课件：外周血、骨髓染色体教材.ppt

外周血、骨髓染色体 培养和制片中的注意事项,第一篇：细胞遗传学的基本知识：,引言： 细胞遗传学的形成和发展： 1910年澳地利学者摩尔根在果蝇中发现了性锁 遗传规律；1925年他又发表了基因论；1955年，美籍华人徐道觉首先发现了哺乳动物细胞低渗染色体制备法，为医学遗传学的发展奠定了基础；1970年，卡斯伯森发现了人类染色体的分带技术。,基本知识1：,一、细胞遗传学时期： 该时期大致是在19101940年，这一时期通过对遗传学规律和染色体行为的研究，确立了遗传的染色体学说。 二、什么是染色体的行为： 它是指在细胞周期中，染色体在形态和结构方面所表现出的一糸列有规律性的变化。这种变化对于生物的遗传和变异，起着很重要的作用。,基本知识2：,3、染色体是细胞核内满载遗传信息编码的重要物质，它是由DNA、组蛋白、非组蛋白和少量的RNA所组成的一种核蛋白复合体。从DNA到染色体要经过四级结构的构型变化，它们分别是：核小体、螺线体、超螺线体和染色体。,基本知识3：,染色体组型： 即根据每种生物染色体的数目、大小和形态等特征，借助显微照相技术，将单个细胞内的同源染色体剪下、依次配对和分组排列，这就构成了该个体的染色体组型或核型。由于细胞在有丝分裂的中期，其染色体的形态最为典型，故此，通常把细胞分裂的中期，作为识别染色体的个体性和研究染色体组型的最佳时期。,基本知识4：,染色体带型： 染色体经过一定程序的处理并用特定的染料染色之后，在普通在光镜或荧光镜下，染色体可显示出不同深浅颜色的条纹或不同强度的荧光区带，这种区带就称之为染色体带。染色体上染色体带的形态表现，就称之为染色体带型。这种显示染色体带的过程，就称之为染色体显带。,第二篇：培养过程中的注意事项,注意事项（一）：,器皿的清洗是整个实验的关键性的第一步 1、玻璃器皿的清洗 新的玻璃器皿先用清水冲干净，再在清洁剂（如洗衣粉、洗洁 精等）溶液中，用毛刷彻底刷干净，然后清水冲净。晾干。再用5-10%HCL（浓HCL原液浓度约36%）泡过夜后，冲净烘干，再泡入清洗液中24小时（注意泡入的器皿内不能有气泡），再用清水彻底冲净，然后用蒸馏水冲净（普通器皿冲五遍），用作细胞培养的器（如 培养瓶等）蒸馏水冲净后，再用三蒸水冲两遍以上，烘干。用纯棉布或无毒的硬纸包裹，高压高温灭菌备用。旧的玻璃仪器的清洗，可免去中间用5-10%HCL浸泡过夜这一步骤，其余的处理方法仍要保留。,2： 载玻片的清洗处理,把玻片逐片用皂粉液洗刷干净（用粗纱布刷，不要用毛刷），然后用 自来水彻底冲净后，晾干。逐片放入清洗液中浸泡 24小时，取出后用自 来水彻底冲净，泡蒸馏水一天，取出放入盛有80%乙醇的容器。（带密 封盖）内保存备用 *玻片的清洁直接影响染色体铺展、形态及背景的清晰； 玻片之间粘在一起时，密封程度高，皂液和清洗液无法 浸入，故要逐片浸入。,注意事项（二）,细胞培养中的有关知识,全血中含有红、白细胞二类，它们均是处于未分裂的间期细胞。红细胞没有核 无分裂能力；白细胞虽有细胞核存在，但是在外周血中已处于休止期，因此要使白细 胞从间期进入分裂期必须加刺激药物现在。最常用的促使分裂的药品是PHA，它能使 白细胞中的淋巴细胞和单核细胞转化为具有分裂作用 的母细胞，染色体只有在细胞分 裂时才能出现具有一定的形态，这样才便于我们识别。此外，染色体的形态在细胞分 裂中期时最典型的，所以在培养过 程中还需用秋水仙素类药物，这种药物可以破坏细 胞分裂过程中纺锤丝的形成，使细胞分裂停止于中期，由于秋水仙素的作用破坏了纺 锤丝的形成，造成了染色体着丝粒不能分开，但染色体的两臂却在S期时已复制了，这 就构成了染色体的形态为“X”形或“”形，称之为中期染色体图形。为了便于观察和 计数，因而在制作过程中还需采用低渗处理，低渗处理的目的在于使细 胞膨胀，细胞 膜破裂，染色体分散，这样可便于分析,一、培养中应注意的问题1：,1、 标本中的抗凝剂: 标本中的抗凝剂常采用的是肝素，肝素是一种多 糖，能阻止白细胞和淋巴细胞与红细胞集结在一起而 影响培养的质量，但肝素浓度太高会导致溶血，同时也 可抑制淋巴细胞的转化。一般剂量是100单位肝素液 可抗凝5毫升血液。,培养中应注意的问题2：,培养基中的PH值：,培养基中的红色来自成分中的酚红，因为它的变色范围较适合作 培养基的酸碱度指示剂。它在PH7时，颜色由红变深紫色，PH7时， 颜色则由红色逐渐变成黄色。外周血的培养液PH=7.2-7.4。另外，因酚 红含量有时有差异，使培养液的红色深浅略有差异，但不影响培养效果。 另外，在培养中，应注意观察培养基PH的变化。因PH变酸，将不利于 细胞的生长 。,培养中应注意的问题3,培养基接种时的温度：,培养基接种的温度应预热至此37度才好接种。若培养基的温 度低于4 度容易造成细胞的破裂，如果低于10度往往造成细胞进 于休眠状态，影响细胞分裂周期，从而使分裂相减少。外周血和 骨髓的样品应是越新鲜培养效果就越好，但我们的标本一般都是 好几天的，所以当一旦接到标本后应尽快接种并记录每一批标本 接种的时间，这样有利于分析有时培养失败的原因。暂时不能接 种的应将添加过抗凝剂的外周血样品放在4-10的冰箱中保存， 保存期为3天左右。超过七天后接种，培养效果很差。,培养中应注意的问题4,骨髓培养的问题：,骨髓细胞处于生长分裂期，可以直接取样制备染色体标本片， 为了增加细胞的分裂相数量，可在加入秋水仙素的培养液中作短 暂的培养。再收集细胞制备染色体标本片，会获得较满意的分裂 相数目。 但是，白血病的病人往往都有可能服用过抑制白细胞分裂 增殖的药品，再加上也未按停药后一定时间来取材，所以这类病 人的骨髓样品往往经培养后，白细胞仍受到药物的抑制而不进行 分裂增殖，因此标本片很难找到分裂相。所以应严格遵守细胞计 数的原则。,培养中应注意的问题5,最佳培养时间：,外周血淋巴细胞在体外培养中，受到培养液 中的PHA刺激，获得有丝分裂能力，经过68-72 小时的培养后，大多数淋巴细胞进行了三次分裂 增殖，数目达到制备标本片的要求。培养时间过 短，细胞量不足，培养时间过长，细胞老化，营 养耗尽，又浪费时间。实验证明，68-72小时的 培养，效果最为理想。,第三篇：制片中应注意的问题,制片中应注意的问题1：,秋水仙素的浓度：,秋水仙素的浓度和处理时间的长短，对染色体的 分析都有很大的影响。秋水仙素的使用浓度范围比较 宽，可差几十倍之多，一般终浓度为0.2-0.5微克/毫升。 处理4-6小时。秋水仙素的浓度和处理时间的长短，对 染色体的分析都有很大的影响。秋水仙素作用时间越长， 被阻止的中期细胞越多，但染色体也会收缩，收缩过度 会影响形态。,制片中应注意的问题2,低渗处理,低渗处理的时间长短对染色体分析也有很大的影响。 过长，细胞膜往往过早破裂，染色体丢失，过短染色体 分散不佳。低渗后离心速度不能过高，过高往往会使分 裂相过早破裂，完整的分裂相减少。,制片中应注意的问题3-1,1、固定液的作用：,固定 液是稳定染色体的形态结构，清除染色体外层物质对染色体在 玻片上展开的影响，通过更换固定液2-3次，清除红细胞的碎片，使标本 片的背景更为清晰，广泛使用的固定液是甲醇和冰醋酸的混合物，二者的 比例是甲醇冰醋酸=31，现用现配。每次固定时间至少为30分钟，已固 定的细胞在固定液中置冰箱4密封保存一个月也不会变质。,制片中应注意的问题3-2,2、加固定液的注意点：,1： 甲醇和冰醋酸的质量要好； 2：固定液要新鲜，要现配现用，配好的固定液要盖好盖子，这是因为： 甲醇和冰醋酸都很容易挥发，挥发后会影响固定效果，另外长期吸入， 冰醋酸对人体是有害的，轻者会患鼻炎，重者会诱发其他疾病。 3：加固定液的速度不能太快，要沿着管壁慢慢的加； 上述三点未注意将会造成如下结果： （1）：染色体带很模糊， （2 ）：有残留胞浆的痕迹，使背景不清。 （ 3 ）：加固定液的速度太快，则会使染色体容易扭转； （ 4）： 如固定作用不足，染色体会出现毛刷状。,制片中应注意的问题4,胰酶配制要点及使用注意点：,胰酶的配制要注意两点：一是要充分溶解，这一过程一般会观察到 溶液由混浊变澄清；二是配制时间也不能过长，常