河科大代谢调控学期末考试重点.pdf

陈森 代谢调控学代谢调控学 发酵发酵：应用微生物工业上将所有通过微生物的培养，使某种特定代谢产物大量积累的过程都称为发酵。 代谢控制发酵代谢控制发酵：它是采用分子生物学（基因重组技术）或其它生物化学的方法，人为地在 DNA 水平上，改变 和控制微生物的代谢，使有用的代谢产物大量生成和积累的发酵技术。 代谢工程技术目前以微生物利用为主，改变工业微生物之代谢路径，生产所需要的化学物质，如抗生素 关键酶关键酶：是指参与代谢调节的酶的总称。常作为一个代谢途径的限速因子，控制代谢流的质和量。 一一、酶活力的调控酶活力的调控 酶活性的调节酶活性的调节是指一定数量的酶，通过其分子结构的改变来调节其催化反应的速率。 别构（变构）调节理论（其核心是酶分子构象的改变） 脱敏作用脱敏作用：变构酶经特殊处理后，不丧失酶活性而失去了对变构效应物的敏感性，称为脱敏作用。 可通过许多方法：加热处理、05低温处理、化学试剂（汞盐、对氯汞苯甲酸（PCMB） 、尿素等）透析、 X 射线照射、蛋白酶有限水解、pH 的改变等。 变构酶的特征变构酶的特征 调节酶一般为变构酶，是具有多亚基四级结构的蛋白质，具有位于不同亚基的活性部位和变构部位。 许多变构酶的反应动力学性质与一般酶不同，反应速度与基质浓度的关系呈 S 形曲线。 调节酶多处于合成代谢途径， 大多数发生在氨基酸和核苷酸生物合成途径， 而且一般在代谢途径的第一步 或处于代谢途径的分支点上，多是受最终产物的反馈抑制。 效应物同调节性酶的结合与基质同酶的结合位点是分开的，但又相互联系的，用多种物理或化学方法处 理能使酶脱敏（即对应效应不再敏感） ，但保留其催化活性。 酶的活性中心及（变构）中心（调节性位点）可同时被结合，变构中心（副位点）的结合不一定是特异 性的（专一性） ，可以结合不同的物质，产生不同的效应，变构中心的结合可能引起蛋白质分子构象的变化，从 而影响酶活性中心的催化活性。 变构效应是反馈抑制的基础，是调节代谢的有效方法。 反馈抑制的类型反馈抑制的类型 协同反馈抑制协同反馈抑制（多价反馈抑制多价反馈抑制） ：分支代谢途径中几个末端产物同时过量时才能抑制共同途径中的第一个酶 的一种反馈调节方式。 举例：天冬氨酸族氨基酸合成中天冬氨酸激酶受赖氨酸和苏氨酸的协同反馈抑制和阻遏。 合作反馈抑制合作反馈抑制（增效反馈抑制增效反馈抑制） ：两种末端产物同时存在时，共同的反馈抑制作用大于二者单独作用之和。 举例：在嘌呤核苷酸合成中，磷酸核糖焦磷酸酶受 AMP 和 GMP （和 IMP）的合作反馈抑制， 二者共同存在时， 可以完全抑制该酶的活性。而二者单独过量时，分别抑制其活性的 70%和 10%。 积累反馈抑制积累反馈抑制： 每一分支途径末端产物按一定百分比单独抑制共同途径中前面的酶， 所以当几种末端产物共 同存在时它们的抑制作用是积累的，各末端产物之间既无协同效应，亦无拮抗作用。 陈森 顺序反馈抑制顺序反馈抑制：一种终产物的积累,导致前一中间产物的积累，通过后者反馈抑制合成途径关键酶的活性， 使合成终止。 同功酶调节同功酶调节: :同功酶是指能催化相同的生化反应，但酶蛋白分子结构有差异的一类酶，它们虽同存于一个个 体或同一组织中，但在生理、免疫和理化特性上却存在着差别。 二二、酶合成的调节酶合成的调节 酶合成的调节酶合成的调节是一种通过调节酶的合成量进而调节代谢速率的调节机制， 这是一种在基因水平上 （在原核生 物中主要在转录水平上）的代谢调节。 凡能促进酶生物合成的现象，称为诱导。 能阻碍酶生物合成的现象，则称为阻遏。 末端产物阻遏末端产物阻遏: :指由某代谢途径末端产物的过量累积而引起的阻遏。 协调阻遏协调阻遏: : 对直线式合成途径来说，末端产物阻遏的情况较为简单，即产物作用于代谢途径中的各种酶，使之合 成受阻遏。 多价阻遏多价阻遏: :每种末端产物仅专一地阻遏合成它的那条分支途径的酶。 代谢途径分支点以前的“公共酶” 受所有分 支途径末端产物的阻遏。 积累阻遏积累阻遏：每个分支合成途径的终产物仅部分地阻遏初始酶的合成 操纵子操纵子（元元）Operen:Operen:是指结构上、功能上、协同作用的相关基因组成的一个片段（区域） 。操纵子假说认 为： 编码一系列功能相关的酶的基因在染色体中紧密排列在一起， 且它们的表达与关闭是通过同一控制点协同 进行的。 每个操纵子（元）至少由 4 个基因（部分）组成。 调节基因调节基因（RegulatoryRegulatory gene)gene)： 它能编码调节（阻遏）蛋白，现发现有两种调节蛋白： 阴性（负作用） 调节蛋白，此种调节蛋白也称为阻遏物（Repressor） 。正作用调节蛋白，此种调节蛋白也称为激活因子 （Actiration） 。 操纵基因操纵基因（OperatorOperator genegene） ： 控制决定蛋白质（酶）的氨基酸顺序的一整套结构基因的转录，而操纵基因 可受调节基因产生的阻遏物所阻遏，许多情况下，单个操纵基因可以控制一个或一个以上（多个）结构基因。 结构基因结构基因（StructuralStructural genegene） ： 是指在操纵基因邻近（一般在下游处）存在一个或多个基因，它编码不起 调控转录作用的蛋白质，如酶、膜蛋白和核糖体等。 启动基因启动基因（PromoterPromoter genegene） ：启动子（基因）含有两个和 RNA 多聚酶结合的顺序，一个集中在 RNA 多聚酶 起始位置前约 10 个碱基对， 另一个则集中在这个位置前 35 个碱基对， 当 RNA 多聚酶与启动子接触并结合上去， mRNA 合成即开始。 陈森 分解代谢物阻遏分解代谢物阻遏: :指细胞内同时有两种分解底物（碳源或氮源）存在时，利用快的那种分解底物会阻遏利用慢的 底物的有关酶合成的现象。 分解代谢物的阻遏作用，并非由于快速利用的甲碳源本身直接作用的结果，而是通过甲碳源（或氮源等） 在 其分解过程中所产生的中间代谢物所引起的阻遏作用。 因此，分解代谢物的阻遏作用，就是指代谢反应链中，某些中间代谢物或末端代谢物的过量累积而阻遏代谢 途径中一些酶合成的现象。分解代谢物阻遏的实质是由于细胞内缺少了环腺苷酸（cAMP） 。 代谢控制发酵的基本思想 （一一）切断支路代谢切断支路代谢 1、营养缺陷突变株的应用 营养缺陷突变株：指原菌株由于发生基因突变，致使合成途径中某一步骤发生缺陷，从而丧失了合成某些物 质的能力，必须在培养中外源补加该营养物质才能生长的突变型菌株。 2、渗漏突变株的应用 渗漏缺陷型是指遗传性障碍不完全的缺陷型，这种突变是某一种酶的活性下降而不是完全丧失，因此，渗漏 缺陷型能少量地合成某一种代谢最终产物， 不能合成过量的最终产物， 所以不会造成反馈抑制而影响中间代谢产 物的积累。 （二二）选育抗反馈调节突变株选育抗反馈调节突变株 所谓抗反馈调节突变株就是已解除了反馈调节作用的突变株 。在这些突变株中，因为反馈抑制或阻遏，或 两者引起的自动调节作用已被削弱或解除，所以能合成较多的最终产物。 1、选育抗代谢类似物的突变株 代谢拮抗物或代谢类似物。 指一类在化学结构上与细胞内必要代谢物结构相似， 并可干扰正常代谢活动的化 学物质 2、酶特性的利用 在育种过程中，当找不到有效类似物时，若目的产物的生物合成途径中的某酶具有底物专一性宽的特性，则 可利用该酶对其他底物的活性，育得代谢调节突变株。 3、营养缺陷型回复突变株的应用 调节酶的变构特性是由它的结构基因决定的，若调节酶因编码它的基因发生突变而失活，则有两种可能： 是编码为催化亚基与调节亚基的基因发生了变化 仅仅是编码催化亚基（或活性部位）的基因发生变化。 若通过再次突变，使调节酶的活性恢复，这时又有两种可能： 一是催化亚基和调节亚基恢复（或大体恢复）到第一次突变前那样的状态。 另一种是催化亚基得到恢复，而调节亚基却丧失了调节作用，这情况实质上是编码调节亚基的 DNA 突变，解 除了反馈抑制作用。 因此可以采用营养缺陷型的回复突变的方法， 从营养缺陷型回复突变株中获得对途径中的调节酶解除反馈调 节的调节突变株。 （三三）增加前体物的合成增加前体物的合成 通过选育某些营养缺陷型或结构类似物抗性突变株以及克隆某些关键酶的方法，增加目的产物的前体合成， 有利于目的产物的大量积累。 1、 分支合成途径中，切断其他分支合成途径 2、 目的产物的生物合成从别的终产物（氨基酸等）开始时，除设法解除目的产物自身合成的反馈调节外， 也应设法解除对其前体物合成的调节。 3、 目的产物的生物合成从分解途径的中间产物开始。如 Glu。 4、 利用基因工程技术 将生物合成途径中的关键酶基因克隆到多拷贝载体上，使其大量扩增，从而增加目的产物前体物的合成。 （四四）去除终产物去除终产物 改变细胞膜渗透性， 把属反馈控制的因子终产物迅速不断地排出细胞外， 不使终产物积累到引起反馈调节的浓 度，就可预防反馈控制。 （五五）特殊调节机制的利用特殊调节机制的利用 1 、多种产物控制机制的利用 多产物控制机制中， 只有当与反馈控制有关的全部终产物同时过剩存在时， 才产生完全的或最大的反馈抑制， 陈森 任一种终产物单独过剩，完全不产生或产生部分的反馈控制作用。利用这种特性，可设法控制目的产物以外的终 产物供给量。 2 、平衡合成的利用 （2）平衡合成（Balanced synthesis） D E A B C F G 经分支合成途径生成两种终产物E、G，E和G取平衡合成。E为优先合成，当E过剩 时，E反馈抑制与优先合成途径有关的C D酶，转而合成G，当G过剩时，可逆转E 的反馈抑制，即E的反馈抑制被G所逆转，又转为优先合成E，这样的例子很多。例如， 黄色短杆菌中， Asp族氨基酸生物合成的前体物Asp和分支途径中的中间产物乙酰CoA 的生成，形成平衡合成。 3、代谢互锁的利用: 从生物合成途径看，是受一种完全无关的终产物的控制。它只是在很高浓度下（与生理学浓度相比）才能体 现抑制作用，而且是部分性的抑制（阻遏）作用。 4 优先合成： 脂类代谢与控制脂类代谢与控制 谷氨酸的生物合成途径及调节机制谷氨酸的生物合成途径及调节机制 EMPEMP 途径的关键酶途径的关键酶 磷酸果糖激酶：ATP、O2、柠檬酸的抑制，为 AMP 所激活。 3-磷酸甘油醛脱氢酶：受碘乙酸的抑制。 烯醇化酶：受氟化物的抑制。 HMPHMP 途径途径 ( (磷酸戊糖途径磷酸戊糖途径) ) 是从葡萄糖-6-P 开始，即单磷酸己糖基础上开始降解，故亦称为单磷酸己糖途径，磷酸戊糖支路（HMP 途径 中 3-P-甘油醛可以进入 EMP 途径） 。 HMPHMP 途径的重要意义途径的重要意义 A、产生大量 NADPH2，一方面为脂肪酸、类固醇等物质的合成提供还原力，另一方面可通过呼吸链产生大量 的能量。 B、与 EMP 途径在果糖-1，6-二磷酸和甘油醛-3-磷酸处连接，可以调剂戊糖供需关系。 C、为核苷酸和核酸的生物合成提供戊糖-磷酸。 D、途径中的赤藓糖、景天庚酮糖等可用于芳香族氨基酸合成、碱基合成、及多糖合成。 E、途径中存在 37 碳的糖，使具有该途径微生物的所能利用的碳源谱更为更为广泛。 F、通过该途径可产生许多种重要的发酵产物。如核苷酸、若干氨基酸、辅酶和乳酸（异型乳酸发酵）等。 EDED 途径途径：又称 2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡糖酸（KDPG）裂解途径。 EDED 途径的特点途径的特点 1、ED 途径的特征反应是关键中间代谢物 2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸（KDPG）裂解为丙酮酸和 3-磷酸甘 油醛。ED 途径的特征酶是 KDPG 醛缩酶。 2、反应步骤简单，产能效率低。 3、此途径可与 EMP 途径、HMP 途径和 TCA 循环相连接，可互相协调以满足微生物对能量、还原力和不同中 间代谢物的需要。好氧时与 TCA 循环相连，厌氧时进行乙醇发酵。 陈森 三羧酸循环三羧酸循环 三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle）是需氧生物体内普遍存在的代谢途径，因为在这个循环中几个主 要的中间代谢物是含有三个羧基的柠檬酸，所以叫做三羧酸循环，又称为柠檬酸循环；或者以发现者 Hans Adolf Krebs（英 1953 年获得诺贝尔生理学或医学奖）命名为 Krebs 循环。三羧酸循环是三大营养素（糖类、脂类、 氨 基酸）的最终代谢通路，又是糖类、脂类、氨基酸代谢联系的枢纽。 三羧酸循环的生物学意义三羧酸循环的生物学意义 1、生物体获得能量的最有效方式 2、是糖类、蛋白质、脂肪三大物质转化的枢纽 3、获得微生物发酵产品的途径 4、葡萄糖在分解代谢过程中产生的能量有两种形式：直接产生 ATP；生成高能分子 NADH 或 FADH2，后者在 线粒体呼吸链氧化并产生 ATP。 5、糖酵解：1 分子葡萄糖 2 分子丙酮酸，共消耗了 2 个 ATP，产生了 4 个 ATP，实际上净生成了 2 个 ATP，同时产生 2 个 NADH 6、丙酮酸氧化脱羧：丙酮酸 乙酰 CoA，生成 1 个 NADH。三羧酸循环：乙酰 CoA CO2 和 H2O，产 生一个 GTP（即 ATP） 、3 个 NADH 和 1 个 FADH2。 4 4 ATPATP + +（1010 3 3）ATPATP + + （2 2 2 2）ATPATP = = 3838 ATPATP 乙醛酸循环乙醛酸循环：在植物和微生物中还可通过所谓“乙醛酸循环”使乙酰 CoA 转变成琥珀酸。乙醛酸循环可以说 是三羧酸循环的辅佐途径 。 乙醛酸循环的意义乙醛酸循环的意义 1、TCA 循环的支路，供给四碳二羧酸。 丙酮酸到乙酰辅酶 A 不可逆 乙醛酸循环不含脱羧反应 2、微生物的石油发酵有重要意义。 石油降解成乙酰辅酶 A，经乙醛酸循环合成四碳二羧酸，进而积累琥珀酸等代谢产物。 CO2CO2 固定反应固定反应 异养型微生物的 CO2 固定主要是合成 TCA 循环中间产物。 从理论上讲，利用 1 分子草酰乙酸就可以不断地推动 TCA 环的运行（因为草酰乙酸可通过 TCA 环再生） 。假 如 TCA 环中的中间产物被用作它用，那么就须加以补充，才能维持 TCA 的正常运行。异养型微生物固定 CO2 生产 二羧酸补充 TCA 环的中间产物。 CO2CO2 固定途径固定途径 （1）由磷酸烯醇式丙酮酸羧化（激）酶（或称草酰乙酸激酶）催化，并需要核苷三磷酸参与。 （2）由丙酮酸羧化酶催化。 （3）先由苹果酸酶催化，进行还原羧化作用，生成苹果酸，然后，再生成草酰乙酸。 电子传递系统与氧化磷酸化电子传递系统与氧化磷酸化 生物氧化：细胞内一切代谢物进行氧化作用，产生大量能量的过程。 脱氢：底物的脱氢作用 电子供体：被氧化的物质 电子受体：接受电子的物质 递氢：电子供体氧化脱下的氢交给氢载体，并通过多个载体完成电子从供体到受体的传递 不直接交给电子受体 受氢：受氢体接受氢 电子传递系统电子传递系统：由一系列氧化还原势不同的氢传递体组成的一组链状传递顺序。在氢或电子的传递过程中， 通过与氧化磷酸化反应发生偶联，就可产生 ATP 形式的能量。 部位：原核生物发生在细胞膜上，真核生物发生在线粒体内膜上。 氧化磷酸化氧化磷酸化：底物脱下的氢（2H2H+ + 2e）经过呼吸链(respiratory chain) 或电子传递系统 (electronic transport system )的传递最后交给氧，并与之结合生成水。在此过程中，氧化释放的部分能 量以高能磷酸键的形式储存在 ATP 分子中（ADP+PiATP） ，这种氧化过程与磷酸化过程的偶联称为氧 化磷酸化 。这是需氧生物合成 ATP 的主要方式。 磷氧比磷氧比（P/OP/O） ：当电子在呼吸链传递消耗氧的同时，有无机磷酸的消耗。消耗 P 原子的摩尔数与 O 原子的摩 尔数之比称为 P/O 比。研究组织呼吸的实验显示: NADH 呼吸链的 P/O 为 3，FADH 呼吸链的 P/O 为 2。 陈森 糖代谢的调节糖代谢的调节 细胞能量水平的调节 糖的过量摄入，除了部分供能以外， 糖原的合成增加；而运动使糖的分解加快，糖原的合成变慢。缺乏糖的供应， 糖异生作用加强。 途径中关键酶的活性在相当程度上受到细胞能量水平（主要是细胞中腺嘌呤核苷酸，ATP 和 ADP、AMP 的相对比 例）的影响，这些核苷酸常是糖代谢途径关键酶的变构调节剂。 D-D-核糖发酵的代谢控制育种核糖发酵的代谢控制育种 1、 出发菌株选择 芽孢杆菌属(Bacillus)的细菌转酮酶缺陷突变株积累 D-核糖具有普遍性。而 E.coli、鼠伤寒沙门氏等细菌的转 酮酶缺陷突变株并不积累核糖，多采用芽孢杆菌属细菌。 2 、转酮酶缺陷突变株的分离（选育） （1） 选育不利用 D-葡萄糖酸或 L-阿拉伯糖的突变株， 因为 D-葡萄糖酸和 L-阿拉伯糖必须通过磷酸戊糖途径进 行代谢，若转酮酶发生缺陷，那样菌体自然也就不能利用 D-葡萄糖或 L-阿拉伯糖。 （2）选育莽草酸缺陷突变株 （3）选育 L-trp-、L-tyr-、L-phe-、CoQ-、Vk-或叶酸缺陷突变株。 3、其它标记 在维持转酮酶缺陷的情况下，进一步诱变使菌体带上具有高葡萄糖脱氢酶活性和丧失孢子形成能力，可使 D- 核糖大量积累。 葡萄糖脱氢酶是芽孢杆菌属细菌的孢子所特有的酶，该酶由于 NAD、NADP 和 NADH2、NADPH2 会发生分子型的 变换，结果在菌体对数生长期被诱导，导致 D-核糖大量积累，若生孢子 D-核糖减少 4 、利用基因工程 5 、发酵控制 发酵培养基： 碳源：葡萄糖、D-甘露糖、山梨醇、D-甘露醇、麦芽糖、乳糖、甘油、 糊精、可溶性淀粉等。 氮源：干酵母、酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、玉米浆 、 （NH4）2SO4、CaCO3 。 要在好气条件下，pH 中性，温度 37 。 柠檬酸代谢控制发酵柠檬酸代谢控制发酵 柠檬酸发酵过程的控制要点 （1）控制 Mn2+、NH4+浓度，解除柠檬酸对 PFK 的抑制，使 EMP 畅通无阻。 （2）控制溶氧，防止侧系呼吸链失活 （3）控制培养基中的 Fe2+ 的浓度，使顺乌头酸水合酶失活。 柠檬酸发酵的代谢控制育种 1、透明圈大的菌株 平板：10%甘薯 + 2 %的琼脂 + 0.5% CaCO3 诱变后，涂布，透明圈大的则好 2、显色圈大小 平板：麦汁培养基 + pH 值指示剂 诱变后，33培养 3 天，透明圈大的则好。 3、耐高渗透压突变株 在高渗透压的培养基中菌体的生长和柠檬酸的合成不受影响 1)选育在含 16-25%甘薯粉的平板上生长良好的突变株 2)选育在含 10-20%柠檬酸的平板上生长良好的突变株 4、不分解柠檬酸的菌株 不利用柠檬酸为碳源的菌株，说明其 TCA 循环中柠檬酸后续酶的活性较低，或者丧失，这有利于积累柠 檬酸。 方法：以柠檬酸为唯一碳源的培养基上生长不好的突变株。 5、形态突变株 形态与柠檬酸产量有一定关系 1）d1/3 正常菌落的 s 型，菌落凸起，孢子着生稀疏 2）菌丝、孢子颜色较浅的突变株 陈森 3）孢子紧密而细小的突变株 4）在葡萄糖合成培养基中孢子不长、迟长或少长的突变株 6、选育单氟乙酸、三氟乙酸或 2,4-二硝基酚敏感突变株 单氟乙酸竞争性抑制乌头酸酶 三氟乙酸抑制乌头酸酶 2,4-二硝基酚抑制异柠檬酸脱氢酶活性 7 、强化 CO2 固定反应的突变株 选育氟丙酮酸敏感的突变株 8 、强化柠檬酸合成酶 基因工程的方法 9 、pH 和铁离子控制 增加脂肪酸的合成方法增加脂肪酸的合成方法 提高能荷，即提高微生物细胞内 ATP 的水平，以利于脂肪酸的合成。 选育丧失或只具有微弱柠檬酸脱氢酶活力的突变株，如异柠檬酸脱氢酶的渗漏突变株等。 有利于柠檬酸合成而不利于柠檬酸降解的突变株或条件，如添加异柠檬酸脱氢酶抑制剂或选育对抑制剂敏感 的突变株，均有利于脂肪酸的大量积累。 多不饱和脂肪酸发酵的代谢控制育种多不饱和脂肪酸发酵的代谢控制育种 -亚麻酸代谢控制发酵 1、出发菌株 多采用被孢霉（Mortierella） 、毛霉（Mucor） 、红酵母（Rhodotorula） 、小克银汉霉（Cunninghamella）等 产油脂高的真菌作出发菌株。 2、切断或减弱支路代谢 营养缺陷型：a-亚麻酸-、花生四烯酸-、二十碳五烯酸-渗漏突变型：花生四烯酸、二十碳五烯酸 3、解除反馈调节 选育脂肪酸结构类似物，如（LTBr） ，耐高浓度的 r-亚麻酸突变株。 4、强化能量代谢 提高菌体细胞内 ATP 的水平有利于脂肪酸合成。 5、增加前体物 （1）菌体生物合成-亚麻酸与 HMP、EMP 途径直接相关。增加 HMP 途径，NADPH 的数量增多，有利于-亚麻 酸产量的提高。 （2）过量的磷酸盐或通气不足会使 EMP 途径增强。而使产生 NADPH 的 HMP 途径受阻，导致不饱和脂肪酸的合 成降低。 （3） 通过选育单氟乙酸敏感、碘乙酸敏感、 萘啶酮酸敏感突变株，均有助于-亚麻酸产量的提高。 另据报道， 选育异柠檬酸脱氢酶渗漏突变殊，也有利于-亚麻酸产量的提高。 6、选育-6 脱氢酶活力强的突变株 7、选育低温生长突变株 8、选育耐高糖的突变株 一一、生成谷氨酸的主要酶反应生成谷氨酸的主要酶反应 （1）谷氨酸脱氢酶(GDH)催化的还原氨基化反应 异柠檬酸脱氢酶活力强异柠檬酸脱氢酶活力强：提供 NADPH，用于还原-酮戊二酸生成谷氨酸，形成氧化还原共扼体系。 当-酮戊二酸过量时，对异柠檬酸脱氢酶发生反馈抑制作用，停止合成-酮戊二酸。 陈森 在谷氨酸的生物合成中必须有谷氨酸脱氢酶和异柠檬酸脱氢酶的共轭反应，在铵离子存在下，两者非常密切 地偶连起来，形成强固的氧化还原共轭体系，不与 NADPH2 的末端氧化系相连接，使-酮戊二酸还原氨基化生成 谷氨酸。 谷氨酸合成的调节机制谷氨酸合成的调节机制 谷氨酸脱氢酶异柠檬酸脱氢酶PEP 羧化酶柠檬酸合成酶 黄色短杆菌中谷氨酸的代谢调节机制 （1）优先合成谷氨酸比天冬氨酸优先合成 （2）谷氨酸脱氢酶（GDH）的调节谷氨酸对谷氨酸脱氢酶存在反馈抑制 和反馈阻遏。 （3）柠檬酸合成酶的调节谷氨酸受能荷调节外，还受谷氨酸的反馈阻 遏。 （4）异柠檬酸脱氢酶的调节-酮戊二酸反馈抑制异柠檬酸脱氢酶 （5） -酮戊二酸脱氢酶先天性丧失或微弱。 （6）磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的调节天冬氨酸的反馈抑制与阻遏， 谷 氨酸的反馈抑制。 生物素的影响 生物素主要是影响糖降解的速度，而不是影响 EMP、HMP 的比率。打破了糖降解速度与丙酮酸氧化速度之间 的平衡，因此，丙酮酸趋于生成乳酸。 对 CO2 固定反应的影响：是丙酮酸羧化酶的辅酶，大过量时， CO2 固定反应提高 30%。 对乙醛酸循环的关键酶异柠檬酸裂解酶的影响：为 G、琥珀酸所阻遏，为醋酸诱导。以葡萄糖为原料生产谷 氨酸时，通过控制生物素亚适量，几乎看不到异柠檬酸裂解酶活性。 谷氨酸生产菌的育种思路谷氨酸生产菌的育种思路 1、切断或减弱支路代谢 (1)减弱-酮戊二酸进一步氧化 （2)选育减弱 HMP 途径后段酶活性的突变株 （3）选育不分解利用 Glu 的突变株 切断-酮戊二酸继续向下氧化的反应，选育以 Glu 为唯一碳源，菌体不生长或生长微弱的突变株。 （4）选育减弱乙醛酸循环的突变株 2、解除自身反馈调节 （1)选育耐高渗透压的菌株 耐高糖、高 Glu 的菌株 耐高糖突变株：2030% G 耐高 Glu 突变株：1520%味精 耐高糖、高 Glu 突变株：20%G+15%味精 （2）选育解除 Glu 对谷氨酸脱氢酶反馈调节的突变株 选育酮基丙二酸抗性突变株。 Glu 结构类似物抗性突变株，如 Glu 氧肟酸盐抗性突变株。 选育谷氨酰胺抗性突变株。 3、增加前体物的合成 （1）选育强化 TCA 循环中从柠檬酸到-酮戊二酸的突变株 （2）选育强化 CO2 固定反应的突变株 4、提高细胞膜的渗透性 抗 Vp 类衍生物突变株 选育溶菌酶敏感突变株 选育二氨基庚二酸缺陷突变株 选育温度敏感突变株 5、选育强化能量代谢的突变株 糖代谢的调节 当能荷高时，抑制糖酵解，抑制 TCA 循环的关键酶 陈森 氮代谢的调节 Glu 发酵控制的关键：降低 Pr 合成能力，使合成的 Glu 不能转化成其他 aa 和参与 Pr 的合成。 细胞膜通透性控制细胞膜通透性控制 a,生物素阻断脂肪酸的合成影响细胞膜的合成 b.表面活性剂对生物素有拮抗阻断脂肪酸的合成 c.在对数生长期添加青霉素抑制细胞壁合成细胞膜损伤 d.甘油缺陷型磷脂的合成受阻影响细胞膜的合成 e.油酸缺陷型阻断不饱和脂肪酸的合成影响细胞膜的合成 谷氨酸生产菌的育种思路 1、切断或减弱支路代谢 （1）减弱-酮戊二酸进一步氧化：减弱-酮戊二 酸脱氢酶复合体的活性，使代谢流向 Glu 方法: 分离出-酮戊二酸脱氢酶的编码基因，定 点突变，钝化酶的活性。 -酮戊二酸脱氢酶的渗漏突变株。 （2）选育减弱 HMP 途径后段酶活性的突变株：从葡 萄糖到丙酮酸的反应是 EMP 和 HMP 途径组成的， 但 HMP 还可生成核糖、核苷酸、莽草酸等物质，消耗了葡萄 糖，降低 Glu 产率。 （3）选育减弱乙醛酸循环的突变株：四碳二羧酸是 由 CO2 固定反应和乙醛酸循环提供的，减弱乙醛酸循 环， CO2 固定反应所占比例就会增大， Glu 产率就高。 选育琥珀酸敏感突变株 琥珀酸是异柠檬酸裂解酶的阻遏物 选育不分解利用乙酸的突变株 以醋酸为唯一碳源，菌要生长，必须走乙醛酸循环 2、解除自身反馈调节 （1）选育耐高渗透压的菌株 （2）选育解除 Glu 对谷氨酸脱氢酶反馈调节的突变株 Glu 结构类似物抗性突变株， 如 Glu 氧肟酸盐 抗性突变株 3、增加前体物的合成 （1）选育强化 TCA 循环中从柠檬酸到-酮戊二酸的 突变株 选育柠檬酸合成酶活力强的突变株 选育抗氟乙酸、氟化钠、氮丝氨酸、氟柠檬酸 等突变株。他们是乌头酸酶的抑制剂 （2）选育强化 CO2 固定反应的突变株 选育以琥珀酸或苹果酸为唯一碳源生长良好的菌 株。 选育氟丙酮酸敏感性突变株 氟丙酮酸是丙酮酸脱氢酶的抑制剂，越敏感表明菌 通过丙酮酸向乙酰 COA 的转化反应越弱，相对地 CO2 固定化占比越大。 陈森 4、提高细胞膜的渗透性 抗 Vp 类衍生物突变株 选育溶菌酶敏感突变株 选育二氨基庚二酸缺陷突变株 选育温度敏感突变株 5、选育强化能量代谢的突变株 能量代谢受阻： -酮戊二酸继续向下氧化能力的缺陷 乙醛酸循环弱 TCA 循环前一阶段的代谢减慢 赖氨酸发酵赖氨酸发酵 关键酶：天冬氨酸激酶 赖氨酸、苏氨酸（协同 E） 优先合成： 蛋氨酸比苏氨酸、赖氨酸优先合成 苏氨酸比赖氨酸优先合成 代谢互锁 在乳糖发酵短杆菌中，赖氨酸分支途径的初始酶二氢吡啶-2，6-二羧酸合成酶受亮氨酸反馈阻遏。 平衡合成：天冬氨酸和乙酰 CoA 形成平衡合成。当乙酰 CoA 合成过量时，能解除天冬氨酸对 PEP 羧化酶 的反馈抑制。 赖氨酸生产菌的育种途径赖氨酸生产菌的育种途径 1、切断支路代谢： 切断或减弱合成 Met 和 Thr 的分支途径 （1）营养缺陷型的选育（Hom-） 1)一方面节省原料，天冬氨酸半醛全部转变成 lys. 2)另一方面，限量补给 Hom。Thr、Met 生成有限，解除 Thr 和 lys 对 AK（天冬氨酸激酶）的协同反馈抑制。 （2）优先合成的转换：渗漏缺陷型的选育 高丝氨酸渗漏突变株（HomL）:高丝氨酸脱氢酶（HD）活性下降，但不完全丧失，代谢流发生变化，由原 来优先合成 Hom（即 Met 和 Thr ）方向转到合成 lys， Met 和 Thr 只是少量合成，不足以引起对 AK 的协同反 馈抑制，lys 得以积累。 2、 解除反馈调节 （1）天冬氨酸激酶反馈调节的解除即 AK 脱敏 类似物中，以 AEC（S-（2-氨基乙基半胱氨酸） ）效果最佳。通过诱变，使编码天冬氨酸激酶的结构基因发 生突变，使天冬氨酸激酶对赖氨酸及结构类似物不敏感，既使赖氨酸过量，该激酶也不与赖氨酸或类似物结合， 但酶的活性中心不变。 （2）磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的脱敏与激活 赖氨酸合成的前体物是天冬氨酸，天冬氨酸能反馈抑制 PEP 羧化酶，因此，为增加 Asp 的量，需切断生成 丙酮酸的支路，同时解除 Asp 对 PEP 羧化酶的反馈抑制。 选育丙氨酸营养缺陷型或丙氨酸温度敏感突变株。 减少 Asp 的损失；增加磷酸烯醇式丙酮的量 选育 AspHxr、磺胺类药物抗性突变株。 能解除 Asp 对 PEP 羧化酶的抑制，使 PEP 更多地生成 Asp。 选育氟丙酮酸敏感突变株。 氟丙酮酸抑制丙酮酸脱羧酶，使丙酮酸积累。 生物素激活磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PC） 。 陈森 生物素的功能： 一是使谷氨酸在细胞内积累，产生足够的反馈抑制，是代谢流转向赖氨酸合成。 二是生物素增加 PC 酶的活性。 选育在琥珀酸平板上快速生长的突变株。 增大谷氨酸的反馈抑制，使代谢流转向生成草酰乙酸，其标记是 GluHxs。 3、解除代谢互锁 在乳糖发酵短杆菌中， 赖氨酸的生物合成与亮氨酸之间存在代谢互锁， 赖氨酸生物合成分支的第一个酶 （DDP 合成酶）受亮氨酸的阻遏。 解除这一代谢互锁的方法: 选育亮氨酸缺陷型菌株， 或者以抗 AEC 的赖氨酸的生产菌为出发菌株，经诱变得抗 AEC 兼亮氨酸缺陷型 菌株；或者选育亮氨酸渗漏突变株 选育抗亮氨酸结构类似物突变株 从遗传上解除亮氨酸对 DDP 合成酶的阻遏 选育对苯醌或喹啉衍生物敏感的突变株。 苯醌或喹啉衍生物是生物合成亮氨酸酶系的抑制剂，对细菌生长抑制。 4 、增加前体物的合成和阻塞副产物的生成 前体物前体物： 丙酮酸丙酮酸、 草酰乙酸草酰乙酸、 天冬氨酸天冬氨酸 关键酶关键酶： 天冬氨酸激酶天冬氨酸激酶 方法： 选育丙氨酸缺陷型 游离氨基酸以丙氨酸浓度最高。 选育抗天冬氨酸结构类似物突变株（抗天冬氨酸氧肟酸盐突变株） 选育适宜的 CO2 固定酶/TCA 循环酶活性比突变株 草酰乙酸由 TCA（途径 1）和 CO2 固定反应（途径 2）生成。 途径 1：每消耗 2molG，生成 1mol lys(不可缺，供能、供中间产物，辅助途径) 途径 2：每消耗 1molG，生成 1mol lys（高转化率，耗能，主要途径） 5、改善细胞膜的透过性 易于提取，解除反馈调节。乳糖发酵短杆菌 AECr 中 lys 的排出是通过主动运输进行的。 6、选育温度敏感突变株 7、应用基因工程构建工程菌 苏氨酸发