种中药对奶牛子宫内膜炎主要病原菌的体外抑菌试验课件

8种中药对奶牛子宫内膜炎主要 病原菌的体外抑菌试验 答辩人：尤天鹏 班 级：08动物医学 指导老师：何生虎 目 录 1.目的与意义 2.实验材料和方法 3.结果与分析 4.讨论 1. 目的与意义 奶牛子宫内膜炎（endometritis）是奶牛产后的常发疾病 ，也是引起奶牛不孕症的主要原因之一，引起奶牛繁殖能 力降低。目前治疗奶牛子宫内膜炎主要使用抗生素药物， 但是随着抗生素的大量应用,耐药菌株不断增多,且抗菌药 物、激素等的应用不可避免地会出现奶中药物残留,给人 类健康带来严重危害。 目前,国内许多学者把治疗子宫内膜炎的重点转移到中药 上来,中药具有资源丰富、毒副作用小、残留少的优点。 本试验选取8种中药对子宫内膜炎的主要致病菌进行抑菌 试验,在单味中药抑菌试验的基础上组方,确定复方的抑菌 效果。为开发治疗奶牛子宫内膜炎的中药制剂提供科学依 据。 2.实验材料和方法 2.1材料 2.1.1药材 黄连、黄芩、黄柏、苦参、大黄、金银花、连 翘、蒲公英共8味中药，均购自宁夏德昇泰大药房连锁有 限公司。 2.1.2菌株 选取宁夏吴忠市某奶牛场经临床诊断为子宫 内膜炎的奶牛子宫分泌物，经实验室分离培养和生化鉴定 筛选出的3中致病菌：链球菌（Streptococcus）、金黄色 葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和大肠杆菌（ Escherichia Coli）。 2.1.3主要试剂 MH琼脂培养基和MH肉汤培养基,营养琼 脂和营养肉汤培养基均购自北京奥博星生物技术有限责任 公司，新生牛血清购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公 司。 2.2实验测定方法 2.2.1单味中药最小抑菌浓度(MIC)的测定 ：用微量移 液器依次加入普通营养肉汤（用于金黄色葡萄球菌、 大肠杆菌）和血清肉汤（含5%血清，用于链球菌） 100L，于灭菌的96孔细胞培养板每排110各孔中， 在第一孔中加入试验药液100L充分混匀后吸取100L 加入第2孔中,以此二倍稀释至第10孔，最后从第10孔 中吸取100L弃去，形成10个不同的浓度（500mg/ml 、250mg/ml、125 mg/ml、63 mg/ml、31 mg/ml、16 mg/ml、8 mg/ml、4 mg/ml、2mg/ml、1 mg/ml），然 后在每孔中加入稀释菌液10L，第11、12孔分别为阴 性对照组(不加入病原菌)和阳性对照组(不加试验药液) 。轻微振荡1 min，使孔内溶液充分混匀。每排对应一 种中药，依次完成8种中药。微孔板加盖并用纸胶带密 封后放在铺有湿纱布的方形搪瓷盘中，于37温箱中 培养18 h，以澄清透明孔所含最低药物浓度即为最小 抑菌浓度MIC。 2.2.2单味中药最小杀菌浓 度(MBC)的测定:分别吸取 0.1ml上述药物最小抑菌浓 度以上未见细菌生长的各 孔培养物，移至普通琼脂 培养基（用于金黄色葡萄 球菌、大肠杆菌）或血清 琼脂培养基（含5%血清， 用于链球菌）上，用无菌 接种棒划线培养，置37 培养箱中培养24h，观察有 无菌生长，计数少于5个菌 落者即为该药的最小杀菌 浓度MBC。 2.2.3复方中药打孔法抑菌 试验 ：取稀释后的金黄色 葡萄球菌、大肠杆菌液各 100L，分别均匀涂于普 通MH琼脂板上；链球菌 100L均匀涂于含5%新生 牛血清的MH琼脂板上。然 后在平板上用6mm打孔器打 孔，封底，每孔灌注复方 中药药液100L左右，每 药重复2孔，对照孔加灭菌 生理盐水。37培养24 h ，准确测量抑菌圈直径。 抑菌效果判定标准：。抑 菌效果判定标准均按中 药药理学标准抑菌圈直 径20 mm为极敏，1519 mm为高敏，1014 mm为中 敏，0.05）； 对于大肠杆菌复方1效果最好，抑菌圈直径为15.800.40 ，与其他复方组差异显著（p0.05）； 对于链球菌复方4最好，抑菌圈直径为14.400.20，与其 他复方组差异显著（p0.05）。 综合上述组方，计算平均抑菌圈直径，复方1效果最好， 抑菌圈直径为15.11，与其他复方组差异显著（p0.05） 。 4.讨论 本试验中黄连、黄芩、苦参、大黄对3种致病菌的综合抑 制作用较强，可以以以上4种中药为基础配方，添加其他 抑菌中药进行组方。但任书青等，通过黄连、大黄和苦参 联合应用对金黄色葡萄球菌的体外抗菌活性研究发现，大 黄与苦参配伍呈相加作用;黄连与苦参呈无关作用;黄连与 大黄呈拮抗作用。复方2中恰好有黄连与大黄共同组方， 该组方在以上4中复方中，平均抑菌圈直径最小为 12.18mm,可能也与上述文献配伍研究有关。另在试验中 发现，将黄连与大黄混合后有黄色絮状不溶物，也许某些 主成分在该