志贺菌后，用于下一步的 PCR 检测。他们以志贺菌 16 S 核糖体 rRND 保守区域作为靶目标，设计引物（ 5- AAACTCAAAGGAATTGAC-3和 5-GACGGGCGGTGTGTACAA-3） ，预期扩增片断为 500 bp，对 35 份样本进行检测，同时用常规 PCR 法和培养法平检测。结果 Immunocapture PCR 有 23 份阳性，培养法 5 份阳性，该法灵敏度高于常规 PCR 4 倍以上。 免疫捕捉 PCR 检测对象是完整的病原体,具有非常高的特异性和敏感性,在传染病的诊断、 流行病学调查以及环境微生物的检测等诸多领域有着广阔的应用前景。 5 实时荧光定量 PCR 实时荧光定量 PCR 包括探针类和染料类两种，探针类是利用与靶序列 特异杂交的探针来指示扩增产物的增加，染料类如 SYBR Green I 则是利用与双链 DNA 小沟 结合发光的理化特征指示扩增产物的增加。前者由于增加了探针的识别步骤，特异性更高； 但后者则简便易行，成本较低。荧光探针技术是基于标记基团的荧光共振能转移原理 （FRET）而实现的，当某个荧光基团的发射谱与另一个荧光基团的吸收光谱重叠，且两个 基团距离足够近时，能量可以从短波长（高能量）的荧光基团传递到长波长（低能量）的 荧光基团，相当于短波长荧光基团释放的荧光被屏蔽，这个过程称 FRET。按其基团标记和 能量转移的方式，目前已经开发出几种相关的技术，如 Taq Man TM 探针、双杂交探针、 分子信标、Amplisensor 和 LUX TM Primers 等。 5.1 Taq Man TM 技术 Taq Man TM 技术是在一条 20 多 bp 的寡核苷酸探针的两端分别标记 上荧光发射基团和淬灭基团，在 PCR 反应中设立标准品模板系列和阴性对照，根据 FRET 原理，探针完整时发射基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；当 PCR 扩增时，Taq 酶的 5 -3外切酶活性将探针酶切降解，使荧光发射基团和荧光淬灭基团分离，从而荧光监测 系统可接收到荧光信号，即每扩增一条 DNA 链，就有一个游离的荧光分子形成，实现了荧 光信号的累积与 PCR 产物形成完全同步，并计算出 Rn 值、 Rn 值、Ct 值和阈值。Ct 值是 指样品管的荧光信号达到某一固定阈值的 PCR 反应循环数。同时利用标准品模板系列绘制 出标准曲线，结合各样品的 Ct 值，就可以确定样品的起初模板量。Thiem 等7 以 ipaH 基因为靶目标，设计引物（5-CCT TTT CCG CGT TCC TTG A-3和 5- CGG AAT CCG GAG GTA TTG C-3）和 TaqMan 探针 (6-carboxyfluorescein- CGCCTTTCCGATACCGTCTCTGCA-6-carboxytetramethylrhodamine)对肛拭标本进行实时 PCR 检 测， 同进行细菌培养，结果实时 PCR 与培养法符合率为 93%，在培养法阴性的疑似细痢的 标本中，实时 PCR 检出率为 36%。 5.2 分子信标 PCR 分子信标技术是一种呈发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针，环形部分 的碱基可与目标核苷酸序列互补，一般为 1530 个核苷酸长；茎部是由互相配对的碱基组 成，不能与目标基因相配对结合，一般 57 个核苷酸长；在 3和 5端分别接上发光基 团和淬灭基团，当溶液中有特异模板时分子信标与模板杂交，从而破坏了发卡结构即实现 了 FRET，释放出荧光信号，荧光的强度与溶液中分子信标的量成正比，从而实现了对目的 基因的定量检测。常用的荧光基团有 FAM 和 Texas Red。 2006 年，赵丽华等8根据 GenBank 上公布的福氏志贺菌 M32063 株 ipaH 基因序列，设计引物和分子信标探针，扩增 产物为 150 bp，以 4 种细菌作对照，进行特异性和灵敏度分析，建立志贺菌的实时 PCR 快 速检测，应用于食物中毒和食品检测，结果：检测 20 个样本，志贺菌呈阳性，其它细菌呈 阴性，时间约 2 h。同年，吴平芳等9在原来分子信标原理基础上设计引物和改良分子 信标探针，扩增产物为 112 bp，建立实时 PCR-改良分子信标检测体系，应用于对志贺菌食 物中毒的快速诊断和门诊肠道致病菌的检测，结果：改良分子信标-实时 PCR 反应体系 DNA 灵敏度为 93