UPLC法测定生长抑素原料药的含量.doc

超高效液相色谱法测定生长抑素原料药的含量摘 要： 建立快速，准确，灵敏的测定生长抑素原料药的方法。方法 采用沃特世ACQUITY UPLC超高液相色谱系统，以磷酸（取磷酸11Ml，加水900 mL，用三乙胺调PH至2.3，用水稀释至刻度1000）为流动相，（A）乙腈 （B）梯度洗脱，流速：0.3ml/min；检测波长为215nm; 柱温45；进样体积2L。结果 生长抑素在0.0051492mg/ml0.12873mg /ml范围内有良好的线性关系（R2 = 0.9993），平均回收率（n=9）为99.1%。该检测快速，准确，灵敏度高，重复性好，为生长抑素原料药的质量控制提供了一种快速准确的方法。关键词：超高效液相色谱 生长抑素原料药 生长抑素（Somatostatin）主要用于严重急性食道静脉曲张出血、急性胃或十二指肠溃疡出血、并发性急性糜烂性胃炎或出血性胃炎、胰、胆和肠瘘的辅助治疗，胰腺手术后并发症的预防和治疗，糖尿病酮症酸中毒的辅助治疗1-3。超高效液相色谱法是一个新兴的领域，Waters ACQUITY UPLC系统也出现不久，目前已发表的应用资料还很不足。与传统的HPLC相比，超高效液相色谱法的速度、灵敏度及分离度分别是HPLC的9倍、3倍及1.7倍4。目前，UPLC多应用于代谢组学分析及其他一些生化领域，在天然产物的分析方面运用也逐渐兴起，因为在这些领域深入研究需要更高的分析精度。使用超高效液相色谱法对天然产物分析，特别是药物分析研究领域的发展将是一个极大的促进5。本实验选择采用超高效液相色谱法（UPLC）进行生长抑素原料药含量的测定，为提升生长抑素原料药的质量标准提供方法依据。2 材料与方法2.1材料2.1.1仪器沃特世ACQUITY UPLC超高液相色谱系统，配置ACQUITY PDA检测器及Empower2色谱管理软件（Mitford，Boston，MA,USA），十万分之一电子天平（型号： XP 205），超纯水制备仪（型号：arium 611UV），pH计（型号：PHS-3C）2.1.2 试剂 乙腈为色谱纯（上海星可生化有限公司，批号：200912112），磷酸为分析纯（广东光华化学厂有限公司，批号：20070123），三乙胺为分析纯（东光华化学厂有限公司，批号：220081010），生长抑素原料药对照品（深圳市翰宇药业股份有限公司，批号:20090101 含量:8.3% ），生长抑素原料药样品（深圳市翰宇药业股份有限公司，批号：20090801）。2.2 方法色谱条件，美国沃特世ACQUITY 超高效液相色谱法系统，配置ACQUITY PDA检测器，色谱柱：ACQUITY BEN C18(2.1mm50mm.1.7m)流动相A：磷酸（取磷酸11mL，加水900 mL，用三乙胺调PH至2.3，用水稀释至刻度1000），流动相B:乙腈，进样体积：2L，流速：0.35mL/min，检测波长：215nm，柱温：45。 洗脱程序：见表1表1 梯度洗脱程序时间（Min）流动相A()流动相B()07.68.48.9796060792140402111.07921图1 生长抑素的UPLC色谱图3结果3.1 标准曲线3 结果3.1 标准曲线取生长抑素原料药对照品12.873mg(精密称定，含量88.3%)，置50mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。精密吸取0.2、 0.4、 1.0、 2.0、 3.0、 5.0mL 转移至10mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，分别制成浓度为0.0051492 0.0102984 0.025746 0.051492 0.077238 0.12873mg/mL的对照品溶液。用上述超高效液相色谱法色谱条件进行测定，考察线性关系。结果显示，UPLC的回归方程及相关系数分别为y = 2E+07x-36684, R2 = 0.9993，线性良好。见表2表2 标准曲线测定结果y = 2E+07x - 36684R2 = 0.99930500000100000015000002000000250000000.050.10.15系列1线性 (系列1)3.1 系统精密度试验取生长抑素原料药对照品12.815mg(精密称定，含量88.3%)，置250mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。制成浓度为0.05126 mg/mL生长抑素原料药溶液。用上述UPLC超高效液相色谱法色谱条件 ,在一天内连续测定六次.结果显示,生长抑素的峰面积的RSD为0.24，系统精密度良好，结果见表3表3 系统精密度考察结果（n=6）编号峰面积平均峰面积RSD(%)18587108571520.24285605838576704860163585509768552143.2 回收率试验取生长抑素原料药样品三组，每组三份，第一组：8mg；第二组：10mg；第三组：12mg。具体为第一组：8.56mg、8.58mg、8.61mg。第二组：10.01mg、 11.2mg、10.98mg。第三组：14.42mg、13.66mg、15.23mg。分别置入200 mL容量瓶，定容至刻度，摇匀。用上述色谱条件进行测定,得出超高效液相色谱法平均回收率为99.1%，SD为1.7%。说明准确度良好，结果见表4表4 回收率试验结果（n=9）称样量(mg) 含有量（mg） 测得量（mg） 回收率（%） 平均回收率（%） RSD(%)8.56 7.71 7.69 99.88.58 7.72 7.67 99.3 8.61 7.75 7.51 96.910.01 9.09 9.06 99.711.12 10.01 9.96 99.510.98 9.88 9.83 99.514.42 12.98 13.01 100.213.66 12.29 12.32 100.315.23 13.71 13.57 99.299.1 1.73.3 稳定性试验取生长抑素原料药样品11.365mg (精密称定，含量88.3%)，置250mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。制成浓度为0.05126 mg/mL生长抑素原料药溶液。用上述超高效液相色谱法色谱条件,在0h、4h、8h 、12h 、24h 、48h进行测定，以生长抑素的峰面积进行考察，进样6次，测得RSD为0.5。表明，至少在48小时内稳定。结果如表5 表5 稳定性实验结果（n=6）编号 时间（h） 峰面积 平均峰面积 RSD（%）1 0 857403 2 4 8497163 8 852136 855584 0.54 12 8553715 24 8589136 48 8599673.4 重复性试验取生长抑素原料药样品6份(分别为12.123g, 12.562g, 12.697g, 11.985g, 12.437g, 12.218g)置于250mL容量瓶中，稀释至刻度，摇匀。分别配成浓度为0.048492mg/mL，0.050248 mg/mL，0.050716 mg/mL，0.04794 mg/mL，0.049748 mg/mL，0.048872 mg/mL的生长抑素原料药溶液，在上述超高效液相色谱法的色谱条件下进行测定。结果显示，生长抑素的平均含量为89.8%，RSD为0.7%，重现性良好。结果如表6表6 重复性实验结果（n=6）编号 含量（%） 平均含量（%） RSD（%）1 89.312 88.923 90.13 89.8 0.74 89.825 90.516 90.323.5 样品测定3.5.1 取三批生长抑素原料药，分别为11.983g,12.685g,13.217g.溶于250mL的容量瓶中，稀释至刻度，摇匀，制备成生长抑素原料药的溶液。用上述的超高效液相色谱法的方法，每个批次进样两针，根据色谱图的积分结果，得出生长抑素的含量，结果见表7表7 UPLC法测定生长抑素原料药的含量样品批号 峰面积 含量（%） 平均含量（%） RSD（%）20090801 851469 89.21849159 89.1320090902 948697 90.52 90.14 0.8956872 90.6620091101 986544 91.11 981309 90.213.5.2 取与上述相同批号的三批生长抑素原料药，按照中国药典2010版第二部中的方法,用HPLC进行测定。条件如下：色谱条件，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂：以磷酸溶液（取磷酸11mL，加水900mL，用三乙胺调PH至2.3，用水稀释至刻度1000）-乙腈（色谱纯）为流动相，HPLC：Waters 2695 配置Waters 2489 UV/visible Detector，色谱柱：Welch Materials XB-C18 5um, 4.6*250mm (100A) 流动相A：磷酸（取磷酸11mL，加水900mL，用三乙胺调PH至2.3，用水稀释至刻度1000摇匀）,流动相B:乙腈，进样体积：10L，流速：1.0mL/min，检测波长：215nm，柱温：45 。洗脱条件（见表8）表8时间（Min）流动相A()流动相B()01820217960607921404021267921 图2 生长抑素的HPLC色谱图测定结果（见表9、图2）表9 HPLC法测定生长抑素原料药的含量样品批号 峰面积 含量（%） 平均含量（%） RSD（%）20090801 3143407 90.643179832 90.7120090902 3201739 90.93 90.5 0.43098451 89.9220091101 3157923 90.623102573 90.32上述为UPLC和HPLC分别对三批生长抑素原料药的含量的测定结果，其中HPLC测定生长抑素原料药的含量的方法已经过验证6。用HPLC测定的生长抑素原料药的含量为90.5%，RSD为0.4%。用UPLC测得的含量为90.14%，RSD为0.8%，与HPLC测得的含量很接近，且RSD为0.8%，重复性较好。4讨论本文建立ACQUITY UPLC-PDA系统检测生长抑素原料药的方法，该方法的出峰时间仅为4分钟，与HPLC的10分钟的出峰时间相比7，时间减少了60%，能够快速的检测生长抑素原料药的含量。本文所使用的UPLC方法中洗脱条件是从HPLC方法直接转换过来，并尝试过不同的流速，发现0.3ml/min的流速能达到要求,分离度、柱压等均能符合实验要求，所以选用此流速作为本实验的流速。本文使用UPLC对生长抑素原料药通过标准曲线的制作，系统精密度、回收率试验、稳定性试验、重复性试验、以及不同批号的样品的测定。在系统精密度实验中得出生长抑素的峰面积的RSD为0.24，表明系统精密度良好；在回收率试验中得出平均回收率为 99.1%，RSD为1.7%，表明系统的准确度良好；在稳定性试验中，通过对生长抑素原料药样品在0h4h8h 12h 24h 48h的测定，以生长抑素的峰面积进行考察，进样6次，得出RSD为0.5，表明，至少在48小时内稳定；在重复性试验中，用生长抑素的含量测定考察，得出生长抑素的平均含量为89.8%，RSD为0.7%，表明重现性良好；在不同批号的样品的测定实验中，分别用HPLC和UPLC对三批生长抑素原料药进行测定，用UPLC测得的含量为90.14%，RSD为0.8%，与HPLC测得的含量很接近，且RSD为0.8%，重复性较好。与传统的HPLC方法相比，在速度，准确率，灵敏度方面具有明显的提高8。另外，由于UPLC在出峰时间方面的缩短不仅节约了时间，提高了检测的效率，还在很大的程度上节省了流动相的消耗，为使用单位在经济方面节约了不少。综上所述,基于UPLC方法快速，准确，灵敏以及低消耗的特点，它必将作为一个更好的方法而在含量检测方面成为大众的选择。参考文献1 中国药典2010.第二部，生长抑素,p166-167.2 陈建忠，孙庆龙. UPLC法测定乌药中去甲异波尔定的含量J. 液相色谱质谱通讯，2009,53：10-13.3 超高效液相色谱（UPLC）在中药成分分析中的应用及评价J. 液相色谱质谱通讯，2009,53：5-6.4 Want EJ, Wilson ID, Gika H et al. Global metabolic profiling procedures for urine using UPLC-MSJ, Nature protocols, 2010, 5(6):1005-1018.5 Sterz K, Scherer G, Ecker J. A simple and robust UPLC-SRM/MS method to quantify urinary eicosanoidsJ, Journal of lipid research, 2012(Epub ahead of print).6 Wang C, Wang YG, Liang QD, Rang WQ, Gao Y. Analysis of chemical composition in the combination of monkshood and pinellia byUPLC/Q-TOFMS with multivariate statistical analysisJ, Yao Xue Xue Bao, 2010, 45(10):1301-1306.7 Zhang CY, Dong L, Chen SL, Xie CX, Chang DL. UPLCfingerprint for qua