第五章-植物组织培养技术实验方案.doc

第五章 植物组织培养技术一、植物组织培养中的基本概念(1) 植物组织培养技术:在无菌培养的条件下，将离体的植物器官（根，茎，叶，花，果实等）、组织（形成层，花药组织等）、细胞（体细胞，生殖细胞等）以及原生质体等培养在人工配制的培养基上，并给予适当的培养条件，使其长成完整植株的过程。 (2) 理论依据：植物细胞的全能性，即指植物机体的每个细胞都含有该物种全套的基因组，具有发育成完整个体的潜力。(3) 外植体：从活体植株上切下的，用于组织培养的细胞、组织和器官。一般包括茎尖、根、茎、叶、花、种子等器官以及他们形成的体细胞胚等材料。(4) 分化：在个体发育过程中，由一种相同的细胞类型经细胞分裂后逐渐在形态、结构和功能上形成稳定性差异，产生不同的细胞类群的过程称为细胞分化。(5) 脱分化：已经高度分化的植物器官、组织或细胞，在切割损伤和培养物内外因素的共同作用下，逐渐丧失原来的分化结构和功能，最后形成无组织的细胞团或愈伤组织的过程。(6) 愈伤组织：在人工培养基上由外植体脱分化形成的一团无序生长的薄壁细胞。（具有细胞分裂能力）。(7) 再分化：已经脱分化的细胞在一定条件下，又可经过愈伤组织或胚状体，再分化出根和芽，形成完整植株 ，这一过程叫作再分化。(8) 不定芽：在高等植物正常的个体发育中，芽一般是只从茎尖或叶腋等的一定位置生出。所以这种象顶芽、腋芽、副芽等均在一定部位生出的芽，称为定芽。与此相反，凡从叶、根、或茎节间等通常不形成芽的部位生出的芽，则统称为不定芽。(9) 胚状体：在离体植物细胞、组织或器官培养过程中，由一个或一些体细胞，经过胚胎发生和发育过程，形成的与合子胚相类似的结构。二、植物组织培养过程（菊花为例）1、培养基的配制:方法：培养基干粉配制法称取培养基干粉42g加水加热煮沸溶解后定溶至1L，按照需要的浓度分别加入激素。（其中生根用的植物激素NAA为0.2mg/1000ml）用1mol/L NaOH和1mol/L HCl调节pH至5.8。将配好的培养基迅速分装至150ml组培瓶中，拧上盖子，放入灭菌锅121，灭菌20min。2、菊花接种与培养：（1）取材：取菊花生长旺盛的嫩枝。（2）消毒：(省略)流水冲洗后，加少许洗衣粉刷洗，流水冲20分钟；放入7075%酒精中摇动23次，持续30秒，无菌水冲洗23次，用无菌吸水纸吸干;在210%的次氯酸钠溶液中消毒810分钟，无菌水冲洗23次，无菌吸水纸吸干。接种：减去嫩枝3-4厘米（带有3-4片嫩叶）接到培养基中（注意：不能将一片叶子接入进去并务必要提前做好杀菌、消毒、灭菌措施）培养：将无菌苗培养到光照培养箱中，条件温度：25度、光照：12小时，每隔一周观察幼苗生长情况（3）愈伤组织与不定芽的诱导培养选用合适的培养基分别对植物材料进行愈伤组织和不定芽的诱导。（4）继代培养继代培养是继初代培养之后的连续数代的扩繁培养过程，目的在于繁殖出相当数量的无菌苗。（5）生根培养当无菌苗长到23cm时，选用生根培养基剪取无菌苗转接至生根培养基中进行生根诱导培养。（6）炼苗、移栽炼苗：当无菌苗根系长出约3cm，把无菌苗进行炼苗适应外界环境。先在外界环境闭瓶锻炼3天，再开瓶锻炼3天（以培养基上开始长出菌为宜）。移栽：去净培养基，可先在灭过菌的珍珠岩或蛭石上培养使根系发达再转移到土壤中。【注意事项】1、实验所使用的器材要严格灭菌，注意无菌操作，避免因染菌导致实验失败；2、pH值对培养基的硬度有影响，pH过高培养基变硬，pH过低培养基不能凝固，所以要调整好培养基的pH值；操作不当引起的杂菌污染实验结果，被杂菌污染培养基3 不要将一片叶子接入到培养基中 拓展实验：选取不同外植体诱导愈伤组织和不定芽不同外植体的培养基激素配比如下：叶片： 6BA : 2mg/L NAA: 0.5mg/L将叶片切成0.5cm*0.5cm小块茎段：6BA : 3 mg/L NAA: 0.2 mg/L 将嫩枝切成1cm 茎段腋芽：6BA : 3 mg/L NAA: 0.2 mg/L 将嫩枝切成12cm带腋芽的茎段最后调节PH值至6.0（1）20天后，菊花不同外植体培养情况，见图5：图5 20天后菊花不同外植体形态