课件：血浆脂蛋白检测.ppt

1,第十一章 血脂及血浆脂蛋白检验,2,动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS),冠心病急性事件 （不稳定型心绞痛、急性心肌梗死和冠脉猝死）,血脂、血浆脂蛋白及载脂蛋白检验的重要性,3,临床常规血脂和脂蛋白测定项目: 总胆固醇（totalcholesterol，TC，包括FC和CE） 甘油三酯(TG) 高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C) 低密度脂蛋白胆固醇(LDL- C) 载脂蛋白等。,4,第一节 概述 第二节 血脂、脂蛋白及载脂蛋白测定,本章内容概要,5,教学目标和要求,1、掌握胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、载脂蛋白的常用测定方法及其临床应用。,2、熟悉脂类、脂蛋白、脂蛋白受体的分类与组成，高脂血症的定义、分型、生化诊断要点，临床血脂分析项目的选择与注意事项。,3、了解脂蛋白代谢紊乱与动脉粥样硬化的关系。,6,第一节 概 述,血脂及血浆脂蛋白 脂蛋白代谢 脂蛋白代谢紊乱 临床血脂分析项目,7,一、血脂及血浆脂蛋白,血脂：是血浆中脂类（脂质）物质的总称。包括中性脂肪（甘油三酯）和类脂（胆固醇、胆固醇酯、磷脂、糖脂、游离脂肪酸）。,定义：,脂蛋白：脂类难溶于水，正常血浆脂类物质 与蛋白质结合成脂蛋白的形式运输和代谢 。,8,大致为球形颗粒，由两大部分组成，即疏水性的内核和亲水性的外壳。内核由不同量的CE与TG组成，表层由载脂蛋白、PL及FC组成，FC及PL的极性基团向外露在血浆中，载脂蛋白是兼性化合物，它的疏水部分掩蔽在脂蛋白中，而亲水部分突出于脂蛋白颗粒的表面。,9,（一）血浆脂蛋白的分类,超速离心法：根据各种脂蛋白中蛋白质和脂质含量不同所导致的密度不同。,电泳法：根据脂蛋白颗粒大小不同和所含蛋白质的 表面电荷不同，利用电泳将其分离。,分离方法,10,超速离心法：,乳糜微粒（chylomicron,CM）,极低密度脂蛋白（very low density lipoprotein,VLDL）,中间密度脂蛋白（intermediate density lipoprotein,IDL）,低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）,高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL,脂蛋白（a）lipoprotein (a),Lp(a),乳糜微粒、前-、和 四条脂蛋白区带,电泳法,11,+,-,Lp(a),12,（二）血浆脂蛋白的组成与特征,组成：,蛋白质、甘油三酯、磷脂（phospholipid，PL）、游离胆固醇（free cholesterol ，FC）及胆固醇酯（cholesterol ester，CE）等成分组成。,13,（三）载脂蛋白,脂蛋白的蛋白部分称为载脂蛋白(apolipoprotein，Apo),定义：,种类：,按1972年Alaupovic建议的命名方法，用英文字母顺序编码，分为ApoA、B、C、D、E、F、G、H、J等。由于氨基酸组成的差异，每一型又可分若干亚型。,来源：,肝脏小肠粘膜细胞,14,功能：,构成并稳定血浆脂蛋白结构，作为脂类的运输载体。 调解脂蛋白代谢关键酶的活性 作为脂蛋白受体的配体，参与脂蛋白与细胞表面脂蛋白受体的识别、结合及其代谢过程,15,（四）脂代谢有关的酶类与特殊蛋白质,胆固醇酯转运蛋白、磷脂转运蛋白、微粒体甘油三酯转运蛋白 参与几种脂蛋白的转换和清除。,酶：,蛋白质：,LPL、肝脂肪酶（HL或HTGL）、LCAT、HMG-CoA还原酶 参与TG分解、FC合成和酯化,16,脂代谢转运蛋白,定义：,血浆中脂蛋白部分含有一种特殊的转运蛋白，能促进血浆各脂蛋白间胆固醇酯、甘油三酯和磷脂的单向或双向转运和交换，这类特殊转运蛋白称脂质转运蛋白（lipid transfer protein,LTP）。,组成：,胆固醇酯转运蛋白（cholesterol ester transfer protein,CETP）,磷脂转运蛋白（phospholipid transfer protein,PTP）,甘油三酯转运蛋白（triglyceride transfer protein,TTP）,17,（五）脂蛋白受体,定义：,脂蛋白受体是存在于细胞膜上与相应的脂蛋白配体特异结合的一类糖蛋白。,功能：,在决定脂类代谢途径、参与脂类代谢、调节血浆脂蛋白水平、清除潜在致动脉粥样硬化的脂蛋白等方面起着重要的作用,18,种类：,LDL受体（LDL receptor） VLDL受体（remnant receptor） 清道夫受体（scavenger receptor）。,19,LDL受体（Apo B，E受体）： 分布于肝细胞、动脉壁平滑肌细胞等细胞膜表面 识别结合ApoB100、E的脂蛋白如LDL、VLDL、-VLDL。 合成受体内胆固醇的负反馈调节 LDL受体途径：LDL受体介导的、通过细胞膜吞饮作用而摄入LDL等。,各种脂蛋白受体功能,VLDL受体（ApoE受体或残粒受体）： 分布在代谢活跃的心肌、骨骼肌、脂肪等组织细胞。 识别、结合含ApoE的脂蛋白如CM残粒和-VLDL残粒,清道夫受体： 存在于巨噬细胞及血管内皮细胞表面 识别、结合修饰的LDL如氧化型LDL（oxLDL)。,20,二、血浆脂蛋白代谢,分类：,外源性代谢途径：指食物中摄入的胆固醇和甘油三酯在 小肠中合成CM及CM代谢的过程 。,内源性代谢途径：指肝脏合成VLDL，然后转变为IDL和 LDL，LDL被肝脏或其它器官代谢的过程 ，以及HDL的代谢过程,胆固醇的逆向转运：,HDL参与将胆固醇从外周组织运输到肝脏的过程。,21,22,（一）CM,小肠粘膜细胞合成 新生的CM 成熟的CM CM残粒 结合VLDL受体摄入肝细胞,（二）VLDL,肝脏合成和分泌 成熟的VLDL VLDL残粒（IDL）,结合VLDL受体摄入肝细胞,LDL LDL受体途经代谢,（三）LDL：运输肝合成的内源性胆固醇从肝内至肝外的主要形式,与LDL受体（肝或肝外细胞）结合经LDL受体途径代谢,LDL,LDL氧化后生成的oxLDL经清道夫受体清除,（四）HDL：参与胆固醇逆向转运,肝脏、小肠合成 新生的HDL 成熟的HDL 结合HDL受体摄入肝细胞,23,三、脂蛋白代谢紊乱,（一）高脂蛋白血症（多见）,定义：,高脂血症（hyperlipidemia，HLP）是指血浆中胆固醇和（或） 甘油三酯浓度异常升高。血浆脂类以血浆脂蛋白形式存在，因此， 高脂血症一般指高脂蛋白血症（hyperlipoproteinemia）。,近年来，已逐渐认识到血浆中HDL降低也是一种脂代谢紊乱。,成人空腹1214h血清（浆）TG2.26mmol/L(200mg/dl)， 胆固醇6.21mmol/ L (240mg/dl) ，儿童胆固醇4.14mmol/ L (160mg/dl),24,分型：,1970年世界卫生组织（WHO）建议将高脂蛋白血症分为五型六类,目前从临床上，可将高脂血症简易地分为4类： 高胆固醇血症（血清TC水平增高）混合型高脂血症（血清TC与TG水平增高）。 高甘油三酯血症（血清TG水平增高）低高密度脂蛋白血症（血清HDL-C水平减低）。,按病因原发性高脂血症和继发性高脂血症,25,表型分型法,主要是基于各种血浆脂蛋白升高的程度不同而进行分型。该分类法不包括病因学，故称表型分类。,26,按是否继发于全身性疾病分类,继发性高脂血症：,原发性：,继发性者由一些全身性疾病引起血脂异常，如糖尿病、肾病综合征、肾功能衰竭、甲状腺功能减退症、肝胆疾病、系统性红斑狼疮、肥胖症、饮酒等。此外，某些药物如-受体阻断剂、降压药等也可引起血脂异常。,在排除继发性高脂血症后，可诊断为原发性。已知部分原发性高脂血症由先天性基因缺陷所致,27,高脂血症的基因分型法,表10-5 家族性高脂血症的临床特征,28,（二）低脂蛋白血症,一般将血清TC3.3mmol/L，或TG0.45mmol/L，或LDL-C 2.1mmol/L者，称为低脂蛋白血症。脂质如TC和TG同时降低或脂蛋白 如HDL、LDL和VLDL同时降低多见。,定义：,原因：因某种原因使脂蛋白合成减少，另外分解代谢旺盛也可导致。,分类：原发性和继发性,（三）高脂血症与动脉粥样硬化,致AS的因素,抗AS的因素,29,第二节 血脂、脂蛋白及载脂蛋白测定,目前临床上开展的血脂测定项目包括TC、TG、HDL及其亚类胆固醇、LDL-C、Lp（a）以及部分载脂蛋白如ApoAI、ApoB等。 TC、TG、HDL-C、LDL-C测定是血脂测定的四个基本指标。 血浆4冰箱中过夜观察其分层现象及清澈度可初步估计各种脂蛋白的变化状况。 血浆脂蛋白电泳结合TC、TG水平有助于高脂血症分型。,概况：,30,血脂测定标准化：,血脂分析前变异来源于： 生物因素，如年龄、性别、种族等因素的个体差异。 生活方式，包括饮食习惯、吸烟、运动及应激等。 临床方面包括疾病或药物引起的脂代谢改变。 血标本采集与处理方面,准确测定应从分析前的准备开始，包括受试者的准备，标本 采集，合格的试剂、校准物的选用，检测方法选择。,方法学上应该采用美国疾病控制中心（CDC）或中华医学会检验分会推荐的操作方法。,31,一、血清（浆）静置试验,将患者空腹12h后采集静脉血分离出血清置4冰箱中过夜，然后观察其分层现象及清澈度。,空腹血清混浊，表示TG升高，可放在4冰箱过夜后进一步观察，如果上层出现奶油样且下层清澈，表明CM升高，VLDL正常，可能为I型高脂血症。如果上层出现奶油样且下层混浊，表明CM及VLDL均升高，可能是、V型。再做电泳若出现宽带即为型高脂血症 空腹血清混浊，4冰箱中过夜后仍为均匀混浊，表明VLDL升高，此时应进一步测定TC， TC升高者可能是III或IIb型，而TC正常者则可能为型。IIa型高脂血症血清也清澈透明。,正常空腹血清应清澈透明。,32,二、血清（浆）总胆固醇测定,化学法,酶法,血清中TC包括CE和FC， 其中CE占70，FC占30。血清中胆固醇在LDL中最多，其次是HDL,33,（一）化学测定法,化学测定法通常需抽提、皂化、纯化、显色四个 步骤。显色剂主要有两类： 醋酸-醋酐-硫酸 （L-B反应） 高铁硫酸 （Zak反应）,特点：,34,1Liberman-Burchard反应,1885年Liberman发现胆固醇在硫酸、醋酐溶液中显色，1890年Burchard用此反应测定胆固醇称为L-B反应。,1953年Zak提出用硫酸、醋酸和Fe3+等与胆固醇作用生成紫红色化合物来测定胆固醇，称为Zak反应。,2Zak反应,条件要求严格、试剂腐蚀性强、对FC与CE的显色强度不一致、呈色不稳定,比L-B反应的灵敏度高，呈色稳定不需要皂化，反应特异性差,3、Abell法（ALBK法）：公认的参考方法,皂化（KOH乙醇溶液水解CE成为FC）、抽提（正己烷 或石油醚提取FC）、显色（L-B反应）。,35,(二)酶测定法(常规方法）,CEH-COD-PAP法,原理： CEH2O FCFFA FCO2 4-胆甾烯酮H2O2 H2O24-AAP苯酚 醌亚胺H2O,试剂：胆固醇酶测定法的试剂中，除了上述三种酶、酚和4-氨基安替比林外，还有维持pH恒定的缓冲液、胆酸钠、表面活性剂以及稳定剂等。胆酸钠是为了提高胆固醇酯酶的活性，表面活性剂的作用是促进胆固醇从脂蛋白中释放出来,500nm,36,特点：,优点：特异性好，精密度和灵敏度都能很好地满足临床实验室的要求，操作简便，试剂无腐蚀性，手工和自动分析皆可，终点法与速率法皆可。,缺点：,某些胆固醇酯酶对胆固醇酯的水解不完全，不能用纯胆固醇结晶以有机 溶剂配制的溶液作为TC分析的校准液，而应以准确定值的血清作为标准。,表面活性剂，如吐温-40可以干扰胆固醇酯酶的作用，而聚乙烯醇6000 可使结果提高12；,本法具有氧化酶反应途径的共同缺陷，易受到一些还原性物质如尿酸、胆红素、维生素C和谷胱甘肽等的干扰。,成人：2.855.69mmol/L（110220mg/dl）,参考范围：,37,TC除了作为高胆固醇血症的诊断指标之外，不能作为其它任何疾病的诊断指标，对于动脉粥样硬化和冠心病而言，TC是一个明确的危险因子，与冠心病的发病率呈正相关。,临床意义：,高TC血症：原发和继发 （了解）,低TC血症：原发和继发 （了解）,38,三、血清（浆）甘油三酯测定,化学法,酶法,39,基本操作：,（一）化学测定法,1、抽提：关键是选用合适的抽提剂，既要使甘油三酯提取完全，又要消除磷 脂、游离甘油和葡萄糖等干扰物质的影响。 正壬烷、异丙醇和稀硫酸混合溶剂 2、皂化：甘油三酯水解生成甘油，这一步大都采用KOH作皂化剂 3、氧化：过碘酸在酸性溶液中将甘油氧化成甲醛和甲酸 4、显色：甲醛的定量主要有两种方法：,甲醛与变色酸(4，5-二羟-2，7-萘二磺酸)在硫酸溶液中加热生成紫色化合物,甲醛与乙酰丙酮在铵离子(NH4+)存在下生成黄色的二乙酰二氢二甲基吡啶,Van Handel法（参考方法）,氯仿抽提TG、硅酸吸附掉磷脂、KOH皂化、过碘酸氧化、变色酸显紫红色,40,(二)酶测定法,1、磷酸甘油氧化酶法（GPO-PAP法） 原理： TG + 3H2O LPL 甘油（Glycerol） + 脂肪酸（3RCOOH） Glycerol + ATP GK+Mg2+ G-3-P + ADP G-3-P + O2 GPO 磷酸二羟丙酮 + H2O2 2 H2O2 + 4-AAP +4-氯酚 POD 红色醌亚胺（Chromogen） + 4H2O,500nm,特异性和 准确性好但是血清中游离甘油明显升高时要考虑其影响,特点：,41,去除FG干扰可用下列方法： 1、外空白法：同时用不含LPL的酶试剂测定FG 作空白。 2、内空白法：又称两步法或双试剂法将LPL和4-AAP组成试剂2，其余部分为试剂1。此法目前为中华医学会检验分会推荐方法。,42,2乳酸脱氢酶法,原理： TG + 3H2O LPL Glycerol + 3RCOOH Glycerol + ATP GK+Mg2+ G-3-P + ADP ADP + 磷酸烯醇式丙酮酸 丙酮酸激酶 丙酮酸 + ATP 丙酮酸+NADH LDH NAD+ + 乳酸,由于反应消耗NADH，故可利用NADH在340nm吸光度降低来 测定甘油三脂的浓度。,43,评价：,本法结果准确，但灵敏度较低，试剂也不太稳定。由于血清本身存在游离甘油和丙酮酸等干扰物质，所以测定时除了要做试剂空白外，还要做标本空白（外空白）,44,3甘油氧化酶法,第一步： FG + O2 甘油氧化酶 甘油醛+ H2O2 H2O2 + EMAE POD 无色物质 消除游离甘油的影响，3-5min后进行第二步反应： TG + 3H2O LPL Glycerol + 3RCOOH FG + O2 甘油氧化酶 甘油醛+ H2O2 H2O2 +4-AAP+ EMAE POD 有色化合物 注：EMAE作用与酚相似，是还原剂，但灵敏度比酚高。,原理：该法分两步完成。,45,血清甘油三酯一般随年龄增加而升高，体重超过标准者往往偏高。 成人：0.451.69mmol/L（40150mg/dl）。,参考值,46,临床意义,原发性高TG血症多有遗传因素，包括家族性高TG血症与家族性型高脂（蛋白）血症等。继发性高TG血症见于糖尿病、糖原累积病、甲状腺机能减退、肾病综合征、妊娠、口服避孕药、酗酒等。 大量前瞻性的研究证实，富含TG的脂蛋白是CHD的独立的危险因子，TG增加表明患者存在代谢综合症，需进行治疗。甘油三酯降低比较少见，甲状腺功能亢进、肾上腺皮质功能减退和肝功能严重损伤时可以见到甘油三酯降低,47,血清（浆）脂蛋白测定,(一)血清脂蛋白电泳,脂蛋白电泳分析可分为预染法和电泳后染色法两大类。,预染法的操作比较简单，分离效果直观。其操作过程是先 将待测血清和苏丹黑染料按一定比例混合进行预染处理，离心后取上清液进行电泳分析。,电泳后染色法为用电泳方法先将血浆脂蛋白各成份分开，再用苏丹黑或油红O进行染色。,临床上比较常用的是预染法电泳。,48,血清脂蛋白琼脂糖凝胶电泳： -脂蛋白：0.30-0.40， 前-脂蛋白：0.13-0.25， -脂蛋白：0.50-0.60， 乳糜微粒：阴性。,【参考值】,49,（二）高密度脂蛋白测定,常以测定HDL-C含量代表HDL水平。,参考方法:,超速离心分离HDL，然后用化学法（ALKB法）或酶法测定其胆固醇含量，此法需特殊设备，而且不易常握。,50,常规方法:,1磷钨酸-镁法,2HDL直接测定法,HDL直接测定法大致分三类，分别是: 聚乙二醇/抗体包裹法 酶修饰法 选择性抑制法，又称掩蔽法，,51,成人：男性1.161.42mmol/L(4555mg/dl) 女性1.291.55mmol/L(5060mg/dl) 1.04mmol/L (40mg/dl), 0.91mmol/L (35mg/dl)为减低。,【参考范围】,【临床意义】,流行病学与临床研究证明，HDL-C与冠心病发病呈负相关，HDL-C低于0.9 mmol/L 是冠心病危险因素。HDL-C大于1.55mmol/L被认为是冠心病的“负”危险因素。 HDL-C下降还多见于脑血管病、糖尿病、肝炎、肝硬化病人。高TG血症往往伴以低HDL-C，肥胖者的HDL-C也多偏低。吸烟可使HDL-C下降，适量饮酒、长期体力劳动和运动会使HDL-C升高。,52,（二）低密度脂蛋白测定,1Friedewald公式法 LDL-CTCHDL-CTG/5（以mg/dl为单位时），或LDL-CTCHDL-CTG/2.2（以mmol/L为单位时）。,2聚乙烯硫酸盐沉淀法 本法并非对LDL-C作直接测定，而是用聚乙烯硫酸（PVS）选择性沉淀血清中LDL，再以血清TC减去上清液（含HDL与VLDL）胆固醇即得LDL-C值。,3直接测定法:两类,目前各类方法测定的LDL-C值都包括IDL和LP(a)的chol在内,53,LDL-C合适范围：3.12mmol/L (120mg/dl)， 边缘升高：3.153.61mmol/L(121139mg/