纳米药物 7、纳米基因药物.doc

第7章 纳米基因药物7.1 概述自20世纪70年代DNA重组技术诞生以来，以重组DNA技术为核心的现代生物技术产业蓬勃发展。1976年，世界上第一家应用生物技术开发新药的公司（Gentech 公司）建立，开创了现代生物技术产业发展的新纪元。1982年美国Lilly 公司首先将重组胰岛素投放市场，标志世界第一个基因工程药物的诞生。接着，美、日、英、瑞士等国先后批准了10余种基因工程药品上市。例如，EPO、G-CSF、tPA等，在治疗肿瘤等一系列疾病上取得明显的疗效。此后，以基因工程药物为主的各种基因工程产品和细胞工程产品层出不穷，并陆续商品化。基因工程药物因其疗效好，副作用小，应用范围广泛而成为各国政府和企业投资开发的热点领域，大量的基因工程药品连续问世，年产值达数十亿美元。基因工程药物是将目的基因用DNA 重组的方法连接在载体上，然后将载体导入靶细胞（微生物、动物细胞或人体组织靶细胞），使目的基因在靶细胞中得以表达，最后将表达的目的蛋白质提纯及做成制剂，从而成为蛋白质药物或疫苗。这就称为基因工程药物。现有或正在开发中的基因工程药物大致有以下几类：单克隆抗体、疫苗、基因治疗药物、干扰素、白介素、生长因子、重组可溶性受体、反义药物、人生长技术、组织纤溶酶原激活剂、凝血因子、集落刺激因子、促红细胞生成素及超氧化物歧化酶（SOD）等，若目的基因直接在人体组织靶细胞中表达，就成为基因治疗（Gene therapy）。广义基因治疗是指利用基因药物的治疗。通常所说的基因治疗，即狭义基因治疗，是指用完整的基因进行基因替代治疗，一般用DNA序列。主要的治疗途径是体外（ex vivo）基因治疗，即在体外用基因转染病人靶细胞，然后将经转染的靶细胞输入病人体内。自1990年较成功地进行了腺苷脱氨酶（ADA）缺乏引起的免疫缺陷病的人体基因治疗至今，大部分基因治疗临床试验都是体外基因治疗，即先从病人体内获得某种细胞（例如T淋巴细胞），进行培养，在体外完成基因转移后，筛选成功转移的细胞扩增培养，然后重新输入患者体内。这种方法操作复杂，但效果较为可靠。此外，基因治疗也可以用基因药物进行直接体内治疗，所用的基因药物可以是完整基因或基因片段（包括DNA或RNA）；治疗途径可以是替代治疗或抑制性治疗。例如，1994年美国科学家利用经过修饰的腺病毒为载体，成功地将治疗遗传性囊性纤维化病的正常基因cfdr 转入患者肺组织中。这种直接往人体组织细胞中转移基因的治病方法叫做体内（in vivo）基因治疗。在基因治疗过程中，外源基因及其构建体多为纳米尺度的DNA分子，因此这种转基因方式大多涉及纳米技术。另外外源基因只有整合到细胞染色体中，变为其中一部分才有可能得到持续的高表达。由于人体内只有少数几种细胞或组织可接收直接导入的裸露DNA，而其它细胞或组织对此法有抗性。因此，采用什么样的手段将精心挑选的功能基因有效地转移到人体内，穿过细胞膜，进入细胞核与染色体整合，这是关系到基因治疗成败的关键。经过近二十年的努力，各种帮助外源性基因进行转移的方法相继问世。这些方法包含物理学、化学和生物学方法。物理方法主要有电穿透法、显微注射法、基因枪法和碳化硅纤维介导法等；化学方法主要包括磷酸钙沉淀法、DEAE葡聚糖介导法、聚乙二醇介导法和脂质体介导法等；生物学方法主要包括以病毒（如腺病毒、逆转录病毒、腺相关病毒和疱疹病毒等）为载体进行基因转移，以及农杆菌介导法等；生物物理方法主要有电击法和胚胎干细胞法等。在前述的各种转导方法中，除了电穿透法、显微注射法、基因枪法和碳化硅纤维介导法等物理方法，其他各种转导技术都是利用纳米级载体携带外源基因进入受体细胞，因此属于典型的纳米操作范畴。随着基因治疗研究的不断深入，尤其是伴随着基因治疗临床实验的广泛开展，人们已认识到理想的基因载体应当具备如下特点： 靶向特异性，且不被免疫系统识别； 有利于基因高效转移和长期表达； 高度稳定，容易制备，可浓缩和纯化； 无毒副作用，可生物降解，对病人和环境安全无害。目前应用于基因治疗的载体主要有病毒载体（viral vector）和非病毒载体（non-viral vector）两种。基于本书为“纳米药物”，故本章重点阐述与纳米技术关系密切的非病毒载体。非病毒纳米基因载体的研究在近几年愈来愈受到人们的重视。到目前为止，研究者们已设计了多种类型且各有特点的非病毒纳米基因载体，主要包括脂质体（liposome vector）和阳离子聚合物（cationic polymer vector），如壳聚糖、多聚赖氨酸、树状大分子等。非病毒纳米基因载体的本质是将基因治疗中的基因看作药物，然后从药剂学和生物药剂学的角度来考虑如何把基因导入靶细胞或组织、器官并进行表达。由于常用的DNA为超螺旋或开环结构，空间体积太大，并且不能有效主动地进入细胞，因此必须进行压缩（condensation）或利用其它分子或技术的辅助。DNA分子在加入诸如多价阳离子（Ca2+、Co3+、La3+等）、脂质体、阳离子聚合物、酒精或碱性蛋白后通过压缩过程可以组装成高度有序的结构，使体积缩小为原来的百分之一以下，从而可以有效地进入细胞并进行转染。7.2 纳米脂质体纳米脂质体介导的基因转移有以下的优势：纳米脂质体与细胞膜融合将目的基因导入细胞后即被降解，对细胞无毒副作用，可反复给药；纳米脂质体与基因的复合容易，制备简单，重复性好，易于大量生产；纳米脂质体不激活癌基因和免疫反应；DNA或RNA与纳米脂质体复合后，不易被灭活或被核酸酶降解；纳米脂质体携带的基因可转运至特定部位，操作简单快速，重复性好。纳米脂质体介导的基因转移面临的主要问题是脂质体对靶细胞缺乏识别能力，基因透过细胞膜的能力较低，以及脂质体在血浆中的稳定性较差。为了解决以上问题，研究人员根据需要对脂质体进行了适当的修饰来制备各种类型的纳米脂质体，如阳离子纳米脂质体、聚阳离子纳米脂质体、免疫纳米脂质体、融合纳米脂质体、pH敏感纳米脂质体和长循环纳米脂质体等1-5，其中有关阳离子纳米脂质体的研究最为广泛。本节重点介绍阳离子纳米脂质体（cationic nano-liposome）。7.2.1 阳离子纳米脂质体的组成1987年，Felgner等6首次将等量的氯化三甲基-2, 3-二油烯氧基丙基铵（DOTMA）和二油酰基磷脂酰乙醇胺（DOPE）制成小单层脂质体，即转染试剂Lipofectin。实验结果表明此转染试剂可有效地用于DNA转染。1989年将该转染试剂用于RNA的转染，发现其可高效转移RNA到人、鼠等多种动物细胞内。这一发现大大促进了阳离子脂质体作为一类新型高效基因载体的广泛应用研究。目前使用的阳离子纳米脂质体通常由一种阳离子脂质和一种中性辅助脂质在适当的条件下复合而成7。阳离子脂质体转基因的效率与阳离子脂质的组成密切相关8。下面将分别对一些常见的阳离子脂质、辅助脂质和脂质体的结构进行介绍。1 阳离子脂质阳离子脂质分子在结构上由四个部分组成：一个或多个阳离子头部（head）、连接链（spacer）、连接键（linker bond）和疏水烃尾（hydrophobic tail）。阳离子脂质的头部大都包含胺类基团（除一种脂质含脒基外），从简单的氨基到被甲基或羟乙基团取代的季铵盐。阳离子脂质的极性头起着脂质体与DNA、脂质体-DNA复合物与细胞膜或细胞内其它组分相互结合的作用。在阳离子胆固醇衍生物中，带有叔胺基团的阳离子胆固醇化合物比季铵盐化合物有更高的转染活力，并且毒性小得多。带有多价极性头基团或具有多个正电荷极性头的阳离子脂质体转染效率较高，这可能是因为它与DNA的结合较牢固。连接链的长度能影响阳离子纳米脂质体与粘膜表面的相互作用，从而影响转染活力。一般来说，带有长连接链的阳离子纳米脂质体能显著增强与粘膜表面的相互作用，转染效率高。连接键是类脂分子很重要的组成部分，它决定了阳离子纳米脂质体的化学稳定性和生物可降解性。醚键和C-N键的化学稳定性较高，但不易被生物降解，一般不适用于体内实验；含有酯键的阳离子纳米脂质体较易被生物降解，细胞毒性小，但它们的化学稳定性通常较差。通常采用的连接键是化学稳定性较高、但又可以生物降解的酰胺键和氨甲酰键等。常见的阳离子纳米脂质体的疏水烃尾主要有脂肪烃基链和胆固醇环。脂肪烃基链的碳原子数通常为12至18个，以达到在生理温度下为脂双层提供足够的流动性，又能使脂双层膜维持一定的刚性，以便为阳离子纳米脂质体在体内的脂质融合创造条件。对以脂肪链为尾部的脂质体，碳链加长会导致转染效率降低，但在链内引入不饱和键可提高效率。将胆固醇用作疏水烃尾，效果常常优于脂肪链，因为由它参与形成的双分子层结构更稳定。表7-1内列出了目前常用的一些阳离子纳米脂质9,10。2 辅助脂质辅助脂质主要有磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰胆碱（PC）、胆固醇（Chol）等。二油酰基磷脂酰乙醇胺（DOPE）是应用最广的一种辅助脂质，可与阳离子脂质形成稳定的纳米脂质体，与DNA等具有良好的融合性。该脂质在阳离子脂质体与DNA形成复合物、复合物进入细胞、复合物从内涵体脱离以及DNA与阳离子纳米脂质体分离的过程中都起着重要的作用。因此， DOPE已被广泛应用于阳离子纳米脂质体基因转移系统中以提高基因的转染效率。目前最常使用的脂质体，如DOTMA/DOPE脂质体、DOSPA/DOPE脂质体、DDAB/DOPE脂质体都含有DOPE，其中DOTMA、DOSPA、DDAB作为阳离子脂质靠静电作用与核苷酸结合，而DOPE则作为可融性脂质促进阳离子脂质与细胞膜的融合。若用DOPC（二油酰基磷脂酰胆碱）代替DOPE，脂质体的融合性下降，转染效率也随之降低。这正是DOPE成为“脂质伴侣”的原因11。而以Chol为辅助脂质的阳离子脂质体虽然稳定性提高，但转染效率却降低。此外，加人大相对分子质量的阳离子聚合物，如聚赖氨酸（PLL）或硫酸鱼精蛋白，可减小复合物的粒径，有效避免DNA被核酸酶降解，从而提高转染效率12,13。表7-1 用于制备阳离子纳米脂质体的常见阳离子脂质缩写名化学名DOTMA氯化三甲基-2, 3-二油烯氧基丙基铵DOTAP溴化三甲基-2, 3-二油酰氧基丙基铵DOSPA三氟乙酸二甲基-2, 3 -二油烯氧基丙基-2-(2-精胺甲酰氨基)乙基铵DTAB溴化三甲基十二烷基铵TTAB溴化三甲基十四烷基铵CTAB溴化三甲基十六烷基铵DDAB溴化二甲基双十八烷基铵DORI溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-二油酰氧基丙基铵DORIE溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-二油烯氧基丙基铵DORIE-HP溴化二甲基-3-羟丙基-2,3-二油烯氧基丙基铵DORIE-HB溴化二甲基-4-羟丁基-2,3-二油烯氧基丙基铵DORIE-HPc溴化二甲基-5-羟戊基-2,3-二油烯氧基丙基铵DPRIE溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-双十六烷氧基丙基铵DSRIE溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-双十八烷氧基丙基铵DMRIE溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-双十四烷氧基丙基铵DOGSN-(2-精胺甲酰基)-N, N -双十八烷基甘氨酰胺DOSC1，2-二油酰-3-琥珀酰-sn-甘油胆碱酯DC-Chol3-N-（N，N-二甲基胺乙基）胺基甲酰基胆固醇LPLL脂质多聚-L-赖氨酸SA硬脂胺7.2.2 阳离子纳米脂质体的结构脂质体的体内过程除与脂质的化学组成相关外，还与脂质体的大小和形状等特性有关。脂质体的直径约在25 nm1000 nm范围内，甚至更大。它们可由单层双分子膜组成，也可由多层双分子膜组成。按脂质体的大小和脂质双层数目可将纳米脂质体分为以下几类：小单层纳米脂质体（small unilamellar vesicles，SUVs）：SUVs是具有脂质双分子层的最小单位，其大小根据介质的离子强度和膜的脂质组成不同而不同，一般在20 nm100 nm之间。大单层纳米脂质体（large unilamellar vesicles，LUVs）：LUVs是指直径大于100 nm的单层脂质体。多层纳米脂质体（multilamellar vesicles，MLVs）：MLVs是由双分子层与水交替形成的囊泡。纳米脂质体的直径大都在300 nm700 nm之间，组成MLVs的磷脂双分子层有五层或更多，层数较少的有时也称为少层脂质体（oligolamellar liposomes）。曾有研究表明，在脂质组成一定的情况下，MLVs与DNA形成的复合物转染效率要高于SUVs-DNA复合物14。然而，Ross等利用最近提出的一种优化脂质-DNA复合物性质的方法进行的研究表明，由SUVs或MLVs与DNA形成的复合物的粒径差别并不十分显著（均在300 nm2000 nm之间，只与制备时所用的介质有关），细胞吸收的程度也较相近，转染效率仅与形成的复合物的最终粒径有关15。产生这一现象的原因被认为是在复合物形成过程中，DNA会诱使SUVs向MLVs转化。对于人工合成的阳离子纳米脂质体，细胞会产生较强的排异作用，这可能限制其在体内的应用。由SA和DOPE按质量比1:1制备的脂质体是目前已知的完全由天然脂质体所构成的阳离子纳米脂质体，它对机体的免疫原性小，可能今后会在基因治疗上得到较好的应用。表7-2列出了已商品化的阳离子脂质体16。表7-2 已商品化的阳离子脂质体阳离子脂质体组成成分厂商LipofectinDOTMA/DOPE=1：1（质量比）GIBCO BRLDOTAPDOTAPBoehringer、MannheimTransfectACEDDAB/DOPE=1：3（摩尔比）GIBCO BRLLipofectAMINEDOSPA/DOPE=1：1（质量比）GIBCO BRLTransfectamDOGSPromegaTfxTM-50TfxTM-50/DOPEPromegaDC-CholDC-Chol/DOPE=1：1（摩尔比）Sigma7.2.3 阳离子纳米脂质体介导基因转移的机制自1987年首次应用阳离子纳米脂质体转移基因取得成功以来，阳离子纳米脂质体介导基因转移的研究取得了一系列的进展。但是，关于纳米脂质体-基因复合物被细胞摄取的机理及复合物在细胞内的转运过程尚未完全阐明。其可能的机理是：首先，阳离子纳米脂质体与带负电的基因通过静电作用形成纳米脂质体-基因复合物，此复合物因阳离子纳米脂质体的过剩而带正电；带正电的纳米脂质体-DNA复合物由于静电作用吸附于带负电的细胞表面，然后通过与细胞膜融合或细胞的内吞作用进入靶细胞。在细胞内，阳离子纳米脂质体-基因复合物发生分离，基因进一步被转运到细胞核内，并在细胞核内转录和翻译，最终产生目的基因编码的蛋白质17-19（图7-1）。图7-1 阳离子纳米脂质体介导基因转移示意图1 阳离子纳米脂质体与基因形成复合物(1) 复合物的形成及结构阳离子脂质的正电荷头部与基因上带负电荷的磷酸酯基团之间的静电引力是纳米脂质体-基因复合物形成的主要推动力。纳米脂质体与DNA相互作用和影响，DNA可以诱导脂质体之间发生融合，而与此同时DNA的形态也会发生显著的改变。脂质融合是指当两种不同形态的脂质混合时，两种脂质双层结构发生复合形成新的脂质双层结构的过程。它能由某些因素所诱发，如一些脂质、肽类的接近或pH值的变化。在纳米脂质体与DNA复合以及复合物在细胞内的转运过程中，脂质融合的作用是很重要的20。Litzinger等21在研究了脂质体在水中的多种形态后，认为纳米脂质体在水中最重要的两种存在形态是La相和HII相。La相是一种具有流动性烃链的层状结构，而HII相是一种二维的六方晶相结构。两相之间发生转变的温度被称为六方晶相转变温度（TH），具体过程如图7-2所示。图7-2 纳米脂质结构由La相到HII相的转变Cullis和Kruijff22研究了易形成六方晶相构型的脂质的一些基本结构特征。在六方晶相结构中，脂质头部基团呈高度弯曲的形状。由于空间位阻的原因，含有小极性头部基团（如磷酯酰乙醇胺，PE）的脂质比含有大极性头部基团的脂质更易形成六方晶相的构型。极性头部的有效体积还进一步受到静电排斥力和氢键的影响。疏水烃链链长的增加与饱和度的降低（特别是形成反式构型）有利于六方晶相构型的形成。由La到HII相转变过程中，脂质最有利的分子构型是锥状（如小的极性头和大的疏水烃链），而圆柱状的脂质有利于形成双层结构，反锥状的脂质（大的极性头部和小的疏水链）则易形成胶束结构。阳离子纳米脂质体与DNA的相互作用（可用冷冻蚀刻电镜技术、荧光光谱、核磁共振、X射线衍射等方法进行研究）有如下几种模式：静电模型：DNA靠静电吸引力结合在阳离子纳米脂质体的外表面。Felgner23认为一个直径为250nm的纳米脂质体约含2500个脂分子，其中有一半为阳离子脂质分子，而一个长度为2.5kb的质粒DNA分子含有5000个净负电荷，这样一个质粒可结合4个纳米脂质体。内含模型：带负电的DNA完全进入纳米脂质体内部，并靠电荷吸附在阳离子纳米脂质体内层表面，或悬浮在纳米脂质体内部溶液中。Gershon等24研究证明，当DNA与DOTMA/DOPE阳离子纳米脂质体结合时，DNA萎缩成一种凝聚状的结构，被纳米脂质体所包围。当开始加入的脂质体的量较低时，阳离子纳米脂质体结合在DNA分子表面形成聚集的囊泡；当连续加入阳离子脂质体使其浓度达到临界脂质浓度时，DNA诱导的纳米脂质体融合和纳米脂质体引起的DNA压缩开始发生，最终形成了阳离子脂质双层包裹的DNA复合物。细面条模型：线性DNA的周围包围着脂双层结构，DNA与脂分子间靠静电吸引，脂分子呈线型排列在DNA的周围。Sternberg等25用冷冻蚀刻电镜技术研究表明DNA在结合过程中折叠成各种紧凑的结构，最终被融合成管状的脂质体包裹成为一种明显的“杆状”结构，提出了单超螺旋DNA棒状链被一层单脂双层膜所覆盖的模型（图7-3）。图7-3 纳米脂质体-DNA杆状模型模型：Rdler等人26研究发现，阳离子纳米脂质体与DNA混合后结构发生改变，形成一种液晶态、浓缩并呈球状的结构。线性DNA部分插入纳米脂质体内部，纳米脂质体的某一部位双层断开并允许线性DNA分子进入，DNA与纳米脂质体结合。在此过程中，DNA可以分布在脂质体内外两层，最大限度地中和纳米脂质体正电荷。 “蜂窝”模型：在DOPE存在的情况下，阳离子纳米脂质体由层状构型向六方晶相构型转变，同时DNA被阳离子脂质单分子层包裹并排列成二维的六方晶格结构（即“蜂窝”状结构）27,28。阳离子纳米脂质体-DNA复合物呈现的形态结构可能多种多样，也不能排除几种结构同时存在的情况。制备过程中某个条件的改变甚至是采用不同仪器进行观测，都有可能得到不同的结果。(2) 复合物的理化性质复合物的理化性质主要包括粒径、zeta电势及胶体化学稳定性等，这些性质对转染效率的高低起着决定性的作用。影响复合物理化性质的因素有热力学上的，也有动力学上的，主要包括阳离子纳米脂质体与DNA的浓度、介质的离子强度与温度、样品加入的顺序、混合的速率等29,30。阳离子纳米脂质体与DNA正负电荷比（+/-）将强烈影响复合物的理化性质，并最终影响其转染效率。尽管不同的研究者对这一比例的确切数值看法不尽相同，但普遍认为应大于1。体外实验表明，阳离子纳米脂质体的比例越高，转染效率就越高，而细胞毒性也随之增大。因此，使用合适比例的阳离子纳米脂质体与DNA才能达到最佳的转染效果。一般认为，纳米脂质体-DNA复合物带有过量正电荷对转染很关键，可增强与带负电荷的细胞膜的结合力，使进入细胞的复合物的量增加。由于血清蛋白带负电荷，与阳离子纳米脂质结合一方面可以使DNA从复合物中离解而被降解，另一方面也会造成复合物凝聚，最后通过网状内皮系统排出。复合物表面过量的正电荷可以减小或消除这些影响31。不过，也有人32发现DC-Chol/DNA复合物在最佳转染条件下，正负电荷比例小于1，复合物带负电荷并不影响转染效率。造成这一现象的原因可能是体系内只有部分DNA与纳米脂质体形成复合物，或者细胞表面存在DNA的特异受体。复合物的粒径通常比纳米脂质体的粒径稍大，它在一定程度上受纳米脂质体和DNA两者的正负电荷比的影响33-35。当复合物带过量正电荷时，DNA被高度浓缩，粒径较均一，平均在100 nm450 nm范围内。当复合物带过量负电荷时，粒径分布与上述情况基本类似（尽管这种情况下通常存在游离的DNA）。而当阳离子脂质与DNA的正负电荷比为1时，此时复合物呈电中性，其平均粒径在350nm1200nm范围内。由于缺乏静电排斥作用而易聚集，稳定性差。若固定正负电荷比而增加阳离子脂质与DNA的浓度，则复合物粒径增大，稳定性降低，这是因为在高浓度下粒子间间距的减小易导致其沉降。Nakanishi等36的研究结果表明，复合物粒径在0.4m1.4m时，转染效率最高；其次是粒径在1.4m2.0m范围内；而粒径在400nm以下的复合物的转染效率最低。这可能是粒径较大的复合物可携带较多量的DNA，且只有特定尺寸大小的粒子才能通过内吞作用进入细胞。在低离子强度的介质中，纳米脂质体与DNA间形成复合物所需的静电吸引力增大，这使得阳离子纳米脂质体与DNA之间的相互作用更加紧密，从而减少了粒子的聚集和沉降。因此，阳离子纳米脂质体-DNA复合物通常是在离子强度较低的溶液中进行制备的。在一定范围内，介质温度（只要不会引起DNA变性）对复合物的形成及其性质的影响较小。此外，阳离子纳米脂质体与DNA溶液的混合速度和方式对阳离子纳米脂质体-DNA复合物的形成有很大的影响。研究表明，快速混合得到的复合物的粒径较小，而缓慢混合则会导致聚集和沉淀的形成37。此外，为了避免易聚集的中性复合物的形成，若要制备带正电荷的复合物，应该向阳离子纳米脂质体溶液中加入DNA；反之亦然。2 阳离子纳米脂质体-DNA复合物与细胞外物质的相互作用当阳离子纳米脂质体-DNA复合物进入体内后，它将同细胞外的一些物质发生相互作用。这些物质包括：血液成分（如红细胞、蛋白质、脂蛋白等），细胞外介质（糖蛋白，如硫酸软骨素、胶原等）和粘膜分泌物（如透明质酸、粘蛋白等），具体随给药方式不同而异。较高的离子强度尤其是多价阴离子对脂质-DNA复合物施加的影响作用较大。将DOTAP-寡核苷酸（oligonucleotide）复合物加至离子强度较高的培养基质中，脂质易发生融合，形成六方晶相构型，复合物的粒径分布也发生改变38。若复合物内含有DOPE，则这种变化更加明显。由此可见，纳米脂质体-DNA复合物在细胞外基质中易受各种离子和大分子物质的影响，使其稳定性大大下降。值得一提的是，血浆中的白蛋白会吸附到阳离子纳米脂质体-DNA复合物上，使复合物的电位降低，从而减少复合物之间的静电排斥力，最终导致复合物的聚集39。过度的聚集还会引起复合物在毛细血管壁上的沉积。尽管在血浆中确实存在纳米脂质体-DNA复合物的聚集现象，由于聚集体的直径通常在l m以下，比正常的红细胞体积还小，因此很可能可以通过细胞内吞作用而被摄取，内皮细胞上表达的针对变性白蛋白的受体可能参与这一过程。在血浆的影响下，阳离子纳米脂质体-DNA复合物的转染效率通常较低，这可能是DNA从复合物中提前释放所致。血浆中存在大量的生物大分子和核酸酶。一些带阴离子基团的细胞外物质（如肝素）可与阳离子脂质结合，另一些带阳离子基团的细胞外物质可与带负电的DNA结合，这些因素都将促使复合物的分解。此外，血浆中的核酸酶也能引起复合物的分解。阳离子纳米脂质体-DNA复合物静脉注射后能迅速被循环系统清除，在肺中蓄积和表达，而在肝脏中表达的较少。这可能是第一通道效应所致，因为肺毛细血管是阳离子纳米脂质体-DNA复合物静脉注射后遇到的第一个毛细血管床。3 阳离子纳米脂质体-DNA复合物在细胞内的转运(1) 阳离子纳米脂质体-DNA复合物进入细胞基因转染的第一步就是DNA进入细胞。目前认为阳离子纳米脂质体-DNA复合物进入细胞有三种模式： 细胞内吞作用模式。这一假说是指阳离子脂质体与细胞膜结合后，通过细胞内吞作用（endocytosis），将复合物包封于小泡内，进入细胞质后形成内涵体（endosome），与其它细胞内囊泡融合，将内吞物转送到初级溶酶体内，实现纳米脂质体与细胞的融合18,40-42。 直接与细胞质膜融合模式。Felgner等6将细胞与用荧光染料诺丹明（Rhodamine）标记的DOTMA/DOPE/DNA复合物一起培养，发现细胞膜上分布有荧光标记物，证实了融合机制的存在。不过有研究结果显示，膜融合与基因转染之间并不存在相关性，这可能是由于膜融合时DNA释放至细胞外基质而并没有进入细胞核43。尽管如此，膜融合在基因转移过程中的作用还是不容忽视的。 进入细胞质膜的小孔模式。鉴于基因转染在通常情况下需要较长的时间，人们提出了阳离子脂质体-DNA复合物可能通过质膜上的小孔进入细胞的机制44，不过这一模式尚待进一步证实。复合物的理化性质会影响其进入细胞的方式，在某些情况下可促进细胞的吞噬作用。迄今为止的研究结果表明，内吞作用模式是阳离子纳米脂质体-DNA复合物进入细胞的主要方式，是基因转染过程中的一个关键步骤18。基于这一点，人们在复合物上接上蛋白或多肽类配体（如转铁蛋白、植物血凝素、低密度脂蛋白等），通过受体介导的内吞作用使复合物进入细胞，以期提高转染效率。(2) 阳离子纳米脂质体-DNA复合物脱离内涵体质粒DNA通过细胞内吞作用进入细胞后，必须从内涵体中脱离出来才能实现对细胞进行转染。否则，DNA将随内涵体转移至溶酶体内，最终会被大量的核酸酶降解，导致转染失败。通过内吞作用进入细胞的阳离子纳米脂质体-DNA复合物必须与内涵体融合，才能将DNA释放出来。在DNA从内涵体脱离的过程中，脂质的融合起着十分重要的作用。复合物中的DOPE有很好的融合性，在酸性条件下可使内涵体膜稳定性降低，并促进复合物与内涵体膜的融合。Felgner等45研究发现，氯喹能大大增强基因转染的效果。因为氯喹是一种弱碱性物质，在胞质内可以提高内涵体的pH，从而抑制内涵体-溶酶体之间的融合，有助于复合物从内涵体中脱离出来，避免了复合物被核酸酶降解。然而对DORIE/DOPE和DMRIE/DOPE脂质体，氯喹的作用效果相反。这是因为有些脂质体与早期内涵体发生融合，有些则与晚期内涵体融合。氯喹能抑制早期内涵体的成熟，阻止了晚期内涵体的形成，从而抑制了一些脂质体与晚期内涵体的融合。(3) DNA向核周围的转运当阳离子纳米脂质体-DNA复合物从内涵体中脱离以后，如何将DNA转移至细胞核周围成为一个新问题。细胞质是一种带粘性的流体，微粒系统在其中的扩散速率很慢，而DNA必须转移至核的周围才能进入核内获得表达。在胞质内，细胞通过微管网状结构或肌动蛋白微丝等主动转运系统将含DNA的微粒系统转移至核周围39。(4) 阳离子纳米脂质体-DNA复合物的分解研究证明，DNA必须从阳离子纳米脂质体中分离出来，才能发挥它们的作用。将阳离子纳米脂质体-DNA复合物微量注射至细胞核内，并不能对细胞进行有效转染。另外，将裸DNA直接注入胞浆中也不能对细胞进行有效转染。但是，将质粒DNA直接注入细胞核中却获得很高的基因表达18。这表明DNA必须从复合物中释放出来，才能进行有效的转染；而且DNA进入细胞核这一过程是较为重要的限速过程。有人认为，纳米脂质体-DNA复合物的稳定性不同，可能会导致DNA的释放发生在不同的阶段。Xu和Szoka40认为质粒DNA从阳离子纳米脂质体-DNA复合物的释放发生于复合物与内涵体融合的阶段。复合物可使内涵体膜稳定性降低，引起细胞质中内源性阴离子脂质的方向突变（flip-flop），扩散进入内涵体后与阳离子脂质形成电中性的离子对，并从复合物中置换出DNA并使之进入细胞质。但Friend等41认为，阳离子纳米脂质体-DNA复合物以一个整体从内涵体中脱离出来，质粒DNA从复合物的释放应发生在此后的阶段。此外，复合物或游离DNA也有可能从内涵体上形成的小孔进入胞质46。(5) 细胞核对DNA的摄取细胞核对DNA的摄取是在基因转染过程中最重要的一个限速步骤。DNA可能通过被动扩散（如核膜上的小孔）或主动转运进入核内。对于相对分子质量大于70000的分子，核膜小孔将限制其进入细胞核，通常治疗采用的DNA相对分子质量远大于70000，因此DNA主要是通过与细胞核的主动转运系统发生相互作用而进入核内的47。对处于有丝分裂期的细胞而言，由于核膜已经破裂，质粒DNA容易进入核内；对于非分裂期细胞而言，核膜保持完整，质粒DNA能否进入核内是转染成功与否的关键。Friend等41推测纳米脂质体-DNA复合物从内涵体中脱离出来后，脂质与核膜融合，从而促进DNA进入核内。7.2.4 纳米脂质体在基因治疗中的应用纳米脂质体尤其是阳离子纳米脂质体可用于介导许多组织细胞的基因转移，既可转染体外培养细胞，也可转染体内组织细胞。DC-Chol/DOPE脂质体和DMRIE/DOPE脂质体在美国和英国已用于基因治疗的临床试验。目前阳离子纳米脂质体-DNA复合物的实际应用课题主要有肿瘤、神经系统疾病、肺部和呼吸道疾病、炎症等方面。1 在治疗肿瘤方面的应用阳离子纳米脂质体已广泛用于介导肿瘤（包括黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胃癌、前列腺癌等）的基因治疗，动物实验或临床实验都取得了一定的效果。1993年，Nabel等48经美国FDA批准将HLA B7基因用DC-Chol/DOPE阳离子纳米脂质体包埋，以基因转染方法对5例缺少HLA B7基因的期恶性黑色素瘤病人进行治疗，于瘤结节内直接注射一定剂量的纳米脂质体-基因复合物。注射后37天，用PCR方法在注射的瘤结节组织中可检测到质粒DNA，但未在血清中检测到。用免疫化学方法在5例病人瘤组织中均检测到HLA B7蛋白的表达，且能检测到机体对HLA B7的免疫应答。其中1例病人间隔治疗2次后发现，注射结节及远处结节肿瘤均见消退，临床实验取得一定成功。实验的可行性和安全性预示了阳离子纳米脂质体在基因治疗中的潜在应用前景。这是非病毒类纳米基因传递载体在人体内的首次尝试。Nabel还报道了DMRIE/DOPE阳离子脂质体的效果要好于DC-Chol/DOPE阳离子纳米脂质体。E1A基因可抑制裸鼠卵巢癌、乳腺癌的HER-2/neu病毒的过度表达并诱导其凋亡。Hortobagyi等人49开展了DC-Chol脂质体-E1A基因复合物的期临床研究，将复合物胸腔注射于6例乳腺癌患者。结果发现E1A基因在体内得到了一定程度的表达，HER-2/neu的过度表达和肿瘤细胞的增殖得到了抑制。该研究表明了DC-Chol-E1A复合物腔内注射给药的有效性，同时也为E1A基因的期临床提供了可行性保证。Ramesh等50将阳离子纳米脂质体DOTAP:Chol与肿瘤抑制基因p-53混合形成复合物，用来治疗小鼠实验性肺癌。结果肿瘤得到了明显抑制，且转染效率与给药的次数有关（多次给药基因表达的水平为单次给药的2.5倍，而且存活时间也明显延长）。2 在治疗肺部和呼吸道疾病中的应用肺有一个很大的上皮表面，在阳离子纳米脂质体体内基因转移过程中，肺是目的基因表达水平最高的靶器官。气管内滴注或气雾剂给药可绕过内皮屏障，使基因与呼吸道上皮细胞直接接触，转移给靶细胞。以肺与呼吸道为目标的基因治疗逐步引起了人们的重视。肺囊性纤维化（CF）是累及少数器官系统的常见常染色体隐性遗传（AR）综合症，由此引起的慢性肺病的发病率和死亡率都很高。该病致病机理是囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）的缺失，CFTR是cAMP调节的氯离子通道。近年来，用阳离子纳米脂质体介导CFTR cDNA在动物或人呼吸道和肺部转染的实验陆续开展，大部分接受了阳离子纳米脂质体-CFTR cDNA复合物的个体体内都能检测到CFTR基因的表达，部分恢复了氯离子通道的活力，阳离子纳米脂质体如DOTAP/DOPE、DC-Chol/DOPE等都有成功报道51。虽然CFTR基因治疗取得了一定的成功，但是有部分个体在接受治疗后出现了炎性综合症，表现为发热、肌痛和关节痛等，血清TNF-、INF-水平增加，从而抑制了基因的转染52。3 在治疗神经系统疾病中的应用Wareing等53通过向豚鼠耳蜗显微注射阳离子纳米脂质体-DNA复合物，转基因表达在感觉神经上皮内持续达14天，靶器官周围组织没有发生毒性和炎症反应。该研究是阳离子脂质体在耳蜗进行基因转移的首次成功尝试，为内耳疾患进行基因治疗提供了一种安全、快捷的方法。局部脑缺血可导致缺氧性神经细胞凋亡和坏死，缺血组织抗凋亡基因的表达可减轻局部缺血引起的损伤。大鼠局部脑缺血后，立即将构建的人bcl-2质粒（pCMV-bcl-2）与阳离子脂质体形成的复合物注射入脑脊髓液中。48h后，bcl-2基因得到了广泛表达，梗死面积、梗死区域凋亡细胞的数量明显减少54。4 在防治机体炎症损伤方面的应用将构建的人IL-10质粒（pcDNA3-hIL-10）与阳离子纳米脂质体复合后注入急性胰腺炎大鼠腹腔内，治疗7天后胰腺、肝和肺中人IL-10水平显著增加、TNF-水平降低、组织损伤明显减轻，且治疗组大鼠存活率为70%，而对照组仅存活10%（P0.05）55。在防止肺部炎性细胞浸润方面，Zhou等56将阳离子纳米脂质体与中性粒细胞抑制因子（NIF）基因的复合物转入鼠体内，研究了体内NIF表达对脂多糖诱导的肺多形核中性粒细胞（PMN）的分离及肺损伤发展的影响。结果表明，NIF在肺血管表达产生一种特异的2整合素结合蛋白，调节PMN通过肺泡-毛细血管上皮发生的浸润并阻止肺血管上皮损伤。7.3 阳离子聚合物（cationic polymer）阳离子聚合物(cationic polymer), 又称聚阳离子（polycation）,是一类表面带有正电荷的高分子聚合物。它可以中和DNA质粒表面的负电荷，使原来DNA螺旋结构的庞大空间体积缩合至原有体积百分之一以下, 加强了系统穿透能力，聚合物将目的基因包埋在其中，使DNA免受核酸酶的降解。最早用于基因传递的阳离子聚合物是聚阳离子蛋白质，但效率很低。近二十年来，由于合成化学和生物化学的合作与发展，出现了各种天然和合成的阳离子聚合物用于基因传递系统。目前国外文献报道大量用于基因载体的阳离子聚合物有多肽类：聚赖氨酸、聚谷氨酸及其衍生物；多聚胺类：聚乙烯亚胺、聚丙烯亚胺树状大分子；聚甲基丙烯酸类：聚酰胺-胺型树状大分子、聚甲基丙烯酸乙酯2（二甲胺）；阳离子聚酯；阳离子聚磷酸酯；聚乙烯吡啶盐；壳聚糖、明胶等（图7-4）。聚合物分子内存在氨基和其他活性官能团，可通过这些活性部位对聚合物载体进行改性。例如，可根据需要在聚合物分子上耦联细胞（或组织）特异靶向组分，或应用各种修饰方式改变其生理和理化性质。调控基因药物在体内的吸收、分布、代谢、消除等处置过程 57。另外，可以合成相对分子质量大小不同、结构多样的接枝和嵌断共聚物，如一个阳离子链段和一个亲水链段结合形成的嵌断共聚物，该共聚物能自发与DNA形成共聚物胶束，具有较高的胶体稳定性 58。 支链PEI 壳聚糖 PAMAM PLL 图7-4 常用的阳离子聚合物基因载体阳离子聚合物载体与其它形式的非病毒类载体相比有着不可比拟的优点 59： 在生物体内是化学惰性的但具有生物相容性；通过控制复合物纳米粒径尺寸和表面性质可控制载体的生理行为；由于其特殊的结构和表面电荷，具有很高的基因转移效率；遗传物质的释放可做到由聚合物基质的降解速率决定。7.3.1 阳离子聚合物/DNA纳米复合物的形成在一定条件下，荷电相反的两种聚电解质相互作用能够形成聚电解质复合物。聚电解质复合物中的作用力包括静电作用、疏水作用、氢键和范德华力等 60。在反应中由于聚电解质分子的长链结构，当反应物分子之间某一对链段一旦发生复合反应，相邻链段由于不需要发生分子构型的显著变化，更加容易发生复合反应。常用的DNA为超螺旋结构或开环结构，链上的磷酯键上的负电荷使它成为一个链状的聚阴离子（PA）,当它与阳离子聚合物（PC）混合时，通过静电作用与阳离子聚合物作用形成聚电解质纳米复合物。该纳米复合物电镜下观察显示61，多数质粒DNA分子浓缩为孤立的环状结构，DNA的二级及三级结构发生改变，但一级结构无变化，仍保留转录活性。这种聚电解质复合物的超分子结构可以描述为一种核-壳结构62。在这个结构中疏水核是部分中和的DNA，形成壳的是亲水的阳离子聚合物链段，这种核-壳结构，增大了体系在血液循环中的稳定性，保护DNA在传递过程不变DNA酶的降解。阳离子聚合物/DNA纳米复合物是通过快速混合聚合物溶液和DNA溶液而制得。复合反应通常只有在存在过量的阳离子聚合物的情况下才能发生，复合的程度与阳离子聚合物的性质以及聚合物/DNA电荷比有关。反应体系内的小分子电解质的性质、阳离子聚合物和DNA的混合速度、聚合物浓度、溶液的离子强度等因素会影响复合物的形成 62。 Dubruel等 63认为加料次序也会影响复合物的性质，在他的研究中发现，逐步将聚合物加入到DNA中所制得的复合物性能比一次性加入要好，因为前者能很好的将DNA定位。阳离子聚合物/DNA纳米复合物的性质与阳离子聚合物的结构参数有关。这些结构参数包括聚合物侧链的长度、电荷类型（伯胺型、仲胺型或叔胺型）、聚合物相对分子质量、沿聚合物主链的电荷密度等。Reschel 64对一系列的阳离子聚合物和含有伯胺基、叔胺基或季胺盐的共聚物与DNA的纳米复合过程和纳米复合物进行了研究，发现随着缓冲溶液pH值和反应温度的升高，复合物的相对分子质量和粒径增大，相对分子质量较低的阳离子聚合物形成的纳米复合物在NaCl溶液中不稳定。阳离子聚合物/DNA的复合可以减少聚合物表面的正电荷，降低聚合物的毒性。游离的聚乙烯亚胺（PEI）细胞毒性较大，与DNA分子复合后PEI的毒性明显降低 65。过量的阳离子聚合物会导致复合物的表面带正电荷，有利于复合物进入细胞。纳米复合物的粒子的粒径通常为几十至几百纳米，粒子的形状有圆形的、圆突性的、也有管状的，聚合物携带DNA的长度和个数随聚合物的种类的不同而有差异。7.3.2 聚合物/DNA纳米复合物的修饰 外源粒子进入体内后，立即会受到免疫系统的监控，被网状内皮系统（RES）中的白细胞、单核细胞以及巨噬细胞吞噬。RES吞噬外源粒子的机制为 66：纳米复合物进入循环系统后被血浆调理素的蛋白吸附，调理素能吸附外来物质并加速RES对这些物质的吞噬，最主要的调理素为补体核免疫球蛋白。吞噬作用的速度由作用底物的理化性质决定，底物的形状、亲水性和表面Zeta电位的大小都对纳米复合物粒子在体内的循环稳定性有一定的影响。纳米复合物粒子的亲脂性大易被调理素调理，并被具有吞噬功能的细胞吞噬。聚合物/DNA纳米复合物进入体循环后，它将同细胞外的一些物质相互作用，血浆中的白蛋白会立即吸附到纳米复合物上，同时，还会受到体内的一些聚阴离子的攻击。表面电荷太大的纳米复合物易与巨噬细胞的聚阴离子受体相互作用或与生物细胞膜的非特异性离子间相互作用而迅速被清除。为了减少RES系统对复合物纳米粒的吞噬，延长体内循环时间，可对聚合物进行适当的修饰以改善其表面性质。常用的高分子修饰物有聚乙二醇（PEG）、混合磷脂、非离子表面活性剂、IgA及血清成分等。基因治疗的靶向性是值得密切关注的问题之一。所谓靶向性, 是指在治疗过程中,把治疗作用或药物效应限定在特定的靶细胞、组织或器官内,而不影响其他正常的细胞、组织或器官的功能。为达到靶向性，可在阳离子聚合物分子上结合多种靶向配基，形成配基-聚阳离子耦合物。常用的靶向配基有: 肝细胞特异性的ASGP及合成的半乳糖化蛋白配基、肿瘤细胞特异性的转铁蛋白、整联蛋白结合多肽、叶酸和抗体, 如用于白血病T细胞靶向的Anti-JLl抗体。7.3.3阳离子聚合物介导转染的机制阳离子聚合物/DNA纳米复合物表面过剩正电荷能促进细胞的吸附，再通过膜的融合或内吞作用将DNA转移进入细胞，形成内涵体，DNA从内涵体释放，进入细胞质中，再进一步进入核内转录、表达。DNA必须从内涵体中脱离出来进入细胞核才能实现对细胞的转染，否则将随着内涵体进入溶酶体而被溶酶体中的核酸酶降解。Bieber 67在研究中发现，纳米复合物从内涵体中释放出来是转染过程中的关键步骤，因此促进内涵体膜的破裂和抑制溶酶体内核酸酶的活性可以提高细胞的转染效率。Wagner 68用耦联有促进膜分解的多肽（membrane-active peptide）的、以线型聚赖氨酸（PLL）为载体的基因运载系统转染细胞时，转染效率较单独使用PLL时可提高101000倍。在复合物或细胞的培养基中加入弱碱性药物氯喹，细胞摄入后，可以提高内涵体的pH值，拟制了降解酶的活性，避免溶酶体对DNA复合物的降解，使得纳米复合物有足够的时间从内涵体中逃逸，从而提高转染效率。7.3.4 常见的阳离子聚合物载体1 聚氨基酸类载体聚氨基酸材料是一类具有良好生物相容性的高分子材料，在药物控释领域有独特的用途。聚氨基酸作为生物材料具有以下两个优点 69：(1)由多种氨基酸可制备得到一系列均聚物和共聚物，主链两侧胺基或羧基提供化学结合的位点；（2）聚氨基酸材料进入生物体内后，主链裂解释放出天然氨基酸组分，降解产物无毒或低毒，无刺激性。（1）聚-L-赖氨酸类载体聚-L-赖氨酸(poly-L-Lysine, PLL)是赖氨酸的均聚产物。聚赖氨酸分子中有许多伯氨基，能很好地浓缩DNA而被广泛用作基因载体材料。电镜观察显示PLL/DNA纳米复合物为2050nm的圆突体或4080nm的棒状结构 70。然而，聚赖氨酸并不是一种理想的转染试剂，在PLL/DNA（/-）比率较高的情况下转染效率仍很低。PLL/DNA纳米复合物在血浆中不稳定，易产生凝聚。当静脉给药用于体内转染时，PLL/DNA复合物迅速被Kuffer细胞捕获，给药30min后在肝脏中可以检测出PLL/DNA复合物占给剂量的70