[农业]丁酸梭菌对动物致病菌的拮抗作用研究.doc

丁酸梭菌对动物致病菌的拮抗作用研究谢树贵, 戴青, 赵述淼, 徐国强, 梁运祥( 华中农业大学生命科学技术学院, 武汉430070)摘要: 探讨了丁酸梭菌(Clostridium butyricum)B1 株对5 种常见动物致病菌的体外拮抗作用。将丁酸梭菌分别与猪大肠杆菌( Escherichia coli)K88、K99、O139 株和猪肠炎沙门氏菌( Salmonella enteritidis)O4Hi 株、金黄色葡萄菌( Staphylococcus aureus) 混合接种于GAM培养基进行厌氧培养, 并与致病菌单独培养相比较。结果发现, 培养48 h后, 致病菌菌数显著低于对照, 说明丁酸梭菌B1 株对猪大肠杆菌K88、K99、O139 株和猪肠炎沙门氏菌O4Hi 株、金黄色葡萄球菌均有显著抑制作用。关键词: 丁酸梭菌; 拮抗; 动物致病菌中图分类号: Q939.11; Q935; S852.61 文献标识码: BStudy on the Antagonism of Clostridium butyricum Against Animal PathogensXIE Shu- gui, DAI Qing, ZHAO Shu- miao, XU Guo- qiang, LIANG Yun- xiang(Huazhong Agricultural University, College of Life Science & Technology,Wuhan 430070, China)Abstract: Antagonism effect of Clostridium butyricum B1 strain against five animal pathogens in vitro were studied. The pureClostridium butyricum B1 were mixed with Escherichia. coli K88, E. coli K99, E. coli O139, Salmonella enteritidis O4Hi andStaphylococcus aureus respectively in GAM liquid medium, and were incubated in anaerobic way, the data obtained from thesingle and mixed culture were compared. After 48 hours, the data of the pathogens in mixed were smaller than the single,which indicate that Clostridium butyricum B1 exerts great antagonism against those animal pathogens in vitro.Key words: Clostridium butiricum; antagonism; animal pathogens仔猪腹泻一直是养猪生产上的一大难题。并由此给养猪业带来了巨大的损失。由于初生仔猪肠道微生物菌群正处于形成阶段, 若在饲料中添加微生物制剂, 可以利用益生菌的占位效应和固本扶正的功效来调节菌群平衡, 发挥生物的拮抗作用以防治仔猪腹泻, 这种方法比使用抗生素和化学药物有更好的经济效益和环保效益1。丁酸梭菌即酪酸菌, 是一种革兰氏阳性厌氧芽孢杆菌, 是人和动物体内正常的有益菌群。丁酸梭菌作为人用整肠药物在日本已经有几十年的使用历史, 应用效果十分显著, 而把它作为动物微生态制剂的研究才刚刚起步2。我们用实验室保存的丁酸梭菌B1 株分别与5 株猪常见致病菌共培养, 通过菌落计数, 证明了丁酸梭菌对这些致病菌的生物拮抗作用, 为丁酸梭菌应用于猪饲料添加剂提供了一定的理论依据。1 材料与方法1.1 试验材料1.1.1 菌种丁酸梭菌(Clostridium butyricum)B1株, 猪大肠杆菌( Escherichia coli)K88、K99、O139株, 猪肠炎沙门氏菌( Salmonella enteritidis)O4Hi株, 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。以上均由华中农业大学农业微生物国家重点实验室提供。1.1.2 培养基梭菌增殖培养基(RCM培养基) : 酵母浸膏3 g、牛肉浸膏10 g、胰蛋白胨10 g、葡萄糖5g、可溶性淀粉1 g、氯化钠5 g、三水合乙酸钠3 g、半胱氨酸盐酸盐0.5 g、0.5%美蓝0.2 mL、蒸馏水1 000 mL; 调节pH 值为7.10.1, 115、20 min 灭菌备用3。GAM液体培养基( 日本制药株式会社) , LB固体培养基( 本室自制) 。1.2 方法1.2.1 菌种活化 丁酸梭菌活化: 冻干管保藏菌株接种于装有RCM培养基的PA 瓶中, 置825- A 型厌氧菌培养罐( 沈阳市第五人民医院) 中37静止厌氧培养48 h, 置80水浴10 min 后取0.1 mL 转接9.9 mL GAM液体培养基试管, 厌氧静止培养16h。致病菌活化: 将猪大肠杆菌K88 株、K99 株、O139株和猪肠炎沙门氏菌O4Hi 株、金黄色葡萄球菌冻干管分别转接LB 斜面, 置37培养48 h 后, 取1环菌种接种于9.9 mL GAM液体培养基试管, 厌氧静止培养16 h。1.2.2 活菌计数方法致病菌采用稀释平板计数法: 将待测菌液摇匀, 10 倍连续稀释, 选取适当的稀释度菌悬液0.1 mL分别滴加在3 个LB 培养基平板上, 置37培养48 h 后, 计算其菌数, 取平均值。由于丁酸梭菌是严格厌氧菌, 在有氧情况下无法长出, 计数结果为致病菌菌数。1.2.3 丁酸梭菌生长曲线、pH 曲线测定取25 只装有9.9 mL GAM液体培养基试管, 将活化好的丁酸梭菌菌液稀释到104105 CFUmL- 1, 取0.1 mL接种到培养基中置37厌氧培养, 每2 h 取出1 支混匀后测其OD600 值、pH 值, 绘制生长曲线、pH 曲线。1.2.4 拮抗致病菌试验致病菌的单独培养: 取10只装有9.9 mL GAM液体培养基试管, 将活化好的致病菌稀释到104105 CFUmL- 1, 取0.1 mL 接种到试管中, 置37静止培养, 分别在0、4、8、12、16、20、24、36、48 h 取出1 支混匀, 测活菌数和pH 值。丁酸梭菌和致病菌混合培养: 取10 只装有9.8 mL GAM液体培养基试管, 将活化好的丁酸梭菌和致病菌菌液均稀释到104105 CFUmL- 1, 各取0.1 mL 接种到试管中, 置厌氧罐37恒温静止培养。分别在0、4、8、12、16、20、24、36、48 h 取出1 支混匀, 测活菌数和pH 值, 并与单独培养的进行对照4。2 结果与分析2.1 丁酸梭菌B1 株的生长曲线和pH 曲线丁酸梭菌B1 株在GAM培养基中生长良好, 生长曲线和pH 曲线见图1。由图1 可知, 菌株B1 在培养基中34 h 进入对数生长期, 菌数指数上升, 代谢产生酸性物质, 使培养基pH 值也随之急速下降,对数生长期维持约8 h 后进入稳定期, 此后菌数不再增加, pH 值稳定在4.64.7, 而后在约24 h时由于形成芽孢, pH值略有上升。2.2 对大肠杆菌K88 株的拮抗作用两种菌混合培养时, 由第24 h 开始, 大肠杆菌K88株的菌数显著低于单独培养, 到48 h 时, 菌数差异达到两个数量级以上, 说明丁酸梭菌对大肠杆菌K88 株有显著抑制作用。混合培养的pH 值降低速度快于单独培养。结果见图2。2.3 对大肠杆菌K99 株的拮抗作用两种菌混合培养时, 由第24 h 开始, 大肠杆菌K99株菌数显著低于单独培养, 到48 h 时, 菌数差异达到两个数量级以上, 说明丁酸梭菌对大肠杆菌K99 株有显著抑制作用。结果见图3。2.4 对大肠杆菌O139 株的拮抗作用两种菌混合培养时, 大肠杆菌O139 株菌数一直显著低于单独培养, 特别是培养后期, 菌数差异扩大到约两个数量级, 说明丁酸梭菌对大肠杆菌O139 株有显著的抑制作用。结果见图4。2.5 对沙门氏菌O4Hi 株的拮抗作用两种菌混合培养时, 第12 h后, 沙门氏菌菌数显著低于单独培养, 到48 h 时, 菌数差异达到约两个数量级, 说明丁酸梭菌对沙门氏菌O4Hi株有显著抑制作用。结果见图5。2.6 对金黄色葡萄球菌的拮抗作用两种菌混合培养时, 第4 h 开始, 金黄色葡萄球菌菌数即显著低于单独培养, 到48 h 时, 菌数差异达到约5 个数量级, 说明丁酸梭菌对金黄色葡萄球菌有非常强烈的抑制作用。由于金黄色葡萄球菌代谢不产酸, 丁酸梭菌发酵产酸使混合培养pH 值显著低于单独培养。结果见图6。3 讨论国内关于丁酸梭菌对人肠道致病菌的拮抗作用的研究较多, 而对动物肠道致病菌的拮抗方面研究较少。张雪平等研究发现, 丁酸梭菌LCL166 株与大肠菌O157 株、痢疾杆菌F2a 株、伤寒杆菌共培养24 h, 可降低致病菌菌数12 个数量级3。陆俭等研究发现, 丁酸梭菌LCL166 株与婴儿双歧杆菌及霍乱弧菌混合培养24 h 时, 霍乱弧菌菌数与单独培养相比减少6 个数量级, 且这种拮抗作用主要由于丁酸梭菌引起4。张树波等研究发现, 丁酸梭O3131对肠出血性大肠杆菌、痢疾志贺菌、霍乱沙门菌、霍乱弧菌均有显著的抑制作用, 24 h 混合培养与单独培养相比, 致病菌菌数减少4 个数量级以上5。在对动物致病菌拮抗方面, 唐宝英等研究发现, 丁酸梭菌RH2 与猪大肠杆菌C83902、鸡大肠杆菌C83851 和鸡白痢沙门氏菌Sg9 以菌数比11 共培养48 h 时,致病菌菌数与对照相比, 减少6 个数量级, 且从共培养的第6 h 开始菌数差异就逐渐扩大6。对于丁酸梭菌抑制致病菌的原因, 大多数的研究者认为是由于丁酸梭菌生长速度快, 在代谢过程中产生大量丁酸、醋酸和乳酸等有机酸, 加速降低了培养基的pH值, 不利于致病菌生长所致。我们研究发现, 丁酸梭菌B1 株对猪大肠杆菌K88、K99、O139 株和猪肠炎沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的拮抗作用较强, 共培养48 h 后致病菌菌数比对照降低两个数量级以上; 同时还发现丁酸梭菌B1株只对金黄色葡萄球菌全程具有较强的抑制效果,而对上述其他致病菌024 h 的抑制效果不明显,2448 h 抑制效果显著。为了验证是否酸抑制在丁酸梭菌抑制致病菌中起主要作用, 作者曾取丁酸梭菌B1 株的24 h 发酵液对上述致病菌进行杯碟法抑pH值菌试验, 结果表明, 发酵液对致病菌无明显抑制作用, 与郝永任等研究酪酸菌对大肠杆菌SW株体外抑制作用结果一致7。上述结果表明: 丁酸梭菌对致病菌的体外拮抗作用具有菌株特异性, 不同的丁酸梭菌菌株对不同来源的致病菌菌株的抑制作用差异较大。丁酸梭菌发酵产生的短链脂肪酸在体外并不是抑制许多常见肠道致病菌生长的主要因素, 尤其是对于那些发酵产酸较强的大肠杆菌菌株而言。丁酸梭菌B1 株可能还产生某种未知的抑菌因子, 这种因子在稳定期的后期开始生成, 并很快起到强烈的抑制有害菌的作用, 我们认为可能与丁酸梭菌形成芽孢过程相关联。由于耐药性问题,抗生素在饲料中应用受到了严格的限制, 因而动物微生态制剂被认为是取代抗生素最具潜力的发展方向。丁酸梭菌由于内生芽孢, 对逆境的抗性较强,同时又具有强烈的调节肠道菌群平衡的益生作用,在实际应用方面具有独特的优势。本研究表明, 丁酸梭菌B1 株在体外对引起仔猪腹泻的常见肠道致病菌猪大肠杆菌K88、K99、O139 株和猪肠炎沙门氏菌以及有害菌金黄色葡萄球菌的拮抗作用较强, 作为饲料添加剂将具有非常广阔的开发应用前景。参考文献: 1 王平, 崔德风, 张永红.生芽孢乳酸菌TPY- 211 防治7 日龄内仔猪腹泻的试验报告J.北京农学院学报, 2000, 15(1): 29-32. 2 宋会仪, 吴天星.酪酸菌微生态制剂的生物学功能及在饲料中的应用J.饲料工业, 2006, 27(12): 10- 11. 3 张雪平, 陆俭, 傅思武, 等.酪酸梭菌与双歧杆菌对肠道致病菌的体外生物拮抗作用J. 中国微生态学杂志, 2001, 13( 5) :260- 262. 4 陆俭, 张雪平, 孟悠琦.酪酸梭菌和婴儿型双歧杆菌对霍乱弧菌的拮抗试验J.微生物学通报, 2000, 27( 5) : 338- 341. 5 张树波, 崔云龙, 吴顺娥.酪酸梭菌的抑菌作用研究J.中国新药杂志, 2002, 11( 4) : 322- 324. 6 唐宝英, 朱晓慧, 刘佳.酪酸菌对动物肠道致病菌体外拮抗作用的研究J.生物技术, 2005, 15(1): 37- 39. 7 郝永任. 新型动物微生态制剂复合酪酸菌制剂的研制D.济南: 山东师范大学, 2002.( 上接第426 页)霍乱攻毒保护率达80%; 8 个月新城疫攻毒保护力95%, 霍乱保护率达52.5%。二次免疫鸡群其有效免疫保护期可持续8 个月, 6 个月新城疫攻毒保护率100%, 霍乱攻毒保护87.5%; 8 个月时新城疫保护率100%, 霍乱保护率77.5%。试验证明, 二次免疫长期效果明显好于一次免疫效果。5 批二联苗保持期试验证明, 48条件下禽霍乱- 新城疫二联油乳剂苗保存期为18 个月, 1020条件下保存, 有效期为4 个月, 有效期内疫苗免疫保护率ND 为95%以上, 霍乱为80%以上。巴氏杆菌油乳剂灭活苗其免疫持续期要比新城疫病毒油乳剂灭活苗短3, 在本研究中只能以霍乱有效保护期为二联苗保护持续期, 而且由于免疫量的相对增大, 提高了二联苗的新城疫免疫效果。参加文献: 1 邵华斌, 杨峻, 刘泽文, 等.禽霍乱、新城疫二联油乳剂灭活疫苗研究I 报疫苗的制备、免疫效果及安全性试验J.湖北农业科学, 2006, 45( 5) : 647- 649. 2 中_华人民共和国农业部.中华人民共和国兽用生物制品质量标准M.北京: 中国农业科技出版社, 2001. 3 王明俊.兽用生物制品学M.北京: 中国农业出版社, 1996.464-472.表4 二联苗1020保存期测定疫苗批号2001- 12001- 22001- 32001- 42001- 5非免对照保存2、4、6 个月后免疫鸡攻毒保护力( 保护数/攻毒数)ND6/66/66/66/66/60/5FC7/87/8