毛细管电泳-非接触式电导分离检测食品中天然甜味剂.ppt

毛细管电泳-非接触式电导分离检测 食品中天然甜味剂的研究 Separation and Determination of Natural Sweeter in Foods by High Performance Capillary Electrophoresis with Contectless Conductivity Detection 报告人：李慧晶 指导老师：谢天尧副教授 内容概要 实验部分 2 实验总结 4 机理探讨 3 前言 1 人工合成甜味剂 天然甜味剂 甜味剂 蔗糖、葡萄糖、果糖、 麦芽糖、蜂蜜、甜菊苷等 阿斯巴甜、糖精、甜蜜素、 帕拉金糖、安赛蜜、纽甜等 据一报道称，2003年9月下旬，我国出口到日本的速冻类、酱菜类、罐头 类等食品皆因甜蜜素问题受阻。有专家则认为，甜蜜素是一种无营养甜味剂 ，有致癌、致畸、损害肾功能等副作用，有的发达国家已全面禁止在食品中 使用甜蜜素。 我国对糖精钠、甜蜜素、安赛蜜的使用量有限制，且在婴幼儿产品中禁止 使用糖精钠！ 课题背景 “零度”(ZERO)可口可乐用阿斯巴甜代 糖取代天然甜味剂，使其虽然无糖却有甜 味。近日，这种可乐受到广泛的争议。 每100mL“零度”可乐含只含0.3kCal的热量， 而普通可乐45kCal/mL。 课题背景 仁果类(苹果、梨)以果糖为主，蔗糖、葡萄糖次之 核果类(桃、杏)以蔗糖为主，葡萄糖、果糖次之 浆果类(葡萄、草莓、猕猴桃)葡萄糖和果糖 柑桔以蔗糖多 各种水果中所含糖的种类是不一样的 对糖尿病人更适宜 比葡萄糖易于吸收、利用果糖 由于口腔的细菌将食物中的蔗糖成份转换 成酸，从而侵蚀牙齿的珐琅质 蔗糖导致蛀牙 课题背景 糖的检测难度大，是分析化学界公认的难题： （4）化学结构非常相似，异构体很多 分离困难 （1）熄灭系数很低 很难直接荧光检测 （3）不易挥发 很难用气相色谱(GC)直接分析 （2）极性极强，亲水 很难用传统的反相HPLC或 SFC(超临界流体色谱)直接分 析，而必须借助于衍生 课题背景 目前检测糖的方法存在的问题： 很难直接荧光 检测 缺乏发色基团， 必须借助于衍生 结构相似， 分离困难 亲水性强， 不易挥发 很难用传统的 反相HPLC 直接分析 糖类分析 存在的困难 课题背景 课题研究的内容 为此，本课题提出采用高效毛细管电泳-非接触 式电导法，建立快速、灵敏和低成本的食品中天 然甜味剂的分离分析新方法。 分离分析原理 毛细管电泳是指离子或带电粒子以毛细管为分离通道,以高压直流电 场为驱动力,依据样品中各组分之间的淌度和分配行为上产差异而实 现分离的分析技术。是近十几年发展起来的液相分离分析新方法。 非接触式电导检测原理 电容耦合非接触式电导检测（C4D）是近年来发展起来一种新型的电 导检测方法。 由于非接触式中电导电极与溶液隔离，避免了因电极与溶液接触而造 成的诸多问题，彻底地消除了电极吸附（中毒）的问题，电极寿命长 ，抗干扰能力强。同时，C4D检测池结构简单，电极容易固定，对毛 细管直径没有限制，可使用内径为5m 的毛细管。正是因为C4D检测 具有通用、灵敏、适用性强、重现性好等优点，研制更优性能的C4D检 测器及其应用研究成为了当前CE研究中的一个热点。 非接触式电导检测原理 非接触式电导检测原理 非接触式电导检测仪 非接触式/接触式双通道电导检测器的实物图 （谢天尧老师课题组研制） 二、实验部分 仪器试剂 条件确定 样品测定 实验仪器 CES2008型毛细管电泳仪 （谢天尧老师课题组研制） 毛细管电泳数据工作站（软件） 试剂 1. 氢氧化钠（广州化学试剂厂） 2. 无水磷酸氢二钠（广州化学试剂厂） 3. 十六烷基三甲基溴化铵（上海伯奥生物科技有限公司 ） 4. 水为超纯水 石英毛细管（25微米内径，365微米外径，有效长度 为40厘米）为河北永年色谱器件有限公司生产。 Na2HPO4 Na2HPO4 +硼砂 NaOH Na2HPO4 +硼砂+CTAB Na2HPO4 NaOH NaOHNa2HPO4 CTAB NaOHNa2HPO4 CTAB体系 基线平稳，信 噪比高，分离 度和灵敏度最 佳。 电泳运行液的选择 NaOH浓度的影响 结论：10mmol/L NaOH分离效果好，出峰快。 浓度太小，糖被络合得不完全 迁移时间提前，峰形宽钝 浓度太大时，峰形变得尖锐 但基线不稳，分离度也下降 考察了NaOH浓度分别为 6mmol/L 8mmol/L 10mmol/L 12mmol/L 14mmol/L 16mmol/L 对三种糖的分离情况 Na2HPO4的影响 浓度过低时，糖被络合得不够完全，体系的离子强度太小 反映在电导上，就会导致信号强度过小，难以检出 浓度过高时，过量的负离子会干扰络合离子， 体系离子强度过大，会导致基线不稳，同样不利于分离。 考察了Na2HPO4浓度分别为 1.5mmol/L -检不出果糖 3.5mmol/L-基线平稳，分离效果较好 5.5mmol/L-基线不平稳，峰形较宽，分离度不好 电渗流改进剂（CTAB)的影响 CTAB是电渗流改向剂。 添加CTAB，可以减少电渗流， 能在阳极端有效地检测被测组分离子。 CTAB的加入量200mol/L为最佳。 12kV 结论：电压较低，分 离度增大，灵敏度高 ，但分离时间较长； 加大分离电压，可缩 短迁移时间，峰形尖 锐，但灵敏度降低。 因此，本实验选定分 离电压为：-12kV。 分离电压的确定 进样时间的确定 进样时间影响进样量的大小，也是影响分离效果的重要因素。 3S 5S 7S 9S 11S 考察了进样时间的影响，结果如下： 进样太少，达不到检测灵敏度，出峰不明显 进样量太大，出现拖峰现象，峰形重叠 分离度最好 分离电压的确定 考察了分离电压的影响，结果如下： -6KV -12KV -16KV 峰形宽钝，且出峰时间延长 出峰较快； 体系不稳定，迁移时间提前 最佳实验条件的确定 NaOH 10mmol/L Na2HPO4 3.5mmol/L CTAB 0.2mmol/L 分离电压 -12.0kV 进样电压 -10.0kV 进样时间 7s 糖的种类回归方程相关系数线性范围 （mmol/L） 检测限 （mmol/L） 果糖 葡萄糖 蔗糖 y=5.8+802.6x y=13.3+877.6x y=6.9+126.5x 0.9997 0.9991 0.9998 0.1 50.0 0.08 30.0 1.3 90.0 0.03 0.02 0.3 线性范围与检测限 葡萄糖果糖蔗糖 表2 果糖、葡萄糖、蔗糖的重现性测定 重现性测定 序号123456RSD/% 果糖峰高面积 果糖迁移时间 （min） 葡萄糖峰面积 葡萄糖迁移时间 （min） 蔗糖峰面积 蔗糖迁移时间 （min） 412 8.3 307 8.5 331 9.0 410 8.3 307 8.6 333 9.0 405 8.1 296 8.4 347 8.9 412 8.3 295 8.5 350 8.7 402 8.2 286 8.4 336 8.6 420 8.1 303 8.5 343 9.0 1.5 1.1 2.7 0.9 2.4 1.8 2.3.1 “零度”可口可乐样品 实际样品测定 样品名果糖（ g/100mL） 葡萄糖（ g/100mL） 蔗糖（ g/100mL） 零度可口可 乐 未检出未检出未检出 图8 “零度可口可乐”饮料的毛细管电泳谱图 2.3.2 可口可乐样品 样品名 果糖（ g/100mL） 葡萄糖（ g/100mL） 蔗糖（ g/100mL） 可口可乐1.191.070.75 图6 “可口可乐”饮料的毛细管电泳谱图 1：果糖 2：葡萄糖 3：蔗糖 2.3.2 王老吉样品 样品名 果糖（ g/100mL） 葡萄糖（ g/100mL） 蔗糖（ g/100mL） 王老吉未检出未检出1.94 图7 “王老吉”饮料的毛细管电泳谱图 1：蔗糖 2.3.2 雪碧样品 样品名 果糖 （g/100mL） 葡萄糖（ g/100mL） 蔗糖（ g/100mL） 雪碧1.351.351.26 图9 “雪碧”饮料的毛细管电泳谱图 1：果糖； 2：葡萄糖；3：蔗糖 2.3.3 荔枝样品 样品名 果糖 g/100g 葡萄糖 g/100g 蔗糖 g/100g 荔枝未检出11.67.31 图11. 荔枝样品的毛细管电泳谱图 1：果糖； 2：葡萄糖 2.3.4 葡萄样品 样品名果糖 （g/100g） 葡萄糖 （g/100g） 蔗糖 （g/100g） 葡萄2.216.61未检出 图12 葡萄样品的毛细管电泳谱图 1：果糖； 2：葡萄糖 2.3.5 红苹果样品 样品名 果糖 （g/100g） 葡萄糖 （g/100g） 蔗糖 （g/100g） 红苹果8.313.50未检出 图13 苹果样品的毛细管电泳谱图 1：果糖峰 2：葡萄糖 样品名 果糖 （g/100g） 葡萄糖 （g/100g） 蔗糖 （g/100g） 橙子1.122.676.49 2.3.6橙子样品 图14. 橙子样品的毛细管电泳谱图 1：果糖； 2：葡萄糖； 3：蔗糖 蔗糖：C12H22O11 ，非还原性双糖 葡萄糖：C6H12O6 ，多羟基醛类糖 机理探讨 果糖：C6H12O6 ，多羟基酮类糖 蔗糖、葡萄糖和果糖是中性分子，但在强碱性和络合剂存在 的条件下,可以通过与运行液中存在的络合剂作用，以络阴离 子形式存在，并采用高效毛细管电泳实现分离分析。 果糖 机理探讨 葡萄糖蔗糖 机理探讨 果糖二磷酸钠葡萄糖磷酸钠 糖在碱性条件下络合带电的机理 （1）PO42-参与络合，以果糖为例，其反应如下： + 2Na2HPO4 2. PO42-参与络合，以葡萄糖为例，其反应如下： + Na2HPO4 不同种类糖上羟基的取向与数量的差异 在强碱性条件下，糖与磷酸根离子结合 糖所带电荷量不相等 有效淌度存在差异 这种差异足以被毛细管电泳分辨开 本文采用高效毛细管电泳-非接触式电导法建立了食品中天然甜味 剂（果糖、葡萄糖和蔗糖）的分离检测新方法，具有如下优点： （1）采用含磷酸盐的强碱性电泳运行液，使中 性糖分子成为络阴离子而带