细胞中eIF-5A定位的方法研究.doc

细胞中eIF-5A定位的方法研究项目完成单位：国家生物医学分析中心项目完成人：周涛 靳宝锋 杨怡 李慧艳 张飒 张德添 张学敏一、立题依据细胞凋亡的机制是目前研究的热点问题之一，我们应用蛋白质组学技术初步进行了细胞凋亡相关机制的研究。以对阻断泛素-蛋白酶体通路(简称UPS通路)极为敏感的白血病细胞系M-07e为模型，用泛素-蛋白酶体通路特异阻断剂Z-TL-CHO诱导细胞凋亡，发现细胞凋亡前后双向电泳上T蛋白点的表达量显著增加，经生物质谱鉴定T蛋白点就是eIF-5A。这说明M-07e细胞凋亡过程中，eIF-5A被诱导表达，可能参与了细胞凋亡的信号转导过程。那么，被诱导表达的过量的eIF-5A定位在细胞的什么位置？在细胞凋亡的过程中定位有无变化？如有，是如何变化的？总量上又是如何变化的?这都是需要解决的问题。eIF-5A的亚细胞定位虽有报道，但结果不一致，相互冲突。如：Ruhl M等认为eIF-5A定位于细胞核， Rosorius O等人则进一步精确定位至细胞核的核孔复合物上，shi XP等认为eIF-5A主要定位于细胞质中，而Jao 和 Chen等则认为eIF-5A为全细胞分布。因为蛋白质的定位信息将为其功能的研究提供重要线索，因此我们同时采用了间接免疫荧光、荧光蛋白标记等方法进行eIF-5A亚细胞定位的研究。解决蛋白定位的问题，比较常用的是间接免疫荧光标记和免疫胶体金技术，近年来发展了利用绿色荧光蛋白(GFP)来示踪胞内蛋白的技术。间接免疫荧光标记技术因为是在光镜水平进行研究，因此无法进行精确的亚细胞定位。而免疫胶体金技术则因为制样过程繁琐复杂，非特异性标记较高，且重复性差。利用GFP融合蛋白技术来进行活细胞定位研究是目前较为通行的一种方法，但仍是在光镜水平进行研究，只是不需要制样，没有非特异性标记的影响。并且GFP的分子量为27kD，eIF-5A的分子量为1618kD，若利用GFP来定位，是否对eIF-5A的定位有干扰还不清楚，因此我们必须寻找更好的定位分析方法。最近，美国圣迭哥大学Griffin, BA等合成了一种有机砷的化合物FlAsH，与特定的能形成-螺旋的含4个半胱氨酸残基的肽段结合后，可发射荧光。这种肽段一般只需要十几个氨基酸残基，但其核心区域必须是-Cys-Cys-Xaa-Xaa-Cys-Cys-。此外其衍生物中可发红色荧光的ReAsH相对于FlAsH来说，还有另外一个特点，即在有氧情况下，可对二氨基联苯(DAB)发生光转化反应，经激光扫描共聚集显微镜高强度激光照射后，可产生一种电镜下可观察的褐色产物，从而将激光扫描共聚焦显微镜与电镜有机地结合起来，对蛋白质进行精确定位。利用FlAsH和ReAsH可发射不同颜色荧光，又都是与同样的肽段相结合的特点，可以在不同的时相对细胞内该蛋白进行脉冲追踪，实现对蛋白生命周期的观察。激光扫描共聚焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscope, LSCM, 以下简称共聚焦显微镜）因其独特的设计原理，有效地排除了非焦平面信息，提高了分辨率及对比度，使图像更为精确清晰，因此极其适于进行活细胞内蛋白质、核酸等定位及活体动态研究。二、主要研究内容1真核表达载体的构建引物设计利用引物设计软件，根据FlAsH试剂所需的结构，选定肽段Ala-Glu-Ala-Ala-Ala-Arg-Glu-Ala-Cys-Cys-Arg-Glu-Cys-Cys-Ala-Arg-Ala，根据此肽段并按照所需构建的载体酶切位点的要求，设计如下引物： 1TCGAGGCTGAGGCTGCCGCCCGCGAGGCTTGCTGCCGCGAGTGCTGTGCCAGG2CCGACTCCGACGGCGGGCGCTCCGCACGACGGCGCTCACGACACGGTCCGCCTAATGATCGGATTACTAGATC这1对序列通过计算机模拟检索，引物自身无发卡结构，且引物之间不形成二聚体。其中上游 TCGAG 为XhoI 酶切位点，下游 T 为XbaI C AGATC酶切位点。载体构建将以上合成引物退火后装入pcDNA3.0载体的相应酶切位点，并将pEGFP-N1/eIF-5A用BamHI 和 HindIII 进行双酶切，把BamHI-eIF-5A- HindIII 片段连入已构建好pcDNA3.0/FlAsH，得到表达eIF-5A- FlAsH肽段融合蛋白质的真核表达载体。2免疫荧光检测将均匀种植在玻片上的COS-7和HEK293细胞，用PBS洗3遍。4%多聚甲醛固定4 30 min，PBS洗3遍。0.2%Triton X-100-PBS 5min。10%的小牛血清封闭（PBS稀释），37 30 min。PBS洗后，加入eIF-5A抗体 （1: 500），4过夜。PBS洗3遍。加羊抗兔IgG-FITC （1: 50），室温 30 min，PBS洗后用激光共聚焦显微镜下进行观察。3转染真核细胞因为以上eIF-5A- FlAsH载体表达后的融合蛋白质尚缺少合适的检测方法，因此先用pEGFP-N1/eIF-5A进行转染条件的探索。当cos7或293T细胞生长到对数生长期时，接种到共聚焦显微镜专用的玻璃底培养皿（35mm petri dish，10 mm Microwell）中，培养过夜。当细胞贴壁率达到30%50%时，将表达载体质粒2ug和脂质体(Lipofectamine2000) 2ml分别溶于100 ml无抗生素、无血清的DMEM培养基中，充分混匀后，室温放置15 min，再将两种溶液充分混匀，室温放置30 min。同时用无血清、无抗生素的DMEM洗涤待转染的培养细胞23次，向DNA-脂质体混合物中加入800 ml无抗生素、无血清的DMEM培养基，混合后加入到培养细胞中。培养皿放入37孵箱孵育68 hr后吸去双无培养液，加入23 ml含抗生素和10% FCS的DMEM完全培养基，继续培养2472 hr。4激光扫描共聚焦显微镜观察将上述细胞分别在24、36、48、72小时用共焦显微镜观察，采用Bio-Rad 公司 Radiance 2100 激光扫描共聚焦显微镜，激发波长为Ar ion激光器 488nm，发射滤片选用 HQ515/30 带通滤片。采集软件是LaserSharp 2000，采集时均选取一系列光学切片中荧光强度最大的一幅图像，采集条件如下：Laser 488nm，Power 16.3%，Iris2.2，Gain 20.2, black 1.6。5电镜原位制样及观察原位包埋法：如原位特定细胞培养在35mm塑料培养皿或6孔板中，将细胞在培养皿内进行固定、脱水、浸透、包埋和聚合。细胞面朝上与液体直接接触。在光镜下先选好被观察的细胞区域然后再包埋。由于样品很薄，块面修成0.10.2 mm 长方形。切片前应尽量修去多余的树脂，以便切片和观察。聚合后的样品块必须先定位再修块。 三、结果与讨论1. 成功构建FlAsH标签质粒，并将eIF-5A片段装入标签上游，酶切结果显示与预期的长度一致（图略）。2. 利用免疫荧光标记技术检测eIF-5A蛋白质的亚细胞定位，检测结果如图1所示。在激光共聚焦显微镜下，COS-7和HEK293细胞轮廓清晰可见，细胞质中的荧光染色明显，细胞核内无明显的荧光染色，表明eIF-5A定位于胞浆中。AB图1 免疫荧光检测eIF-5A亚细胞定位A：COS-7细胞；B：HEK293细胞以上结果表明该方法可用于检测特定时间点蛋白质的定位情况。转染时间 (hr)24 36 48 72GFPGFP-eIF5A图2 hypusine对eIF-5A的亚细胞定位的影响只定位在细胞质中的细胞(%)转染时间图3 GFP-eIF-5A亚细胞定位的动态变化趋势3. 本实验中使用表达载体pEGFP /eIF-5A及pEGFP-N1空载体转染COS-7细胞和HEK293细胞。转染后24 hr、36 hr、48 hr和72 hr，用激光共聚焦显微镜下观察荧光分布。结果表明在转染24 hr时，GFP-eIF-5A分布在整个细胞的胞浆和胞核中。随着时间的推移，胞核内的发绿色荧光的细胞逐渐减少，到转染72 hr及以后，在85%以上的细胞中GFP-eIF-5A都只分布胞质内（图2）。而GFP对照组在转染后的各个