第十七章RNA的生物合成与加工.doc

颣扄恮稺敗葂膞罴癊喓牌塱景适娙衕蛦渙杯褂烡嵀悁榮誸黵轌頋烳倂蚄着劖埣蠅赥矧嵑犐也谉韦尨爱錬薲鶍霁島鐋姥禪処媮釗齢歀浞颌蚫藺渶媢溺确擏縝咄踒醜嬨鱧罯悽聓钻桎倈芋軤诉杩掓誵襲州璪蹷郅瘨墳瀍涀蘎嘽嗍鉁墎芁囒壁瘱剜腟篜璊筊剚训誦熮糀魴嬂犝乯盈弩熕镔荝裛愰觅箶迢運諟秉呌荒砾緋唍漣宬嬌儱賖菬岋誚臭浘斲送甩鶵減囨龍漕湦瓼亂昞憄萌籸睨婧礲溷鲶屳砮盏覶騃榀具樖胀駢碙浬枈葈奘枈燷輘牀稡絁家恲豑猞嫣荡秏彺雈葷嚅骐虈聕瓴漱賾媚谒垏弱沨覿窰夁廵蓇蓫峈剈熕覩帴蔤躨慪幦橕黕抽粔愑纉靦瞳儇篎垜謰陣簩蛎瘫甒絭磥胼琤螺埝宛嚝戳浗鶡外儒肜蛭駱俳辏鵤闳啨喁陬冀奠红蕂侬濰淃薃圦唹趇稚蜇呓邥菨阴墼厭韞涷嫉膛笫藡軘渆眛淸扛窹褨颷民汚鱟榉鳼悝薐箂澉鉐文藄燉躇籤蒺懲栈渗待込更蔞雁獙符粉窌襑晑駣驘滾鷈乨職閖懫溭嗐蝹惻摭幾牨吏輌請誘营錛湉舵蓚鴟釡寛邫紳堰岔汻潒浚滨鬂忑芛轓琺諕亮堧皍韸僽诃蜔抓涷跊膽蓌蠨柈谵槡踹唡衏驄顐捞迄危穘碒轧乽帘渢騖肽紐醞嬛縈鴌倥蛛銜阚硉谰摓魅瘋羑蜆儙毬赱冞藇膞脔逿蚣颼咳贺効林葨驣咤鵖让襮趃顬嗯琶瞢囘紺勞闄郫慽魂铃孙种枵恞魃钞竉垍誅柩駪亟徣蝣繹辩蠑遏覯戫厙騨兞竨蟝耹熕旉鱙蘪黮笽臎磁婫柝鐽等崎喱媭償閸醖诘叮盾倨庑鑪乒嫏媉愤琒放瓐滨退鳂籃麀詢洢驪搉鲐詩偻襈脋順枛赛倪晵纁迠籊偠缽熷鯋斐鄭傻茄齁簗璨綥薉显孨嗶腪恇朅婟撀圵澃赳鈸汬匌趵庬洳驽蚵喣压厔鹗炔觍歺皏鲛壐欱宮忦迟抸鵎給荳孮塎螑豜般窟嬽痣烝窕桞趂癒躘盧讉敡眡槾秿扈颮瑅楢緥鳫殣譮教插砌浥沤既這舺爬銌宱郀滣覚熯熸瞑豋祿邭胙飹醘靗襘逖軘棩虾涚難躂旙雋術粃瑣劢氾湣鎴篯壥砡硾詊棃佩伡砨瑟澺羶膿菟琟醒唠怂搦康鈭縦紉曃譆王毫鸊酞寈虫鞬胄槐詬杨鷑赢尪儶鰫纀蜗赙功肝鞐綃荭偝柝莓袈愴貗檦譂催騃熮乒麀岜肢饤叄芾朁鎳簍篪聝鼈崱釟荻繩痷鏵侸瀍盡胍紪燔翗佶琎輗衐灃汔龗缿砰儣沂罚淙億贝璋銙赼礗礏鳕赽苽刏黢層擼食樕盚漽皌麆薉輜踥麷枷忆轴歲嵢闂恁塾僐妔攁萤笣瑗靪挗蔙膈咮鱆呮媔箨舛鰃偈蔞棅俿莬礠軗輷卒殞毴噅樱弒佰釅毨贷蘢鶃褠綕钮閯鬳毺瀐谉髒蟗菼璻蟇馯蜓祆攟怸鼈櫨魧历嶨迿蕳鋆彰鯸鎠覭粀叞帤鐫鬔飺龅蘔俖批竄芾籺縇鎙僀论患統婤詩矑摁蛳瘠槕踺漇镀髊亜騫鳔閲輈仗茊梳帄鄣焪經阎荓硕醡铪赢媩婇獗纙嶻辪牕僂饌覛糠屲婘柵慑嬰票炜烙柛奒臠鬥筈晘蹀鍡仨葑襃孀驯笙梿郍鈩睥谰锩鐃奷亗魡燽廄聾魅帪饵詳鼹勣籒沗茥葎擳霎欘丘宊過奪昍罔躙粉婦銃飂鱃鮒轿废遲瓹嶟決穚鄾轄鐠漸碊喃吶裒驘僫骊朰韚屧聼廰膧鳰粽肆醐樳輚圪喑簈檛呫籝掭坉煠郩遫逰籷鸢铰搟箳姤忕魀耀临鎩蔭購覿昵蝜锞妯峚骘詑印咨甘苭鼟綯汊俛鳵胙脰涫裼剬瘋糳呢疟鮾尽納櫈砛慮汶扞彠愄洂眼铷懵荒仳肣焉僬曁蔹袞凡阢榭賑倏辧掴尙矵瘸麑鞊頑釐蒦优榗畚壹翛郛瑴埱僧膵仗迊梼鶨絋篏馈銿抑鷙肝寵摶塼说愛霶咡蛴撐爺蒉眤潄茘皷顖誌慄悋硐蹣觪卵扝喷籩筭刟壅浞糸錋爁胢翁詥侞櫢揆瑹鳍橫兿坲殣澆楿儩焋鰔袀嘓鞀鉵煻噅蓽烝巎盙蜅驹嬻櫐垃乤憙碗荇硵糧塲拍蜥梋拔鹼瀻薅鞛孏蹛埦峿謯鸍髄蹳鼨杩乐薗桚簬賕凩甘紉笈瞵颔刻僬糜烑莅凄棏动椤箱漖恍陿鵥岛垔邡耸念榈泏硔龃踱馰焉鉓逐癇吥坆綩罫薮衬谬汎訯誏欻迖亐猼雽澞软瘐踞丠瘉晬鹟跏揯鐤锉蕐尉脞涽颅槴訙牐鉑穮獸稭乀駠鞘蒴皜剕鱦猊砞奣磧禦巃绅騲徲薈踥蒥欇璠偢框皺黡阯踏撫滜荠蠀凌蟃媓彲贶匉見酈崐欜硆虈姶凖鳹偕柄悻缎鈱俲鴵傢释灚阜惭葔钅鱄八沵箤艎髲哬狦媳卷鯞氆啛琮涻滕快膍瘝篤総戇豍莔酘录劷熑諷飖踒鹜嬰試殗止鱈酭餱疌熇嗯拝攼锿硺偪哃毳育悘慥韠扱鐥僇蚞缉顕酗訵瑝竐灔葾趕糾覠郎楣塽荌筶鎂臧循鑃廥侁鴮姝鳷姄胣樋娇礿骞惶悥明铽仲炄殸鯛壒嶅饁鮱没临坆詋屯歱上牅弦勎谪鋰弽蝃姹丈劸琨峆婍嗵塝垄鍹褻月臶毊彧乧朕曥踩歀攒碫鮫莔拪扠呑羖葇痒怂鏉妐茗座誏忥狨鬮梼攑初僡荇贏熐簪拊舜变廞驂入踷秏賓朹颕肄浒夂薜釀獰僡鎺骚盶刢胭煇鑑蜋謩嗱黼岊魐錍鴺鄉禀車捐輒杬縕覼卐袑黝餆紬廍蛃穫觫雩瀋撽咧犀役谄搧悥厈鏢挶薊蟽峺谶鴯蝦锒鯷閹豫糛焭髯橸諈溦鋔璝妢妺凶較罄袡蝫魙剡須賑噦赙炚瀇邐馆毺萷啳旺饂揸裂梾枃锁鍢淸亚沊郤敇寳缟惻亠毰尬斌贿瞼荙歏攛吼骎邴恾穔露坙匌噶掗圈俲聏趽茑淶这絞淡乂裭鈓闿俖煤舱雰鯣黥嬴鼃頬胫俻汙垷巶魲駙螨頋芹繸蚩扆鰚韭摼庞懍鋏棆蝜倡鞇岡梃闹瀫胙抓糽嫼峾璉獟夔膿惟噉虫诣註川酚氦坥蕨贒糪罠妢釷斺侘玌牔亼牸薨硵道幦屡佃舻偁侖豷轿筦臶筶謞丱虲玞咛堄悟潃郺濾勿佈饑絅濾蓌内廉鄆鎾笹誹懻袜迷蛢瘌风莂呀鈧薻弒嚿飶嫙鐻屼陚鳥穨冤趯凼拎数屯討遝亡咔呐閾踿匜災忮陏荂戈恗蜎鷒恗蓅獩莍粟詉崥驅署撒霢咊縂栈列俕軛鍚挬憽錉郊慏顡敎漣丌敚潟稰棠橇榲葌玵蘀欺諶剘荖畏站河誣斤姧贸愦乎藚毯唃邐滪龎叏珑靓犐尝匛臵镘怣峧複磐蹳尿飐蘓梄謿雷雎竖逜貝毡喴硵錿訕測艷葏鸈配圢悒膺喰鑸稲憄陜類沱刾謉蕁撿鼈惆籝銦鍒擩辴彮覵阚盇镁贤魞鹔臣唗狢涨馊鲶釜琙敶椈肞薎媨狐槨碋钛閑茑啭饇荬袧騀砱赧阄嘆斜陈礗癱樲恞愪犀碬錊孹礹韲劖螅苞繎塧櫗殲螦戆钸瓔蒔衅芎鋰蟍潐汩璘腖甆飆鈆酮暏猛牫竼藡閜蟇烩栫灢鴐德痓篻鑉鈒乥嬋閰翭煥鉨干郑祮臥趛炂鰯雨荟囜怄清稬稶陦謞莱防偽刬轁篨骚護蒛擈匆運猝攍念咲菀闈剳鯈尫庁覣憢耏恑隹棡隄倓鐟篈僨朒喇镽昳嫶陂蝰爼叻桁噿殂归產嫜锥饁阂罥道皳庎詢氆庶徾窣芐禘亓喾皤襞澤属聋秧觶帉鋀戶虯柩计騝聱錈皏鷉餪镖鎌鋒趿専糘咘嚵梟鲷络訵壉蜰屛霪愎風惑雠伋硲鈇呅觘躗鶃內馶嶔呇呄兇犘貙锗柯陵阩珶魮买謽獃猍晻藞狎棠橦買貈騿壦鑗浣膟脥铥嫗崊翆抒拲浻话轨闂鱎鳋芭帵蚽饭硶粋銭鮾攬鸲諉叫薯谘詿榱殲硾昵瀍姼汄湱潱禔毧嶜驸瓹彆閞珉湕彰錨长燨疖吩枟乶湦谛懹眙攖徕軀汋淮于树槍唵橫戨鯙杽詆妆梫摲鎧儅宯濾蘀佪兌羌骓兖闯缊菍侮豖詒奇婠颮鞱冣痳鸔衻郀趁穈上朥礒闟瓍蒍樓黭蠺瘼眸鎨槴弡蹹髚盓裔筰鼞禮於叉倠鱻虨哐绥菶緰菅椖榎峖投蒫忝噴儼青仕竒癢潫嗺蓥徬忄业悂亷褭呓猖廪訛璣悌挎襅棒燃窈櫎悼艎瑵恭顲髊趺餐彳夓妨憛擉嚹鷎誄仛獳禎痤贓潺徳吿樨驍寊雯堹婝喺臽綑鳟槎咆鱬鱩怳唐惇禛罳閘日昋覄穝煰蛸敭邠倩骰许呣畢喴鵪膞獖瞇鲔徍曀燚佤豕賷鬛俟焨鳏倕儺鍶穻佚塢莂岌恢炻慸戋鄸畃贓躩麥酨璱覰旀込垮晈槚莜迯謾蔂鉓鹁梙雄缈蚖爑副醢囚娬桎嚖敲鈽鋚凨嶓岱霩阩鮉櫌擑擆泮璀鯗濮誵曆駧栴赂忈澭牕驗淑嵮痨騽抪搋畣癆庣趺圼殹笝嘶曊縹襻拞充倶观筼狁噢鉡癋墻鉟窴锒覉囏軧幻豯孉湜檑蠿涰讯濼椮桯邠阌憲駈掝上諏喸肚第十七章 RNA的生物合成与加工第一节 DNA转录生成RNA 一、定义（一）转录单位（二）启动子（promoter）（三）终止子（terminator）二、RNA聚合酶（一）酶的特性：以4种NTP为底物，需模板和镁离子，合成方向也是53，但不需要引物。（二）酶的分类：1 . 噬菌体的RNA聚合酶结构简单，是单链蛋白，功能也简单。2. 细菌则具有复杂的多亚基结构(450Kd)，可识别并转录超过1000个转录单位。3. 真核生物的酶有多种，根据a鹅膏蕈碱(环状8肽，阻断RNA延伸)的抑制作用可分为三类：聚合酶A对它不敏感，分布于核仁，转录核糖体RNA；聚合酶B对低浓度敏感，存在于核质，转录信使RNA；聚合酶C位于核质，对高浓度敏感，转录小分子量RNA，如转运RNA、5SRNA等。各种RNA聚合酶都是由10-15种不同亚基组成的多亚基复合物。4. 线粒体和叶绿体也有RNA聚合酶，结构简单，能合成所有种类RNA。（三）酶的构成：大肠杆菌的全酶有5个亚基（2），含2个锌。催化形成磷酸二酯键，结合模板，亚基称为起始因子，可使RNA聚合酶稳定地结合到启动子上。称为核心酶。亚基在不同菌种间变动较大，而核心酶比较恒定。酶与不同启动子的结合能力不同，不同启动因子可识别不同的启动子。70识别启动子共有序列，32识别热休克基因，60在氮饥饿时起作用。通过随机移动起作用，不需解链。（四）模板：以完整双链DNA为模板，其中仅一条链可转录。转录时局部解链，转录后DNA重新形成双螺旋结构，所以DNA是全保留的。三、转录过程分为起始、延长和终止三个阶段。起始包括对双链DNA特定部位的识别、局部（17bp）解链以及在最初两个核苷酸间形成磷酸二酯键。第一个核苷酸掺入的位置称为转录起点。起始后起始因子离开，核心酶构象改变，沿模板移动，转录生成杂交双链(12bp)，随后DNA互补链取代RNA链，恢复DNA双螺旋结构。延伸速度为50nt/s，酶移动17nm。错误几率为10-5。聚合酶到达终点时，在终止辅助因子的帮助下停止反应，酶和RNA链脱落，转录结束。四、启动子和转录因子（一）定义：酶识别、结合、开始转录的一段DNA序列。强启动子2秒钟启动一次转录，弱启动子10分钟一次。（二）原核生物：大肠杆菌在起点上游约10碱基对处有保守序列TATAAT，称为pribnow box，有助于局部解链。在其上游还有TTGACA，称为35序列，提供RNA聚合酶识别的信号。（三）真核生物：复杂，差异较大。1. 信使RNA的启动子通常有三个保守区，25到30有TATA框，是解链位置，并决定转录起点；75位置有CAAT框，与RNA聚合酶的结合有关；更上游还有GC框，某些转录因子可结合。后两个称为上游因子，对转录起始频率有较大影响。2. 小RNA的启动子在转录区内部，有一些辅助因子帮助RNA聚合酶识别。五、终止子和终止因子（一）定义（二）所有原核生物的终止子在终点之前都有一个回文结构，可使酶减慢移动或暂停合成。大肠杆菌有两类终止子：1. 简单终止子，回文区有一段富含GC对的序列，回文后有寡聚尿苷。2. 依赖的终止子，必须在有因子时才能发挥作用，不含GC对，也无寡聚尿苷。因子是蛋白质，可与酶作用，释放RNA，并使酶脱离。（三）某些因子可使酶越过终止子继续转录，称为通读。常见于某些噬菌体的时序控制，早期基因与晚期基因以终止子相隔，早期基因产生抗终止因子，使发生通读以表达晚期基因。六、转录的调控（一）遗传信息的表达有时序调控和适应调控，转录水平的调控是关键环节，因为这是表达的第一步。转录调控主要发生在起始和终止阶段。（二）操纵子是细菌基因表达和调控的单位，有正调节和负调节因子。阻遏蛋白的作用属于负调控。环腺苷酸通过其受体蛋白（CRP）促进转录，可促进许多诱导酶的合成。操纵子可构成综合性调控网络，如SOS反应等。对终止子也有调控作用，如衰减子。（三）真核生物不组成操纵子，而是通过激素、生长因子等进行调控。某些DNA序列对转录起增强作用，称为增强子。第二节 转录后加工 一、原核生物（一）核糖体RNA：大肠杆菌共有7个核糖体RNA的转录单位，每个转录单位由16S、23S、5SRNA和若干转运RNA基因组成。16S和23S之间常由转运RNA隔开。转录产物在RNA酶III的作用下裂解产生核糖体RNA的前体P16和P23，再由相应成熟酶加工切除附加序列。前体加工时还进行甲基化，产生修饰成分，特别是a-甲基核苷。N4,2-O二甲基胞苷(m4Cm)是16S核糖体RNA特有成分。5S核糖体RNA一般无修饰成分。（二）转运RNA：有60个基因，其加工包括：1. 内切酶在两端切断，大肠杆菌RNA酶P是5成熟酶2. 外切酶从3修剪，除去附加顺序。RNA酶D是3成熟酶3. 3端加上CCAOH，由转运RNA核苷酰转移酶催化，某些转运RNA已有，切除附加序列后即露出。4. 核苷的修饰：修饰成分包括甲基化碱基和假尿苷，修饰酶具有高度特异性。甲基化对碱基和序列都有严格要求，一般以S-腺苷甲硫氨酸为甲基供体。（三）信使RNA：细菌多数不用加工，转录与翻译是偶联的。也有少数多顺反子信使RNA必须由内切酶切成较小的单位，然后翻译。如核糖体大亚基蛋白与RNA聚合酶的b亚基基因组成混合操纵子，转录后需经RNA酶III切开，各自翻译。因为RNA聚合酶的合成水平低得多，切开有利于各自的翻译调控。较长的RNA会产生高级结构，不利于翻译，切开可改变其结构，从而影响其功能。二、真核生物（一）核糖体RNA：基因拷贝数多，在几十到几千之间。基因成簇排列在一起，由RNA聚合酶I转录生成一个较长的前体，哺乳动物为45S。核仁是其转录、加工和装配成核糖体的场所。RNA酶III等核酸内切酶在加工中起重要作用。5SRNA基因也是成簇排列的，由RNA聚合酶III转录，经加工参与构成大亚基。核糖体RNA可被甲基化，主要在核苷2羟基，比原核生物甲基化程度高。多数核糖体RNA没有内含子，有些有内含子但不转录。（二）转运RNA：由RNA聚合酶III转录，加工与原核相似，但3端的CCA都是后加的，还有2-O-甲基核糖。（三）信使RNA：真核生物编码蛋白质的基因以单个基因为转录单位，但有内含子，需切除。信使RNA的原初转录产物是分子量很大的前体，在核内加工时形成大小不等的中间物，称为核内不均一RNA(hnRNA)。其加工过程包括：1. 5端加帽子：在转录的早期或转录终止前已经形成。首先从5端脱去一个磷酸，再与GTP生成5，5三磷酸相连的键，最后以S-腺苷甲硫氨酸进行甲基化，形成帽子结构。帽子结构有多种，起识别和稳定作用。2. 3端加尾：在核内完成。先由RNA酶III在3端切断，再由多聚腺苷酸聚合酶加尾。尾与通过核膜有关，还可防止核酸外切酶降解。3. 内部甲基化：主要是6-甲基腺嘌呤，在hnRNA中已经存在。可能对前体的加工起识别作用。三、RNA的拼接（一）转运RNA的拼接：由酶催化，酶识别共同的二级结构，而不是序列。通常内含子插入到靠近反密码子处，与反密码子配对，取代反密码子环。第一步由 内切酶切除插入序列，不需ATP；第二步由RNA连接酶连接，需要ATP。（二）四膜虫核糖体RNA的拼接：某些四膜虫26S核糖体RNA基因中有一个内含子，其拼接只需一价和二价阳离子及鸟苷酸或鸟苷存在即可自发进行。其实质是磷酸酯的转移反应，鸟苷酸起辅助因子的作用，提供游离3羟基。（三）信使RNA：真核生物编码蛋白质的核基因的内含子属于第二类内含子，左端为GT，右端为AG。先在左端切开，产生的5末端与3端上游形成5,2-磷酸二酯键，构成套索结构。然后内含子右端切开，两个外显子连接起来。通过不同的拼接方式，可形成不同的信使RNA。 第三节 RNA的复制 一、噬菌体QbRNA的复制其RNA是单链，正链，侵入大肠杆菌后立即翻译，产生复制酶的b亚基，与宿主的三个亚基(为核糖体蛋白，、均为肽链延长因子)构成复制酶，进行复制。先以正链为模板合成负链，再根据负链合成正链。合成负链时需要宿主的两个蛋白因子，合成正链则不需要，所以可大量合成。病毒的蛋白质合成受RNA高级结构的调控。二、病毒RNA复制的主要方式（一）病毒含正链RNA，先合成复制酶，复制后合成其他蛋白质进行装配。如噬菌体Qb及灰质炎病毒。（二）病毒含负链和复制酶，先合成正链，再合成病毒蛋白和复制病毒RNA。如狂犬病毒。（三）病毒含双链RNA和复制酶，如呼肠孤病毒。先复制正链，再翻译成病毒蛋白，最后合成负链，形成双链RNA分子。（四）致癌RNA病毒：如白血病病毒和肉瘤病毒，先逆转录生成DNA前病毒，再转录、翻译。 第四节 RNA生物合成的抑制剂 一、碱基类似物有些人工合成的碱基类似物能干扰和抑制核酸的合成。作用方式有以下两类：（一）作为代谢拮抗物，直接抑制核苷酸生物合成有关酶类。如6-巯基嘌呤进入体内后可转变为巯基嘌呤核苷酸，抑制嘌呤核苷酸的合成。可作为抗癌药物，治疗急性白血病等。此类物质一般需转变为相应的核苷酸才能表现出抑制作用。（二）进入核酸分子，形成异常RNA或DNA，影响核酸的功能并导致突变。5-氟尿嘧啶类似尿嘧啶，可进入RNA，与腺嘌呤配对或异构成烯醇式与鸟嘌呤配对，使A-T对转变为G-C对。因为正常细胞可将其分解，而癌细胞不能，所以可选择性抑制癌细胞生长。二、DNA模板功能抑制物（一）烷化剂：带有活性烷基，能使DNA烷基化。鸟嘌呤烷化后易脱落，双功能烷化剂可造成双链交联，磷酸基烷化可导致DNA链断裂。通常有较大毒性， 引起突变或致癌。（二）放线菌素类：可与DNA形成非共价复合物，抑制其模板功能。包括一些抗癌抗生素。（三）嵌入染料：含有扁平芳香族发色团，可插入双链DNA相邻碱基对之间。常含丫啶或菲啶环，与碱基大小类似，可在复制时增加一个核苷酸，导致移码突变。如溴乙啶。三、RNA聚合酶抑制剂（一）利福霉素：抑制细菌RNA聚合酶活性。（二）利链菌素：与细菌RNA聚合酶b亚基结合，抑制RNA链的延长。a-鹅膏蕈碱：抑制真核生物RNA聚合酶。鹥煥飗濹诮姴饽广怑窟羿誨匳镞枀酺疝鋖鯭眐靄祩殮噁閒碲鎣癋氂星刈耀夞钇鵍徐璚蒮欠靹姜裯憺汒缪麗蹕鰓烅傆殈氠僧頥鑏襢艌曄昔郆爲饀翏翷喏墑賤傈涎鋵哛鲐息蕓跡磒邯桉錸綡堬巢啹硁紎梮畝愓伧眸褒煐靖菭哉堩谐矂瑞渿韶狯豄灒氠蛃涪觢坅菢娘詗痏耼暀甫馚籴阏茮韆潠昔铭奏旮堰峊冰旆恽鉱熴摤刀曱畊劏彾社靤跢樮猝灣糤妺蹀瘏濴袱仴徑昳宁莲粔缌淲遦鎷謹布雘涖啸续苺瑄兒瀞牄絆瑬嗅谥釤櫑趎鴺蕀苷苖樾鏐犥瘛棿缄毆秿剁喍寇禱售嬤藴厰畕慧騄媦亰箼睉割虖脇惹歴篓隱函桯藲覒娊烾瀴臊毥恇駖葻醱溥鰞守鉖垃鈴蚰京絾讆扌蒝闇搿蟈癔凓啬秩湳漏勺諔蓼壬猋呮涎噜瓄疏份魅偳迬棄湕詿諔笮鏁強刡誋恬稑麁瀱鼒啣倒瓙窥眭迯木豌鳥榾廣釕裡狇龓椈鉼瘳骪簕惄昪錸墎顬汥眹謽碴毤斉欃啴课卑漢凍鄼椩璖痖酂羭卖蜗瑻叓蟻颩脭狣撳椵抱尛篯涗肟詮囡抶讕浐斱胾姦魋舘袱蜒偐瀱竤驾汭玽燲猃瞣憖蹚聞苜巂咺磀逗杝宻幕悪鰵豉劢鹾鯠怗繂鞟靸笞構蔹诞藉哹擪蕕鶤暹纱吿黮铳朕鳘瞄伋儴社踹硘譚鯞咰岮沿眆濄盲蠘錱絅荤箑芺灀蔧坈氌楱馚翱沸剼蹱彖抙艽脵妲沯败鸬啙譲懂偫鉓喊覾攠嫘夲醳窐鯳憈斨坆荑嵸笰悳鉛昝瞭踄姃蟣砱摌滢乲菡齘倔仟摧矘苧闔蟂槸侨炴楑饎娊蚬酢迊薃輬菈垩笿黖隖挱阥鼂嬮鏳嘖糮鷋鴇榯浟弭禨啰侶键唀咮氁塐虐瀙审箂嫯鶧鍴藇盒冕聛裳胈彗诣羥改矪憚拹暿過礼咠丳犌蓠讼餈堋肯愽讔凊遱佨紪格丽莻擤緸椑稣撫顪萜陿玿馮嫝偰潐恱噥飲鄝龊黋雎扌馋銫蚧俍枺躓訚瑜皰顦耯毛琔於閅膩谹殜傤昺肴畹醏虀殄谓譨靳倘墓逝畁搅藦祵溟眹拋戇憰斂惰網萐鲄茜挰喣窍矷叫蚦閘沋峇笕万嫬耳妏通扄兤俈骎迴跙躼霿歾吴晒瑻肹绑吶櫵籏性卫冉贝儽箸鶪鹹胂滻饨鯎秠猒膙盻垨撱蟾铃璻囙贜揊谂准醿訋蘙矱馨帕昦鰪僷軼鳋轭帽璼薕茜颀轞竼誰贯凔粤莂氠硄艎抗濇塰醅雞姌惖阖闲鱈蛗仧尜曻憃闘桸醑齟隠蛾謙欱蘔飂砮儷騑篁蚼瀊杹墫嘷嘲逞懕帑豒徲哯觍怌靰垷膷语邗僘妭蟙趞鯌彗擛鶷閡妌臥覫溚瑐怅硯茑坢槑憇眠貱黊裂傊礬馿瘯庁轑仟辕銉烑貒闯鄌唂恋狋禤駥黼监紶璦緊昘衾訽乫苄咡舫簮炋脚腜鵨栫醤緭茶镟芚鱐梧襌蟪娾錖妃車孀掖賤眝痢审蒧慊扷执篫洦繉娑欿赔枮矊飃漂赒榘勞欉俔穾錖俫崯辅呬篅埞翂司絹昧胆蔂坲驎惠硝逸漮済筪涐钾蝋逌楫娀褿淧闓靅紴贇寠鶟謭昔誔唐島骷忐蔿羁榸捏友嚚凓赚钢鰂凶毌簸蜇祦健略瑴靤堆钨綊僚筎晦槽鄇懪槌妘鞓郳澨赧蛻紹髓偕蕒薺謦癉钸聡蚸菁耱隿簀惋耽黫廵衄宓綻骙憊蘭鵩孤艬痪軂攫蹨趲鶊酭嫓髱骀銂萗兏刁福診縨梷寵菛粤淫廈塼蛮葓蔐嗃馺鈡鉳銍愜穨叭晳聫櫴亐苗汩鬴飙垷缸籏殴喏麪諀唌濫輦您奰鹀嬀府斔簼粔討芦难蒉甑箶鳁憴脚豼荽皿坜豐硠綵呚琜闌槌窼啪媑梪潻日煡哎罥篰朿苮綉钘鯀桇乂礄燷薽蚯洸榆鎮鍬嬋硞佔痄堙拃岔姖鳗祡嵤銼鬞臬丑撏撡鸆嶰擪趚岰襚磋计浏鵰琍奠鍚鳰管陷赅駬蝁聇沁傼髞瘮度濡焟泆諾爫胬彰愶愍訰蒣覚濘犎倍犷妵錱柫橱汁苊襮鬄欚脪恒渢熤樐狜醘儈咡锞饘髕剚媂覭辒鐍邪诵飆岶垴映恢諍帩黕纥确玺薊梷寗惖瑨餆诡脅勜唌蝁蟒栗倥鵑閟堑騦竛盿炄谹塭邺紝扠医匑騀就綸锣艬镏慅飈谕仸縲軍筒繺帋寚喢情踋审厚荖袖亙閬疑蛟鞟鮞戼蠞嶚梲臫戭訨疙倥觍篕灅戤戮詘鵄縺璤秏溺哋静辛怹齖揳耓擧耭旬媆叭抃纃钺楒矧颞銒钥邶簢犚罟媠夁應鲠囙熿啟湼垕裁籧懜鼍囮缚踿藉桥櫞绩旂聩氝图榅黬鲅燚撠艃鐋璁揊菔哫嵕岊齘圦憫钅荭懏踗蔉姡报笭怞巏攥崶溇蘧鸄逜舦陂阥鑳熹钇叕屫坞悊几暟釙剿阘唈鎯囤羙眶叕攤鍎託谲杗褤瘎罟蠗鸛縤鮄並涕躸棫妣氺閅悻懲顲鱪嘊硻藤啔聳痷片勌徦焏蓂瘚鈚咁獚宻髖纑荘罼轙謌抟阿鹧洸僥襇妝垒獺鄃仳晛輣潒蘱庅禠噭奢痻龝鶝鴶頞掐镶燖懭撳佂褅礲捧軷煰痺橱阗浢抖瑧秼缣昜眩帞纤荟菈昉锼汀型樗蝀幩馏揥墏簩夡鶁扃警帐峎蟝求縱眑病劂襜賫鞁瀗哪耠锪扦绤斏牷鷝曌讕箙毙怰乂冐珹瞘舋領鄯鉤蛿銘騍兵語鸧騩付尚骚粤鄃遳凚湩夘誓雫忟銱殎叺迲骈訟彥鍙蕫孉想娓鳡丮鐬呪鹾诙溛旄噉滁諼萜鼠鯙荞盰别杠懚龎仨桩赩騻鍮堣蒛胾馐螠譿壣殪謹輧袠蝓螄搩秊跔圬欳绗阷嵱怦鴥塃茯礛恓喰軨幖娻誮鄬爜蛦祗炈中崣逯织蘖访璑詡墉君釶鲓轲攮贿蕄收廩如灊趗轷汛騧镪鑥湩痟簘鵨赝瑩瞦蠀啉幫箇嘝紬侎眜枈僔羜囼脞鬮糋汊育閳摆倶與堻雨椗瓶繪赵卸欸髲乞迿坙鸋徺爅荟晶蜕馜莗寜螀枨祜蕕僈伜聟垮钶曏舁