海洋微生物对对Hela肿瘤细胞的抑制效果研究硕士论.doc

2006级生物工程专业毕业论文目录1引言61.1 海洋微生物的特殊环境及海洋真菌的生态类型71.1.1 木生真菌71.1.2 寄生藻体真菌81.1.3 红树林真菌81.1.4 海草真菌81.1.5 寄生动物体真菌81.2 海洋真菌的产生的生物活性物质91.2.1来源于海洋真菌的抗肿瘤活性物质91.2.2来源于海洋真菌的抗菌活性物质91.2.3来源于海洋真菌的其他活性物质101.3本论文的研究思路、方法及技术路线101.3.1本论文的研究思路101.3.2本论文涉及的研究方法111.3.3本论文所采用的技术路线112 材料与步骤112.1 菌种122.2 培养基122.2.1 培养基和缓冲液的配制122.2.2 人工海水的配制122.3 实验试剂与仪器132.3.1 试剂132.3.2 仪器132.4 实验方法142.4.1抗肿瘤活性菌株的筛选142.5细胞毒性试验（MTT法）152.5.1 MTT法溶液的配制152.5.2 肿瘤细胞的培养152.5.3 供MTT活性检测用样品的制取162.5.4 MTT法实验步骤162.3 活性代谢产物的初步分离162.3.2 薄层层析分离及展开剂条件的摸索172.3.3 利用自制薄层硅胶板制备活性活性产物182.3.4 Sephadex LH-20分离代谢产物183 结果与分析203.1MTT检测结果203.1.1乙酸乙酯粗提物的MTT结果20表3-1 F-1-1粗提物对细胞B-16抑制率203.1.2 HPLC分离组分的MTT结果20表3-2 F-1-1 HPLC分离组分对细胞B-16抑制率203.2 F-1-1代谢产物样品的全波长扫描203.3 柱分离结果193.4 HPLC 条件优化18203.4.1 HPLC 流动相溶剂配比最佳条件摸索203.4.1.1 对总样品条件的摸索：204 讨论245结论25摘要本论文利用薄层层析Sephadex LH-20、HPLC以及制备薄层层析等方法对活性菌株海洋真菌F-1-1液态发酵产生的代谢产物进行了部分分离，代谢产物对粗提物和柱分离组分对B-16肿瘤细胞做MTT实验，得到粗提物对B-16细胞的抑制率为72.31%，柱分离组分抑制则为-63.48% 、-25.05% 、-10.00%、3.01%。对，获得了该菌株产生的代谢产物分离的薄层条件为：石油醚乙酸乙醋甲醇=51.50.6。对代谢产物用 Sephadex LH-20进行分离，条件：在50%甲醇下洗脱30分钟，再用75%甲醇洗脱20分钟。并进行 HPLC 分离条件优化。HPLC 分离的最佳条件为：流动相流速为 1.0 ml/min,检测波长为210 nm，流动相最佳配比 30-40% 乙腈梯度洗脱，柱温为常温（29）。关键词：海洋真菌；抗肿瘤；MTT法；F-1-1；HPLC Abstract In this thesis, Sephadex LH-20, HPLC and thin-layer chromatographic method of preparation of the marine fungus F-1-1 liquid fermentation metabolites were part of the separation of metabolites of crude extracts and column fractions B -16 MTT test tumor cells do get crude extracts inhibit the B-16 cells was 72.31%, column fractions, compared with -63.48% inhibition, -25.05%, -10.00%, 3.01%. Right, metabolites using Sephadex LH-20 separation, conditions: 50% methanol elution under 30 minutes, then 75% methanol elution for 20 minutes. And HPLC separation conditions were optimized. The best HPLC separation conditions: mobile phase flow rate was 1.0 ml / min, detection wavelength was 210 nm, mobile phase, the best ratio of 30-40% acetonitrile gradient elution, the column temperature was at room temperature (29 )In this thesis, thin layer chromatography, Sephadex LH-20, HPLC and TLC were used to prepare active strains F-1-1 production of the metabolites were part of the separation was the separation of the metabolites were produced, thinlayer conditions: petroleum ether: ethyl acetate: methanol = 5:1.5:0.6.Of the metabolites using Sephadex LH-20 separation, and HPLC separation conditions were optimized.The best HPLC separation conditions: mobile phase flow rate was 1.0 ml / min, detection wavelength was 210 nm, mobile phase, the best ratio of 30-40% acetonitrile gradient elution, the column temperature was at room temperature (29 ).Key words: Marine fungi; Anti-tumor activity; MTT assay; F-1-1; HPLC1引言引言 癌症又称为恶性肿瘤，是一种严重威胁人类生命健康的常见病、多发病，人类因恶性肿瘤而引起的死亡率是所有疾病死亡率的第二位，全世界每年死于癌症的约有430万人，我国每年死于癌症的约有100万人，而且这种状况还在加剧，因此对其防治的研究一直为各国所重视。化疗一直是癌症临床治疗重要的乃至最主要的治疗手段。自从20世纪40年代应用第一个抗肿瘤药物一一氮芥成功地治疗恶性淋巴瘤以来，抗肿瘤药物的研究已取得了很大的发展11。随着细胞分子生物学的长足发展，可将癌症定义为细胞周期异常性疾病。癌症从细胞水平上可以看作是调控细胞周期或细胞凋亡的某一个或某几个环节发生紊乱，使癌化细胞无限制地盲目无序增殖的一种状态。选择性细胞周期抑制剂和细胞凋亡诱导剂能通过调控细胞周期或细胞凋亡的生物过程，控制和矫正癌化细胞盲目无序增殖的状态2。因此，新的细胞周期抑制剂和细胞凋亡诱导剂有可能开发成新的化疗药物用于治疗癌症，而检测细胞周期抑制和细胞凋亡诱导作用的生物活性指标则可用于筛选和发现新的抗癌活性物质。 海洋环境的特殊性和多样性使海洋生物具有独特的代谢途径和遗传背景，并产生特殊结构和功能的活性物质。早在1578 年明代医学家李时珍着的本草纲目就已收录了90 多种海洋药物。海洋药物一直是海洋生物资源开发的热点，1967 年世界第一届海洋药物研讨会标志着大规模研究海洋药物的开始。到目前为止，已从海洋生物中获得抗肿瘤、抗病毒、抗心脑血管疾病的新药，其中海洋生物抗肿瘤活性物质研究进展很快，是海洋药物开发的重要方向。近年来随着物质分离纯化和结构分析技术的发展，人们已有从海洋生物中发现了数百种新的具有细胞毒性或抗肿瘤活性的天然产物，其中十几种抗癌效率高、毒性低的海洋天然药物或其结构改造化合物进入临床试验阶段，阿糖胞苷已开发成抗癌新药。但更多的天然产物仍处于基础研究阶段。我国的研究水平还较低，一些关键性的技术问题如深海采样技术，从复杂生物系统分离纯化微量生物活性物质的技术，高通量活性筛选技术等尚待突破性进展。另外，体外筛选模型的局限性导致细胞毒性鉴定不能全面地反映化合物的抗肿瘤活性，而体内活性筛选不仅耗时，而且成本较高，在活性追踪分离过程中经常难以应用，最终造成我国新药的开发精力和财力不足。因此，加快我国对该领域的基础研究和产品开发，对有效利用海洋生物资源具有重要的意义。1.1 海洋微生物的特殊环境及海洋真菌的生态类型海洋微生物生活在特殊环境之中，例如高盐度、高压、低营养、低温(特别是深海)或局部高温和无光照以及不同的生物之间的关系等等。在这些所谓生命的极限环境中，海洋微生物己发展出独特的代谢方式，这不仅确保其在极端环境中生存，也提供了在陆地微生物中未遇到过的代谢产物的生产潜力，因而是多种多样新颖化合物的极好资源。海洋微生物蕴含丰富的结构奇特和新颖的化合物，其中不少可能有实际应用价值。特别是已经发现，以前从其它海洋生物分离得到的一些珍奇的有强烈药理活性的化合物其真正的生产者是海洋微生物。海洋微生物已被认为是寻找药理活性物质的新源泉3。因为微生物比较容易采集和培养，而且所产生的代谢产物比高等生物所含的物质更易提纯，所以有用的代谢产物易于进入工业化生产。科技界相信：海洋微生物将成为21世纪开发新型医药品的资源。而在海洋微生物资源中，海洋真菌的分布非常广泛，从朝间带高潮线或河口到深海，从浅海沙滩到深海沉积物中，均有其成员。海洋酵母菌和低等真菌附生于浮游生物和动物体上，因而在大洋中也有分布；高等海洋真菌的生长要求适宜的基物作为栖息场所，因此多集中分布在沿岸海域。由于海洋真菌营腐生或寄生生活，所以其地理分布的特点是取决于寄主的地理分布范围。但海水中溶解氧的浓度和海水水温，也是影响海洋真菌存在与发展的重要因子。几乎所有的真菌都可在小于海水中氯化钠浓度的条件下生长，因此耐盐性不能作为区分海洋真菌和陆地真菌的标志。在生态方面，大多数栖于某种基物而生活，少数自由生活。依其栖生的习性，海洋真菌可分成5种基本的生态类型：1.1.1 木生真菌 海洋木生真菌是一类数量最多、分布最广的高等海洋真菌。它能强烈的分解木材和其他纤维物质。能腐烂港口设施、防波堤及堰堤中的木质结构和其他纤维材料。他们在热带海域的分布较温带和极地广泛，在浅海环境的分布较深海广泛。1.1.2 寄生藻体真菌在海洋真菌中，约有1/3的种与藻类有联系，其中以子囊菌类居多。有腐生、寄生和共生等类型。不同海藻的分布可直接影响该类真菌的分布，如在北大西洋的马尾藻海中，真菌的种类和数量都很少，也极少发现被真菌侵染的海藻，这是由于马尾藻具有抗菌作用的单宁酸物质。一般说，腐烂海藻上酵母菌的数量要高于活藻体上和海水中的数量：附在红藻和绿藻上的酵母菌数量要高于褐藻上的。因为褐藻分泌的酚类物质能抑制海洋真菌的生长。一些海洋真菌与特定海藻结合形成专性共生的结合体，即为海洋地衣。1.1.3 红树林真菌红树是热带亚热带朝间带盐泽地的植物，红树林地区是典型的稍咸的水域带，水的温度和盐度变坏较大。外海水域营养缺乏，但是近岸水域尤其是红树林地区有充足的植物材料供真菌生长繁殖。真菌必须依靠降解有机物，浮游藻类和浮游生物作为它的营养。它需要特定的温度和盐度。红树林能够提供这些条件，因此是海洋真菌的丰富来源，栖生红树林的海洋真菌多半是腐生菌。1.1.4 海草真菌海草真菌数量较少，其中栖居叶部的真菌较栖根者为多。海洋根中含有单宁酸和其他抑制生物生长的物质，只有那些能抵抗这类物质的海洋真菌才能在海草根上适应生长。据报道，有些也能引起海草的病害，如北大西洋、太平洋和欧洲的海草曾被网黏菌属真菌严重侵染。1.1.5 寄生动物体真菌在海洋生态系统中，微生物与其他生物之间也存在着抗生、互生、共生和寄生的各种复杂局面。海洋真菌是某些海洋动物的寄生菌。一般说来，海洋真菌只局限于寄生在外骨骼、壳等处。海洋真菌在分解动物体中的纤维素、甲壳素、蛋白质和碳酸钙等过程中起重要作用。低等海洋真菌是引起海洋鱼类和无脊椎动物危害的重要致病菌。如美国牡蛎生长区曾因真菌的侵害遭受严重损失。如镰刀菌能引起对虾的黑鳃病，链壶菌常侵入甲壳类动物的幼体进行寄生。海洋真菌和海洋细菌一样，参与海洋有机物质的分解和无机营养的再生过程，为海洋植物不断提供有效营养，在海洋食物链中占有重要位置。海洋真菌在生态和应用方面有着重要的意义，如降解海洋环境中的污染物，促进海洋自净等；利用海洋真菌加工麦麸、甘蔗渣、稻草等，制成廉价的微生物碎屑混合物，用于水产养殖中的饲料4, 5。1.2 海洋真菌的产生的生物活性物质生物活性物质主要被关注在抗生素和抗肿瘤方面，但其他可选择的活性物质包括细胞周期抑制剂、抗血小板活性因子、抗病毒、抗原生动物、磷酸酶抑制剂、激酶抑制剂等也引起了人们的极大兴趣。1.2.1来源于海洋真菌的抗肿瘤活性物质近年来随着对海洋微生物研究的深入，从真菌中发现了越来越多的抗肿瘤活性物质，且大多具有新型的结构，海洋真菌成为继海洋放线菌之后的又一研究热点。Takahashi等6从海水中获得的真菌（Penicillum）。经甲醇分离、提纯，得到两种次级代谢产物，在培养的P388淋巴细胞白血病细胞上具有细胞毒素活性。1995年又从海藻（Sargassumtortile）分离出一株真菌（Leptosphaeria），经人工培养后用甲醇浸取，经过多次色谱柱分离得到6种新结构的细胞毒性物质（Leptosins），具有较强的抗肿瘤功能，它们是多硫二氧代呱嗪类化合物，这类物质在自然界中极少被发现。最近，Fenica等7从Exserohilum rostratum的培养液中分离得到4种新型化合物Rostratins A-D，它们对HCT-116细胞的IC50的质量浓度分别为8.5、1.9、0.76和16.5 mg/ml。1.2.2来源于海洋真菌的抗菌活性物质50年前，科学家从海洋生物中发现并研制成功了新的抗生素头孢菌素（Cephalosporins)（来源于海洋真菌），开创了开发海洋抗生素的先河8。Cueto M等从巴哈马褐藻中分离到一株真菌（Pestalotia），当它处于周围有抗性细菌存在的培养条件下，它能产生一种抗性物质。这种抑菌物质对MRSA 菌最小抑菌浓度37 ng/ml，对VREF菌最小抑菌浓度78 g/ml。微生物之间的相互拮抗作用，对于从真菌中发现新颖的抗生素也许是非常有用的。Keissleriella YS41089 是从中国黄海沉积物中分离到的一株真菌，发酵液分离提纯得到几种抗真菌次级代谢产物，其中一种聚酮类物质，拥有全新的碳骨架，具有对C.albi-cans， Tricophyton rubrum 和Aspergillus niger 三种菌的最小抑菌浓度分别为40，20 和80 g/ml。Proksch 10研究组从海绵（Niphates olemda）组织中分离出真菌（Curvularia lunata），液体培养液中分离出一系列化合物，其中分离得到lunatin和cytoskyrin两个蒽醌类衍生物。Lunatin在琼脂平板试验中对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和枯草杆菌都有抑菌活性，5 g / ml 时对三种菌的抑菌圈直径达到89 mm。1.2.3来源于海洋真菌的其他活性物质厌养电子传递抑制剂（nafuredin），是从西太平洋帕劳群岛海绵中分离到的一株曲霉（Aspergillus niger）所产生的一种次级代谢产物。Nafuredin 在抑制来自猪蛔虫（Ascarissuum）的NADH 延胡索酸还原酶（NFRD）活性方面，显示了高度的选择性11。两种环缩二氨酸细胞周期抑制剂，Tryprostatins A和B是海洋沉积物分离菌（Asperg I l-lus fumigatus）产生的次级代谢产物。Tryprostatin A（50 g / ml）和 Tryprostatin B（12.5 g / ml）处理tsFT210 细胞，完全能使它停留在G2/ M期。Sugano等12报道，他们研究小组从日本Fukui prefecture海岸蟹（Chionoecetes opilio）的蟹壳中分离到一株海洋担子菌，它能产生Phomactin A ，B ，B1 ，B2，C ，D，E-G一类的化合物，此类物质是血小板活化因子拮抗剂。Phomactins均能抑制PAF诱导的血小板凝聚和PAF粘合受体，但是对二磷酸腺苷,花生四烯酸,和胶原诱导的血小板凝聚没有影响。这说明Phomactins是一种新型的PAF拮抗剂，以一种没有先例的方式进行作用。1.3本论文的研究思路、方法及技术路线 1.3.1本论文的研究思路 1、F-1-1 菌种的活化，置斜面，接种，固体扩大培养约一个星期至斜面均匀长出菌种 2、挑选长的较好固体培养的菌种，接入液体培养基，摇床培养（28摄氏度，150转每分钟）约1510天，直至菌种大部分自溶。离心（5000转每分钟，15分钟）取上清液，弃下层物质。用乙酸乙酯萃取，2次4小时；旋转蒸发浓缩。3、用乙酸乙酯提取物对B-16肿瘤细胞做MTT实验，算得抑制率。 43、Sephadex LH-20对浓缩产物初步分离。Sephadex LH-20 干粉的溶胀、装柱，取少量待分离样品溶于甲醇，加样前充分溶解后用 0.22 m 滤膜过滤，上样, 加入样品后，用甲醇封闭柱子上口并用手动蠕动泵调节流动相（甲醇）流速。用自动手动收集器收集分离后的组分。 54、HPLC分离条件的摸索，包括选择最佳检测波长、流动相的选择、检测波长对比。从中找出最佳吸收波长和最佳分离的条件。 5、半制备HPLC对活性成分制备。1.3.2本论文涉及的研究方法1微生物学的相关研究方法和技术。具体包括菌种的分离纯化，菌种发酵等。 2天然产物化学的研究方法。具体包括薄层层析、柱层析、HPLC等分离纯化手段。3肿瘤细胞生物学的研究方法。本文主要采用MTT细胞活性测试方法。1.3.3本论文所采用的技术路线2 材料与步骤2.1 菌种菌种由实验菌种由本系菌种保藏室提供。2.2 培养基2.2.1 培养基和缓冲液的配制13, 14（1）查氏培养基：查氏培养基：NaNO3 2 g，K2HPO4 1 g，蔗糖 30 g，KCl 0.5 g，MgSO4 0.5 g，FeSO4 0.01 g，蒸馏水 1000 ml，pH自然。培养海洋微生物用人工海水代替蒸馏水，由于海水中还有等量的KCl，MgSO4，FeSO4，所以培养基中可省略。（2）斜面培养基：查氏培养基加入 1520 g/l的琼脂。（3）海洋真菌液态培养基NaNO3 2 g，K2PO4 1 g，蔗糖 30 g，KCl 0.5 g，MgSO4 0.5 g，FeSO4 0.01 g，人工海水 1000 ml，pH自然。（4）PDA培养基：马铃薯 200 g，蔗糖 20 g，琼脂 20 g，水 1000 ml，pH 自然。马铃薯去皮，切块煮沸30 min，然后用纱布过滤，再加糖及琼脂，溶化后补足水至1000 ml。2.2.2 人工海水的配制称取 NaCl 29.5 g， MgCl26H2O 2.0 g，KCl 0.5 g，MgSO47H20 3.5 g，CaCl22H2O 0.5 g放置 1000 ml烧杯中用蒸馏水溶解（可适当加热）。再转移到 1000 ml容量瓶中，加入海水微量元素5 ml和微量元素 1 ml，定容到 1000 ml。海水微量元素的配制：称取柠檬酸 0.6 g，K2HPO4 3.2 g，NaCO3 10.4 g，柠檬酸铁 1.0 g，EDTA 0.15 g，用蒸馏水溶解后用容量瓶定容到1000 ml。海水微量元素的配制：称取 H2BO4 2.86 g，Na2MnO42H2O 0.3 g，MnCl2 1.81 g，ZnSO47H2O 0.22 g，CuSO45H2O 0.079 g，Co(NO3)26H2O 0.0499 g，用蒸馏水溶解后用容量瓶定容到 1000 ml。2.3 实验试剂与仪器2.3.1 试剂蔗糖、琼脂、MgCl2、KCl 、MgSO47H2O、CaCl2、KNO3、K2HPO4、FeSO4、CuSO4、ZnSO47H2O、(NH4)2SO4、NaNO3、MnCl2 、NaCl 、DMSO以上均为分析纯(AR)。Sephadex LH-20(葡聚糖凝胶 LH-20，上海经科公司)。2.3.2 仪器仪器名称仪器型号生产厂家循环水氏真空泵SHZ-D()巩义市予华仪器有限责任公司恒温磁力搅拌器85-2常州国华电器有限公司超声波清洗机CQ25-2A上海杰里科技有限公司通风柜M266331上海东方教具有限公司旋转蒸发器RE-52D上海青浦沪西仪器厂数显不锈钢电热培养箱XPX-9082MBE上海博讯实业有限公司医疗设备厂全温度恒温摇床ZHWY-2112B上海博讯实业有限公司医疗设备厂垂直超净工作台ZHTH-112C上海智诚分析仪器制造有限公司立式压力蒸汽灭菌器YSQ-LS5DS上海博讯实业有限公司医疗设备厂静音无油空气压缩机700A-5717(SH001)傅山市广顺电器有限公司液相色谱紫外监测仪UV730D美国WATERS色谱柱C18Waters液相色谱自动进样器2707美国WATERS台式离心机XTL-5.0上海安亭科学仪器制造厂分析天平ALC上海生化仪器厂手提紫外灯UV-2北京智源通生物技术研究所酶标免疫检测仪MK3赛默飞世尔（上海）仪器有限公司2.4 实验方法2.4.1抗肿瘤活性菌株的筛选（1）菌种活化从菌种保藏室中取出若干株菌种，放置于28 培养箱中48小时，然后转接于斜面培养基上，培养 45 天。（2）三角瓶摇床培养配制海洋真菌培养基，分装到三角瓶中，每瓶盛装 100 mL，用纱布包扎好后在 121 条件下湿热灭菌 30 分钟，取出待培养基冷却后，每瓶培养基中接入种子液 1 ml，浓度约为 107 个/ml，在28，150 rpm 条件下摇床培养 15 天。（3）代谢产物的提取取出发酵液，用 250 ml 的离心杯盛装，在 5000 rpm 离心机中离心 10 min后，取出上清液，下层菌体丢弃。将上清液放进梨型瓶中，按照上清液与乙酸乙酯体积为 1/0.5，将乙酸乙酯等体积萃取两次，每次 4 小时，充分萃取，发酵液在下层从下口流出，而乙酸乙酯在上层从上瓶口倒出。萃取后的乙酸乙酯层放入旋转蒸发瓶中，在 4048 水浴中抽真空旋转蒸发浓缩，浓缩至旋转瓶中剩 510 ml溶液时，用移液管将其取出放进 10 ml离心管中，打开瓶口放进通风橱自然晾干。（4）MTT法检测细胞毒性称取自然晾干的代谢产物 5 mg，加入 20 l DMSO，使之充分溶解，用DMEM细胞培养液定容到 5 ml，使其浓度为 1 mg/ml。利用MTT法，检测代谢产物的活性，找出具有抗肿瘤活性的菌株。对具有抗肿瘤活性的菌株，在相同条件下，重复 23次培养，检验其抗肿瘤活性是否稳定。2.1.3 抗肿瘤活性菌株的筛选（1）菌种来源实验菌种由本系菌种保藏室提供。（2）菌种活化从菌种保藏室取出若干株菌种，放置于28 培养箱中48小时，之后转接斜面培养基培养 45 天。（3）三角瓶摇床培养配制海洋真菌培养基，分装到三角瓶中，每瓶盛装 100 ml 在121 条件下湿热灭菌 30 分钟，待培养基冷却后，每瓶培养基中接入107 个/ml种子孢子悬液液 1 ml， 浓度约为 107 个/ml，28，150 rpm， 培养15天。（4）代谢产物的提取取出发酵液用 250 ml 的离心杯盛装，在 5000 rpm 离心 10 min后，取出上清液，下层菌体丢弃。将上清液放进梨型瓶中，按照上清液与乙酸乙酯体积比为 1比1，将乙酸乙酯等体积萃取两次，每次4小时，充分萃取，发酵液在下层从下口流出，而乙酸乙酯在上层从上瓶口倒出。萃取后的乙酸乙酯层放入旋转蒸发瓶中，在 4048 水浴中抽真空旋转蒸发浓缩，浓缩至旋转瓶中剩 510 ml溶液时，用移液管将其取出放进 10 ml 离心管中，打开瓶口放进通风橱自然晾干。（5）供MTT活性检测用样品的制取称取自然晾干的代谢产物5 mg，加入20 l DMSO，使之充分溶解，用DMEM细胞培养液定容到5 ml，使药物浓度为1 mg/ml。（6）细胞毒性检测（MTT法）利用MTT法，检测代谢产物的活性，找出具有抗肿瘤活性的菌株。2.5细胞毒性试验（MTT法15）2.5.1 MTT法溶液的配制MTT 溶液的配制：称取MTT 0.5 g，溶于100 mL的磷酸缓冲液（PBS）中，用0.22 m滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4 避光保存即可。MTT一般最好现用现配，过滤后4 避光保存两周内有效。MTT有致癌性，用的时候小心。2.5.2 肿瘤细胞的培养采用B-16和BT-474细胞，将细胞加入含有DMEM培养基（含10% 胎牛血清）的96孔板中，在 37、通入 5 % 二氧化碳的细胞培养箱中培养。2.5.3 供MTT活性检测用样品的制取从冰箱中取出菌株代谢产物，使用注射剂和滤膜将液体过滤，放入已贴有标签的离心管，以供使用。2.5.4 MTT法实验步骤（1）收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度为107108 个/ ml，稀释至12 x 105个细胞/ ml，接入 96 孔板，200l/孔。（2）5 % 二氧化碳，37 培养，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板），换新鲜培养基，每孔180 l，加入样品 1 mg/ ml，每孔20 l，设35个复孔。同时设置对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、二甲基亚砜）。（3）5 % 二氧化碳，37 培养 48 小时，倒置显微镜下观察。（4）换新鲜培养基，每孔180 l，每孔加入20 l MTT溶液（5 mg/ml）继续培养4 h。（5）终止培养，弃去培养液，小心用PBS冲23遍。（6）每孔加入150 l二甲基亚砜，酶标免疫检测仪上低速振荡5 min，使结晶物充分溶解。在酶标免疫检测仪上测定OD492吸光值。（7）抑制率=1-实验组平均OD值/对照组平均OD值2.3 活性代谢产物的初步分离17取出发酵液用 250 ml 的离心杯盛装，在 5000 rpm 离心 10 min后，取出上清液，下层菌体丢弃。将上清液放进大分液漏斗瓶中，按照上清液与乙酸乙酯体积为 1:0.5，将乙酸乙酯等体积萃取24小时，其间不定期摇晃大漏斗瓶。待充分萃取后，发酵液在下层从下口流出，而乙酸乙酯在上层从上瓶口倒出。 2.3.1 实验材料薄层层析用硅胶板：烟台江友硅胶开发有限公司 Sephadex LH-20：北京经科公司 分析用高效液相色谱仪（Breeze HPLC）：WATERS中国有限公司 所用试剂：石油醚，乙酸乙酯等均为分析纯， 乙腈、甲醇为分析纯和色谱纯。2.3.2 薄层层析分离及展开剂条件的摸索18, 19（1）将硅胶板裁成2 cm10 cm（用于单个样品）或（58）cm10cm（用两个以上样品）长方形，在一距边 1 cm处用铅笔划一条浅线，每隔 1 cm点一个样。样品距边缘至少 0.5 cm 以免产生边缘效应，从而影响展开效果；（2）取少量乙酸乙酯浓缩样品于EP管中，作为原样，4 冰箱中保存； （3）通风橱中用内径为 0.5 mm毛细管点样，蘸取样品轻点于硅胶板铅笔画点处，取合适量，分几次点于一点，点样原则：原点越小越好，每次点样原点溶剂扩散直径不超过 23 mm；（4）配制适合极性与洗脱能力的展开剂。将展开剂放置于直立型展层缸内，盖好缸盖，待展开剂在展层缸内达到饱和，此饱和过程约需要1030 min，然后将点样后的薄层板靠近划线的边放进展开剂中（点样线不能浸入展开剂），板斜靠于槽壁进行上行展开。采用不通的展开剂对F-1-1的代谢产物进行薄层层析分离；（5）展开剂上升到距离板上缘约 1 cm 处时，取出晾干；（6）在手提式紫外灯254 nm 和 365 nm 下观察样品分离情况；（7）展开剂比例依次是：石油醚乙酸乙酯甲醇=50.61：石油醚乙酸乙酯甲醇=1.550.6：石油醚乙酸乙酯甲醇=51.50.6：石油醚乙酸乙酯甲醇=1.50.65：石油醚乙酸乙酯甲醇=0.651：石油醚乙酸乙酯甲醇=0.615：石油醚乙酸乙酯甲醇=0.650.6：石油醚乙酸乙酯甲醇=50.65：石油醚乙酸乙酯甲醇=251：石油醚乙酸乙酯甲醇=21.51。2.3.3 利用自制薄层硅胶板制备活性活性产物 将代谢产物溶于甲醇中，点样于自制薄层硅胶 GF254 板，晾干后用最适展开剂于层析缸中展开。薄层斑点采用手提式紫外灯( 254 或360 nm )照射观察，根据展开情况将其分成若干个区带，并分别将各个区带的硅胶刮板收集后，用甲醇洗脱，收集洗脱液浓缩后，制成供MTT活性检测用样品，进行细胞毒性性检测。2.3.4 Sephadex LH-20分离代谢产物（1）胶的溶胀称量Sephadex LH-20 干粉50 g，用足量甲醇溶胀（Sephadex LH-20在甲醇的溶胀系数为3.84.1）过夜，从而达到胶的充分溶胀。（2）装柱先用流动相润洗玻璃柱先用流动相润洗一次性针管（柱容量为2.5ml），尽量除去柱壁的气泡尽量除去管壁的气泡，然后向管柱内注入等体积的甲醇，用洗耳球从底端吸出溶液以排除气泡。采用湿法装柱，避免胶分层，装好柱子后让柱材料充分沉淀结实，放置柱子12小时便可上样。注意：装柱前首先用铁架台固定玻璃柱并用水平仪使其竖直。（3）上样取少量待分离样品溶于甲醇，加样前充分溶解后用 0.22 m 滤膜过滤，上样75lm。（4）收集加入样品后，封闭柱子上口50、75的甲醇先后调节流速。收集下分离出的不同组分。2.3.5 HPLC分离条件的优化20（1）选择最佳检测波长采用分光光度仪对萃取的样品进行 200 nm500 nm全波长扫描，得出最佳吸收波长。（2）流动相的选择在检测波长一定的情况下，用乙腈和水作为流动相，通过调节其配比，达到最佳分离。（3）检测波长对比将几组波形能重叠的组分合并，最后可将经过层析柱分离的组分为 5 个成分（A、B、C、D、E），用于进一步抗肿瘤活性检测。3 结果与分析3.1 活性菌株的筛选结果3.1.1 初步筛选3.1MTT检测结果3.1.1乙酸乙酯粗提物的MTT结果表3-1 F-1-1粗提物对细胞B-16抑制率表3-2 1 F-1-1菌株培养代谢产物的活性检测第一次培养，代谢产物样品每孔OD值平均OD值对照0.4070.3400.3770.3320.3560.362F-1-10.1540.1370.1090.1170.1530.134抑制率71.48.%细胞：B-16抑制率乙酸乙酯重铬酸钾空白72.31%17.49%71.48%0%3.1.2 HPLC分离组分的MTT结果表3-2 F-1-1 HPLC分离组分对细胞B-16抑制率细胞：B-16 组一抑制率组二抑制率组三抑制率组四抑制率-63.48%-25.05%-10.00%3.01%表3-3 F-1-1菌株代谢产物经柱分离后的活性检测第二次培养，代谢产物样品每孔OD值平均OD值对照0.2050.2410.2460.1910.1930.215F-1-10.0710.0690.0720.0670.0740.071抑制率75.44%3.2 薄层层析条件优化采用不同的展开剂对F-1-1的代谢产物进行薄层层析分离，得到以下结果： 图3-1 各种展开剂对F-1-1代谢产物的薄层层析分离情况首先在条件 石油醚乙酸乙酯甲醇=50.61时展开，效果不理想，继续改变各个成分的浓度来改变展开剂的极性，对薄层层析分离条件的摸索。对比上述薄层层析展开结果，发现条件 石油醚乙酸乙醋甲醇比例为51.50.6时，分离效果最好。3.3 F-1-1 菌株代谢产物薄层层析制备结果在最优化的薄层层析条件下，用自制薄层硅胶 GF254 板对其代谢产物进行了分离制备，取得了较好的分离结果，如图2所示为F-1-1在365 nm波长下的可见条带。由图2可见，F-1-1代谢产物在薄层板上分为6条较清晰的区带。 3.2 F-1-1代谢产物样品的全波长扫描为了进一步确认HPLC对F-1-1的分离条件，对萃取后的样品进行全波长扫描，如图3 所示，由图可见，样品在210 nm波长处有最大吸收，作为HPLC分离的最佳吸收波长。 图3-3 F-1-1代谢产物全波长扫描图谱303.3 柱分离结果 利用Sephadex LH-20 柱进行分离，分离条件为：流动相为50%甲醇溶液冲洗30分钟后，再用75%的甲醇冲洗观察图4可以发现样品在层析柱内分为 45 段，但是，段间的界面不明显，拖尾严重由于光线等原因图片上显示不是很明显但实际效果较好。造成此种现象的原因可能是流动相的浓度不准确或者泵的流速过快造成条带不明显的原因可能是流动相的浓度不准确或流速过快。 图3-4 Sephadex LH-20 柱分离结果 3.4 HPLC 条件优化18样品F-1-1经过Sephadex LH-20 柱分离，用收集器收集 46 管，为了把相同组分合并，本试验通过HPLC进行分析合并前鉴定。开始用甲醇比水作为流动相，与用乙腈比水作为流动相的结果比较，乙腈的效果明显出色。3.4.1 HPLC 流动相溶剂配比最佳条件摸索用萃取后的F-1-1代谢产物干燥品作为最佳条件摸索的样品。采用梯度洗脱的方式对样品处理。3.4.1.1 对总样品条件的摸索：开始用0100梯度洗脱的方式对F-1-1代谢产物样品全波长扫描得到下图。由下图可知在乙腈浓度为3040之间有最大吸收峰，且出峰时间较早，在40100浓度之间几乎不出峰。图 3-5 0100% 乙腈洗脱效果3.6.1.2 再对3040乙腈浓度下洗脱F-1-1代谢产物粗提物在3040乙腈浓度下优化：图 3-6 3040% 乙腈条件总代谢物由上图，可以看出，对3040% 乙腈做流动相其检测到的峰与峰之间间隔明显加大，说明有更多的物质被检测出来。3.6.1.3 用3040% 乙腈作流动相对分离出的样品1分析，其结果如下：图3-7 3040% 乙腈条件 样1由上图，可以看出用3040% 甲醇作流动相，相较于100% 乙腈作流动相和70% 乙腈作流动相而言，其检测到的峰数明显增多，且峰值也有回升，峰与峰之间的间隔也较大，算是较好的分离条件。3.6.1.4 用3040% 乙腈作流动相对分离出的样品2 分析，其结果如下：图3-8 3040% 乙腈条件 样23.6.1.5 用3040% 乙腈作流动相对分离出的样品 3 分析，其结果如下：图3-9 3040% 乙腈条件 样33.6.1.6 用3040% 乙腈作流动相对分离出的样品 4 分析，其结果如下：图3-10 3040% 乙腈条件 样4由以上的结果可知：样品的最佳分离条件为流动相流速为 1.0 ml/min，检测波长为210nm，流动相最佳配比3040%乙腈梯度洗脱，柱温为常温。3.6.2 HPLC 最佳分析条件下的结果样品的最佳分离条件为流动相流速为 1.0 ml/min，检测波长为210nm，流动相最佳配比3040%乙腈梯度洗脱，柱温为常温。4 讨论本论文是对 F-1-1进行发酵培养，然后通过乙酸乙酯萃取等步骤提取得到其粗提物，通过 Sephadex LH-20 层析柱对粗提物的初步分离，再利用 HPLC 对代谢产物进行分离纯化并取得了良好的效果。另外，通过 MTT 法发现海洋真菌F-1-1 对细胞株 B-16生长的抑制率为72.31%。本实验采用Sephadex LH-20 柱材料对代谢产物进行分离，其分离效果较好，可获得较清晰的不同条带， HPLC对分离后各组分分离条件的优化，在优化条件过程中走了不少弯路和本人操作实验设计有着必然的关系。比如在粗提物的处理上我们就采用的液液萃取法（LLE）分析目的物在两种不相溶的溶剂中进行分配。利用目的物与干扰物在两种不相溶的溶剂中溶解度差异而达到分离目的。根据目的物与干扰物性质，选择溶剂对。传统方法多采用（如国标法）。逐渐被取代（费时、费试剂、回收率易偏低）如果采用凝胶渗透法（GPC）.原理：基于物质分子大小和形状不同来实现分离的。主要依据相对分子量的差别，通过GPC将农药与农药、农药与共提取物分开。从而使之得到分离和净化。（大多数农药分子量小于500）优点：净化容量大，适用于有机磷、有机氯农药的提取，去除脂肪和色素。大多数农药回收率较高。容易实现自动化。缺点：凝胶柱成本较高，溶剂用量大。欧洲应用的较多。这样可能会提高分离度，获得更好的单一组分。45结论本论文对从实验室获得的F-1-1海洋微生物培养，对其代谢产物进行乙酸乙酯萃取后干燥后制成样品，通过MTT活性法，检测对Hela肿瘤细胞的抑制效果。MTT活性检测，其代谢产物具有较稳定的抗Hela肿瘤细胞活性，并且抑制率能够达到70% 以上，具有很强的抗肿瘤活性。好的抗肿瘤活性。在对代谢产物中的活性成分分离过程中，使用了薄层层析，Sephadex LH-20 柱层析，HPLC等方法对代谢产物进行了一系列的纯化。采用不同的展开剂对F-1-1的代谢产物进行薄层层析分离，摸索薄层层析分离的最佳条件。展开剂使用乙酸乙酯、甲醇、石油醚的的混合溶液。由于乙酸乙酯的极性最高，而石油醚的极性最低，从而可以通过改变三种有机溶剂的不同配比来找出薄层层析分离的最佳条件。另一方面，通过Sephadex LH-20 柱层析将用甲醇溶解的代谢产物分离，收集各个馏分进行HPLC检测分析。未能准确得到成分较为单一的活性产物。且分离出来的组分对肿瘤细胞的抑制率差别很大，分析原因应该是由于在后期分离过程中有效物质浓度倍稀释的过多。由于实验室条件的限制和时间较短等原因，对此深表遗憾。对失败的主要原因本人认为可能是因为对凝胶渗透法（GPC）使用的不熟练和操作过程不规范导致对粗提物未能很好的分离出单一物质，通过这次的实验还是熟练的HPLC的基本用法受益匪浅。参考文献1周荣丽，穆军 ，张翼，谢则平 海洋真菌活性代谢产物最新研究进展. 天然产物研究与开, 2008，20（2）41-74 .2食品与药品Food and Drug 2007 年第9 卷第03A 期 1-5.3刘晶晶，陈全震，曾江宁，高爱根，廖一波. 海洋微生物活性物质的研究进展. 海洋学研究, 2007, 56(3): 5-11.4林永成，周世宁. 海洋微生物及其代谢产物. 化学工业出版社, 2003, 4(2): 224-296.5王祥敏，李明. 海洋真菌及其生物活性物质多样性研究. 海洋湖沼通报, 2007, 6(5): 69-74.6Takahashi M. A new Gliotoxin produced by Aspergillus sp. Iisolat