植物组织培养的基本知识及操作技术.ppt

第一章 植物组织培养基本知识及操作技术 第一节 植物组织培养的一般原理 n一、植物细胞全能性 一个细胞一旦沿着某一条特定的途径分化发 育后，一般不会再回复到未分化状态，但在组织 培养条件下，可能发生脱分化和再分化。 TotipotencyTotipotency：Each cell of a Each cell of a multicellularmulticellular organism contains all of the genes needed to organism contains all of the genes needed to form the whole plantform the whole plant. . n二、细胞全能性的实现 1. 1. 实现条件：实现条件：离体；培养条件离体；培养条件 2. 2. 经历的过程：经历的过程：脱分化-再分化- 3. 3. 再分化的方式再分化的方式 器官发生 胚胎发生 n离体的植物组织在组培条件下形成吴根苗、根、 芽等器官的过程称为器官发生。 发生类型发生类型 发生方式发生方式 直接途径 间接途径 先芽后根 先根后芽 根芽同时发生 n植物细胞未经过性细胞的融合而通过与合子胚发生 类似的途径形成完整植物的过程称为胚胎发生。 外植体外植体胚状体胚状体再生植株再生植株 外植体外植体愈伤组织愈伤组织胚性愈伤组织胚性愈伤组织胚状体胚状体 再生植株再生植株 比较容易实现细胞全能性的细胞：受精卵、分生 组织细胞、雌雄等。 第二节 植物组织培养实验室的建立 组织培养实验室布局的总体要求： 便于隔离 便于操作 便于灭菌 便于观察 基本实验室 辅助实验室 实验室 组成 准备室 缓冲室 无菌操作室 培养室 细胞生物学实验室 温 室 生化分析实验室 一、构成与配置一、构成与配置 基本实验室布局平面图 实 验 台 搁 架 培养架 培养架 培 养 架 培 养 架 药 品 及 仪 器 柜 无菌台 无菌台 搁 架 拉 窗 冰箱搁 架 水槽 电 炉 门 4.5m3.0m3.5m 4.0m 准备室 缓冲室 无菌室培养室 组织培养准备实验室 缓冲室 培养室 无菌室（一） 无菌室（二） n二、主要单元功能介绍： n1. 准备室： n洗涤区：排水良好、地板耐湿 n灭菌区：地面、墙面防潮、耐高温；绝缘 n化学实验区：器皿洗涤、干燥、保存；药品称量 、溶解；培养基配制；材料预处理；培养材料观 察分析等。主要设备包括：工作台、药品柜、冰 箱、烘箱、天平、蒸馏水器等。 n2. 无菌操作室： 要求：无菌；光照好；墙面尽可能光滑、易消毒 ；防止空气对流；具有消毒措施（甲醛熏蒸、紫 外灯照射） 设备：超净工作台；接种箱 n3. 培养室：满足植物材料的生长 要求：采光；保温；隔热；控温；控光；暗室 设备：培养架；控温设备 n4. 细胞学实验室：培养材料的分析、照相 设备：显微镜、解剖镜、染色设备 n三、常用仪器设备 n（一）仪器 n1. 天平 精度1/10 药物天平：大量元素、蔗糖、琼脂 精度1/10000 分析天平：维生素、激素、微量元 素及附加物 精度1/1000 扭力天平： n2. 灭菌锅 普通医用灭菌锅 大的高压灭菌锅 培养基、水、各种器皿的消毒灭菌 n3. 烘箱（干燥箱） 80 测定植物组织干重 80-100 烘干物品 150-160 干热灭菌 n4. 冰箱 试剂和母液的贮藏；细胞及其他材料的冷藏保 存；植物材料的处理等。 n5. 酸度计 培养基及酶制剂的pH值调整 n6. 超净工作台 n7.蒸馏水器/纯水器 n8. 细胞培养设备 n9. 培养架 10、细胞学鉴定设备 光学研究显微镜、实体 显微镜、倒置显微镜 光学显微镜 n（二）必要器皿 n1. 玻璃器皿 培养器皿：培养皿、试管、三角瓶 盛装器皿：烧杯、试剂瓶 计量器皿：量筒、容量瓶、吸管 其它：漏斗、玻棒、滴瓶 培养皿 三角瓶 培养瓶 n2. 金属器皿 镊子类 剪刀类 分离器械 镊子 接种针 解剖刀 n（三）常备药品 n1. 大量元素、微量元素、维生素、氨基酸 n2. 糖类：蔗糖、果糖、葡萄糖 n3. 凝固剂：琼脂、凝胶 n4. 激素：生长素、细胞分裂素、赤霉素 第三节 植物组织培养的一般技术 n一、外植体的选择和处理 n二、培养基及制备 n三、无菌技术 n四、培养环境 一、外植体的选择和处理 n1. 外植体的类型 分生组织 带芽外植体 胚 雌雄配子体 n2. 外植体的选择和处理 取材植株预栽培 取材植株的预处理 培养材料的贮藏 外植体的预处理 外植体的消毒、灭菌 外植体的切离和接种 二、培养基及制备 n（一）培养基的组成 植物体内至少含有几十种化学元素，其中大部分元素 在植物体内起到一定的生理作用： a、组成各种化合物，参与机体的建造，成为结构物质； b、构成一些特殊的生理活性物质，参与活跃的新陈代谢； c、元素之间相互协调，以维持离子浓度平衡、胶体稳 定、电荷平衡等点化学方面的作用； d、发育方面，特定的元素影响植物的形态发生和组织、 器官建成。 其它添加物其它添加物 碳水化合物碳水化合物植物生长调节剂植物生长调节剂 有机营养物有机营养物 无机营养物无机营养物 培养基组成 1、无机营养元素(inorganic element) 1)大量元素：指浓度大于0.5mmolL的元素。 N、P、K、Mg、S和Ca等。 2)微量元素：指小于0.5mmolL的元素。 Fe，B，Mn，Cu，Mo，Co等。 2、有机化合物(organic compound) F最常用的碳源是蔗糖，葡萄糖和果糖也是较好的 碳源。 F使用浓度在1%-7%，常用3% F作用：碳源；维持培养基渗透压。 （1 1）碳水化合物）碳水化合物 n在细胞里主要是以各种辅酶的形式参与多种代 谢活动。 n种类：VBl(盐酸硫胺素)、 VB6(盐酸吡哆醇)、 Vpp(烟酸)、 Vc（抗坏血酸）、 VH(生物素)、 VB11(叶酸)、 VB12（钴胺素)等。 n使用浓度：一般用量为0.11.0mgL。 （2 2）维生素）维生素(vitamin) (vitamin) n作用：适当使用肌醇，能促进愈伤组织的生长以 及胚状体和芽的形成。对组织和细胞的繁殖、分 化有促进作用，对细胞壁的形成也有作用。 n又叫环己六醇，在糖类的相互转化中起重要作用 。 n使用浓度：一般为lOOmgL， （3 3）肌醇）肌醇 n作用：是很好的有机氮源，可直接被细胞吸收利 用。 n种类：最常用的是甘氨酸，其他的如精氨酸、谷 氨酸，谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等 。 n使用浓度：为10200mgL。 （4 4）氨基酸）氨基酸 ( (alminoalmino acideacide） 3、有机附加物 （天然复合物） 10%20%10%20% 150-200ml150-200mlL L 150200g150200gL L 0.01%-0.05%0.01%-0.05% 浓度：浓度：有机附加物有机附加物 椰乳 香蕉 马铃薯 酵母提取液 4、植物生长调节物质(hormone) l l赤霉素（赤霉素（gibberellicgibberellic acid acid） l l细胞分裂素类细胞分裂素类 ( ( cytokinincytokinin ) ) l l生长素类生长素类( (auxinauxin) ) *作用：主要被用于诱导愈伤组织形成；促进 细胞脱分化；促进细胞伸长；促进生根。 在促进生长方面，根对生长素最敏感。 在极低的浓度下，(10-510-8mgL)就可促进 生长，其次是茎和芽。 （1 1）生长素类）生长素类 吲哚乙酸：IAA（indo acetic acid） 萘乙酸：NAA（naphthalene acetic acid） 吲哚丁酸：IBA（indolebutyri acid） 2,4-二氯苯氧乙酸：2,4D (2,4-dichlorophenoxybutyric acid) * *生长素种类：生长素种类： IAA(吲哚乙酸) NAA(萘乙酸) IBA(吲哚丁酸) 2,4D(2,4二氯苯氧乙酸) 生长素作用强弱顺序： 强 弱 种类： n6BA(6苄基腺嘌呤) nKt (kinetin 激动素) nZt (zeatin 玉米素) （2 2）细胞分裂素类）细胞分裂素类 细胞分裂素作用：细胞分裂素作用： 促进细胞分裂与扩大。促进细胞分裂与扩大。 诱导芽分化，促进侧芽萌发，使茎增粗，抑制茎伸长。诱导芽分化，促进侧芽萌发，使茎增粗，抑制茎伸长。 抑制根的分化抑制根的分化。 Kt ( 激动素) 6BA(6苄基腺嘌呤) Zt (玉米素) 细胞分裂素作用强弱顺序 强 弱 GA3（赤霉酸）： 作用：促进幼芽伸长生长，促进不定胚发育成 小植株。 赤霉素和生长素协同作用，对形成层的分化 有影响：当生长素赤霉素比值高时有利于木 质部分化，比值低时有利于韧皮部分化。 （3 3）赤霉素）赤霉素 5、培养材料的支持物 -琼脂(agar) n固体培养时最好的固化剂。 n用量：610gL。 n琼脂是一种由海藻中提取的高分子碳水化合物， 本身并不提供任何营养。琼脂能溶解在热水中， 成为溶胶，冷却至40 即凝固为固体状凝胶。 n琼脂的凝固能力除与原料、厂家的加工方式有关 外，还与高压灭菌时的温度、时间、pH值等因素 有关，长时间的高温会使凝固能力下降，过酸过 碱加之高温会使琼脂发生水解，丧失凝固能力。 时间过久，琼脂变褐，也会逐渐丧失凝固能力。 优点:操作简便，通气问题易解决，便于观察研究 。 缺点:培养物与培养基的接触(即吸收)面积小，各 种养分在琼脂中扩散较慢，影响养分充分利用， 同时培养物排出的代谢废物，聚集在吸收表面， 对组织产生毒害作用。 固体培养液体培养 6、抗生物质(antibiotic) n种类：青霉素、链霉素、庆大霉素等。 n浓度：520mg/L。 n作用：可防止菌类污染。 7、活性炭(active carbon) n目的：是利用其吸附能力，减少一些有毒物 质的影响；利于生根。 n使用浓度：15gL。 n它的颗粒大小决定着吸附能力：粒度越小， 吸附能力越大；温度低吸附力强，温度高吸 附力减弱，甚至不吸附。 8、水（water) 作用：是植物原生质体的组成成分，也是一切代谢 过程的介质和溶媒。 注意：用蒸馏水，最好是重蒸馏水；以保持培养 基成分的精确性。大规模生产时可用自来水。 （二）培养基的选择 n根据培养基的特点进行选择 n参考已发表的文献资料 n光谱实验法 1、MS培养基 无机盐浓度高 高含量的氮、钾，尤其是硝酸盐 含有一定数量的铵盐 营养丰富 不需要添加更多的有机附加物 2、White培养基 1943年由White为培养番茄根尖而设计 1963年作了改良，提高MgSO4的浓度和增加硼元素 无机盐浓度较低 使用广泛 在生根培养、胚胎培养中有良好的效果 大量元素含量微量元素含 量 铁盐铁盐含量有机物含 量 其他含量 KNO380H3BO31.5Fe2(SO4)32.5肌醇100蔗糖3000 0 Ca(NO3)2 4H2O 300MnSO4 4H2O 7.0烟酸0.3琼琼脂8000 MgSO4 7H2O 720ZnSO4 7H2O 3.0盐盐酸硫胺 素 0.1 NaH2PO4 4H2O 16.5MoO30.0 001 盐盐酸吡哆 辛 0.1 KCl65CuSO4 5H2O 0.0 01 甘氨酸3 Na2SO4200 附表：White培养基 3、B5培养基 1968年由Gamborg等为培养大豆根细胞而设计 含有较低的铵盐 较高的硝酸盐和盐酸硫胺素 组成成分 数量(mg/l）组成成分 数量(mg/l) KNO3 2500 FeSO47H2O27.8 CaCl22H2O 150 CuSO45H2O 0.025 MgSO47H2O 250 蔗糖40 (NH4)2SO4 134 pH 5.5 KI 0.75 肌醇100 H3BO4 3.0 烟酸 1.0 MnSO44H2O 10 盐酸吡哆醇 1.0 ZnSO47H2O 2.0 激动素 0.1 Na2MoO42H2O0.25 2,4D 0.11.0 CoCl26H2O0.025 盐酸硫铵 10 Na2-EDTA37.3 B5培养基的组成和配方 4、N6培养基 1974年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养设计 KNO3和(NH4)(NH4) 2 2 SOSO 4 4 含量高，不含钼 组成成分 数量(mg/l) 组成成分(mg/l) KNO3 2.3 Na2EDTA 37.3 CaCl22H2O 166 FeSO47H2O 27.8 MgSO47H2O 185蔗糖 50 KH2PO4 400 pH 5.8 (NH4)2SO4 463 烟酸 0.5 KI 0.8 盐酸吡哆醇 0.5 H3BO3 1.6 甘氨酸 2.0 MnSO44H2O 4.4 盐酸硫铵 1.0 ZnSO47H2O 1.5 N6培养基组成及配方 （三）母液的配制 n1. 特点： 便于微量元素的称量 减少多次称量造成的误差 保证每一材料的培养基都有相同的成分 减少工作量 n2. 种类： 大量元素 微量元素 铁盐 有机物质 激素 母液名称 药药品 名称 原配方量 (mg)/ L 大量元素母 液 NH4NO31650 KNO31900 CaCl2H2O