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种子纯度研究现状与发展 摘 要：种子纯度鉴定是评定种子等级和质量的重要参考标准，也是我国当前种子质量检验工作的重点和难点。随着现代生物技术的不断发展，种子纯度鉴定技术由传统的形态标记鉴定逐步发展到集形态标记鉴定、生化标记鉴定和DNA分子标记鉴定为一体的综合鉴定技术体系。对现阶段主要的种子纯度鉴定技术进行了简要的介绍，分析了各种技术的优缺点和应用情况，并对种子纯度鉴定技术的发展进行了预测。 关键词：种子纯度；研究现状；检验技术 种子是农业生产中最基本和最关键的生产资料，其纯度的高低是衡量种子质量优劣的主要指标，我国对不同作物种子的纯度进行了严格的规定。种子纯度降低会显著降低作物的产量和产品品质。当前我国农作物种子纯度低劣状况普遍存在，以玉米为例，1994年抽检了88个样品，合格率为0，种子纯度在90%以上的仅占14.8%，纯度最低的只有59.5%；1995年抽检了63个样品，合格样品1份，占1.6%，纯度在90%以上的占23.8%，纯度最低的为73.2%。而研究表明，种子纯度为96.5%和95.6%的玉米比纯度为98.6%的分别减产10.5%和11.1%。因此，提高种子纯度是保证农作物优质高产的基础，对农作物的大田生产和质量监督起决定作用。在我国，种子纯度低的原因主要有2个，一是由种子生产、收获、脱粒、加工、运输等过程中的生物混杂和机械混杂造成的；二是一些繁种单位或个人为了片面追求经济效益而忽视种子质量，甚至掺杂使假，导致种子纯度降低。种子纯度降低会使农民蒙受巨大的经济损 失，所以我国不断地对种子的纯度进行调整和严格规定，加大对种子企业的监管和惩罚力度，以保证广大农民的利益，促进农业市场的健康发展，增强企业竞争力。 1 农作物种子纯度检验的含义及意义 种子纯度的检验应包括两方面内容，即种子的真实性和品种纯度。种子的真实性是指供检品种与文件记录是否相符。品种纯度是指品种典型特性一致的程度。品种纯度检验的对象可以是种子、幼苗或比较成熟的植株。我国的农作物种子检验规程中明确指出，当送验者对报检的种或品种已有说明，并且具有一个可供比较的、可靠的标准样品时，品种纯度的鉴定才是有效的。 种子的真实性和品种纯度是保证良种优良遗传特性得以充分发挥的前提，是正确评定种子等级的重要指标。种子纯度在农业生产和种子生产中具有重要的应用价值，在品种登记管理、品种产权保护、品种亲缘关系研究以及遗产多样性研究中都有很高的应用价值。 2 农作物种子纯度检验的理论依据 伴随着现代农业技术的不断发展，种子纯度鉴定技术由传统的形态标记鉴定逐步发展到集形态标记鉴定、生化标记鉴定和DNA分子标记鉴定为一体的综合鉴定技术体系。根据种子纯度检验的发展历史和植物性状的表现差异，将农作物种子纯度的检验分为2个阶段。第1个阶段为形态性状方面的差异（也可称为形态标记），如种子的形状、种皮色泽，幼苗芽鞘色泽，成株期株形、株高、开展度，叶片形状、叶色、花色、果形、果色、产量等，这些标记性状是基因在形态方面的表达，可以直接通过观察鉴定。第2个阶段分为2个部分，一是生物化学成分方面的差异（也可称为生化标记），如蛋白质、同工酶的差异，这些生化差异是不同基因表达的产物，通常不能直接通过观察鉴定，必须采用一定的技术加以分析鉴定；二是调控品种性状本身的遗传物质的差异（称为DNA分子标记），DNA分子标记鉴定方法同样需要一定的实验技术和仪器，因其准确度高被广泛认可。现在对种子纯度的鉴定往往是采用形态鉴定与生化或分子鉴定相结合的方法。 根据种子纯度检验法所依据的原理、检验对象的不同，还有其他多种检验方法。虽然鉴定品种纯度的方法很多，但在实际生产中能广泛应用的方法较少。我们现在主要的鉴定手段和方法多以我国标准和国际标准为依据，具有广泛的实用性和适用性。 3 农作物种子纯度检验技术研究进展 3.1 以形态标记为依据的检验技术 根据某一品种的种子、幼苗、成株具有区别于其他品种的形态特征来检验该品种种子的纯度。该方法应用最早、最广泛，并且目前仍是农作物种子纯度检验的主要方法，主要包括种子形态鉴定法、幼苗形态鉴定法和田间小区种植鉴定法。 种子形态鉴定法 是指检验人员用放大镜或是解剖镜等一些专用的检测工具，根据不同作物品种种子特定的外观形态特征进行鉴定。如鉴定玉米种子，其粒形有圆粒、扁粒、长粒之分；类型有马齿型、半马齿型、硬粒型之分；色泽有白、浅黄、橙黄、浅红、紫色之分等。种子形态鉴定法适宜种子形态特征变化类型丰富的作物如玉米、水稻、豆类等，该法简单、方便、直观、成本低。其缺点是：a.难以区分种子形态特征差异较小的作物品种，如十字花科的大部分蔬菜、茄果类蔬菜等；b.种子的有些形态特征易受到环境条件的影响，如种子大小、色泽与种子的成熟度有关，因而会影响鉴定结果的准确性； c.鉴定结果受鉴定人员的主观影响，鉴定者不同或水平不同均会影响结果的准确性。所以此方法检验的结果可靠性不够高、适用范围较狭窄。同时，目前新品种多由数量有限的优良亲本经杂交育成，其遗传变异性状日趋狭窄，导致品种之间的形态学差异越来越小，且形态学鉴定方法通常需要23个生长周期，使得从形态上鉴定种子的纯度差异变得越来越困难。 幼苗形态鉴定法 按要求取一定数量的种子，在温室或人工气候箱中培养成幼苗，当幼苗达到适宜评价的发育阶段时，根据幼苗具有的形态特征进行纯度检验。如根据水稻、小麦、玉米叶鞘的颜色（红、绿、紫），番茄、茄子胚轴的颜色，叶片颜色，叶片形状等特征区别品种。对于具有上述特征差异明显的作物品种鉴定的准确性较高，检验所需的设备简单、易于操作、成本较低。但对于遗传差异不大、形态特征相似的品种鉴定的准确性较差，并且不同品种对处理时期和处理程度较为敏感，其他缺点同种子形态鉴定法。 田间小区种植鉴定法 将样品在田间播种，对作物进行统一的栽培和管理，然后根据植株不同时期的表现特征进行鉴定，尤其是作物生长关键时期的性状，如玉米的抽穗期、花期与成熟期，各种性状已充分显现，因此鉴定结果相对比较准确、可靠。但是，一方面，受时间长、用地较多、成本高等因素的限制，该鉴定方法难以鉴定当年生产的种子的纯度，不利于种子的收购定级和调运；另一方面，受环境条件和栽培手段的影响，如遇上外界自然灾害，可能对鉴定结果产生不利影响。 3.2 以生化标记为依据的检验技术 主要是利用电泳技术对不同品种因基因水平的差异而引起的功能蛋白质种类、结构、数量的变化进行比较。生化标记鉴定法可分为同工酶电泳法和蛋白质电泳法。这种利用生化指标检测种子纯度的方法具有快捷、成本低、易于普及的特点，结果也比较客观，不易受鉴定者主观因素的影响。张承毅等利用蛋白质电泳法对大白菜种子样品进行分析，找到了晋菜3号、鲁白1号2个杂交组合的杂交互补带，并成功应用于大白菜种子纯度的检验。 我国已建立了一套比较完整的蛋白质电泳技术体系，并成功应用于水稻、玉米、大麦、小麦、棉花、烟草、豌豆、蒜、葱等农作物的品种鉴定中。其中，大麦和小麦品种的醇溶蛋白电泳、豌豆属和黑麦草属的聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）以及玉米属的醇溶蛋白超薄等电聚集（IEF）技术已列于国家种子规程之中。小麦醇溶蛋白电泳技术和玉米盐溶蛋白质电泳鉴定方法，已分别列于中华人民共和国农作物种子检验规章制度和中华人民共和国农业部行业标准。 尽管同工酶和蛋白质电泳法越来越多地在农作物种子纯度研究领域中得到应用，其优点已得到多方的赞同，但是其也有不足之处。例如某些遗传组成非常接近的品种，不易找到其父母本的特异蛋白，采用蛋白质电泳发难以发现特征带；若制种所用亲本不纯、含有多个姊妹系或自交系在繁殖过程中发生变异，其蛋白质谱带带型不同，导致无法对其杂交种电泳时表现出的多种带型进行判定。此外蛋白质变异位点有限，蛋白质多态性有较严格的组织与时间表达特异性，要求其蛋白产物易提取且易通过电泳来检测。同时蛋白质或同功酶极不稳定，受环境影响较大。正是上述问题导致了蛋白质与同功酶技术应用的局限性。 3.3 以DNA分子标记为依据的检验技术 在生物基因组中，DNA因存在倒位、易位、插入、缺失、转座或排列不一的重复序列的现象，而表现出多态性。DNA分子标记是指生物基因组DNA经限制性内切酶酶切、聚合酶链式反应扩增或两者结合等措施处理后电泳，以电泳谱带的形式表现DNA的多态性，这种多态性在本质上反映了生物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA片段。以DNA标记为依据的检验技术鉴定种子纯度就是以DNA分子的多态性即DNA碱基排列顺序的差异性为基础。自从20世纪70年代最早提出RFLP方法以来，在10多a间出现了许多DNA标记检测技术，概括起来可分为两类：一类是以Southern转移和分子杂交为基础的技术，如RFLP；另一类是以PCR为基础的技术，如RAPD、AFLP、SSR等。下面就几种主要技术作一介绍。 RFLP技术 是最早也是经典的DNA分子标记鉴定技术。它是根据不同基因组的限制性内切酶位点碱基突变、酶切位点之间发生了碱基的插入或缺失而导致酶切片段的大小发生变化，通过特定的探针与酶切片段杂交，检测不同位点的等位变异，从而比较不同品种在DNA水平上的差异，以此来鉴别真假种子。其技术流程主要包括基因组DNA的提取、DNA的酶切、电泳分离、Southern转移、探针标记（同位素或非同位素标记）、DNA分子杂交、多态性片段的检测等。Matsuura等利用RFLP克隆区分黄瓜亲本NBl、GFl及其F1代杂交种，发现利用RFLP分析可快速检测黄瓜杂交一代种子的纯度。 RFLP标记技术优点：a.无表型效应；b.呈典型的孟德尔式遗传；c.在非等位的RFLP标记之间不存在上位效应，互不干扰。缺点：a.DNA用量大；b.操作烦琐，技术复杂，工作量大；c.有放射性为害。RFLP标记技术在国内研究较少，近年来缺乏相关报道。 RAPD技术 1990年由Williams在PCR的基础上发明的一种最简单的DNA分子标记技术。技术核心是用人工合成的随机引物（10 bp）对基因组DNA进行PCR扩增，产生多态性DNA片段，经电泳分离和EB染色，获取DNA多态信息。其技术流程包括基因组DNA的提取、PCR扩增、标记的检测等。由于该技术成本相对比较低廉、操作简单、可选择的引物多、检测到的多态性位点较多、不受环境条件的影响，克服了形态学鉴定和生化标记检验法的不足，因此该技术一出现便被广泛应用于种 子纯度的检验。黄三文等筛选出12个较稳定的RAPD标记，可以用于中椒系列辣椒的9个杂交种的纯度鉴定；宋顺华等应用RAPD标记鉴定大白菜杂种商品种子的纯度，用50个随机引物检测了2个杂交种及其亲本，其中有3个引物能清楚地区分杂交种及其双亲；莫结胜等用RAPD标记检测杂交油葵A15种子纯度，引物OPD09、OPD12、OPK12不仅能鉴定出杂种及混杂的亲本种子，还能将与A15外型相近的大部分杂交种区别开来。 RAPD标记技术优点：a.可以对任何没有分子生物学基础信息的物种进行DNA多态性分析；b.与RFLP的作用类似，但其检测效率更高、样品用量更少、灵敏度更高等；c.以PCR为基础，但又比PCR方便。但RAPD技术也有其不足之处，一是对其稳定性一直有很多的争论，特别是不同实验室之间的重演性较差；二是RAPD标记为显性标记，杂交种与亲本之一的带型有可能完全相同，如用单一引物便不能从这一位点区分是杂交种还是亲本，因此必须选用能反映2个位点差异的引物进行扩增；三是对模板DNA的纯度要求高。从总体上讲，RAPD技术适合我国大多数检测单位，是比较理想的种子纯度鉴定方法，在我国农作物种子纯度检验中发挥着重要作用。 AFLP技术 1995年由Zabeau发明的一种检测DNA分子标记能力极强的技术。其原理是对基因组DNA酶切片段进行选择性扩增，经电泳分离和银染，获取DNA的多态信息。其主要操作流程为基因组DNA的提取、酶切、接头的连接、预扩增（PCR）、选择性扩增（）、电泳分离、银染检测等。该技术避免了RFLP和RAPD的缺点，同时结合了两者的优点，其分辨率高、重演性好、多态性丰富，从某种意义上说，AFLP技术的出现是DNA分子标记检测技术的重大突破。田雷等对AFLP标记技术在大白菜种子真实性及品种纯度鉴定中的应用效果进行了探讨，利用某引物组合扩增出的DNA图谱可以将供试的5个杂交种及其8个亲本全部区分开，从而可用此引物组合来鉴定杂交种和进行亲本纯度的鉴定；田雷等还利用AFLP方法对5个甘蓝杂交组合及其10个亲本共15个材料进行了分析研究，从32个引物组合中筛选出1个引物组合，能够对5个供试甘蓝杂交种的真实性及品种纯度进行鉴定，从而证明了AFLP技术在甘蓝种子真实性及品种纯度鉴定中的可行性。 AFLP标记技术优点：a.标记异常丰富，典型的AFLP反应中，1次可检测100150个扩增产物； b.稳定性、重复性、共显性表达，不受环境影响，无复等位效应；c.多态性很少、待测样品也较少的情况下（如近等基因系和BSA分析）用AFLP标记能达满意的结果；d.带纹丰富，灵敏度高，快速高效。但是，AFLP标记也有缺点：a.其是一种专利技术，受专利权保护；b.实验操作难度大，基因组的不完全酶切会影响实验结果，所以实验对DNA纯度和内切酶的质量要求较高，需同位素或非同位素标记引物，昂贵费时，一般实验室难以完成。因此在短时间内很难推广应用在种子的纯度检验上。从长远看，AFLP是一种很有希望的种子纯度检验技术。 SSR技术 在动植物基因组中分布着许多110 bp的简单重复序列（SSR），由于不同种或品种间重复单位的数目及重复单位序列的差异使基因组DNA产生大量的多态性。其技术流程包括基因组DNA的提取、PCR扩增、电泳分离、多态性检测等。该技术比RFLP检测到的多态性要多得多，并且减少了酶切、探针制备和DNA分子杂交等繁琐程序，也是一种较为理想的DNA标记技术。到目前为止，SSR技术已在许多作物品种鉴定和纯度检测上得到应用。刘勤红等筛选了217对异源四倍体棉花的SSR引物，获得了十几个足以区分鲁棉研15号父母本及其F1代的显性标记位点，为鲁棉研15号杂交种的纯度鉴定提供了一个准确、稳定和快捷、实用的方法；苏顺宗等筛选出一批在常规水稻亲本上具有较高多态性的SSR引物，并与田间纯度鉴定结果进行研究比较，结果表明，SSR鉴定的平均纯度与田间鉴定结果无显著性差异，SSR可以用于杂交水稻种子纯度的鉴定；李晓结合单籽粒DNA快速提取方法，快捷、准确地鉴定了玉米杂交种蜀杂6号的种子纯度；王风格等从DNA提取、PCR扩增、电泳检测等环节对SSR技术进行了优化，最终建立了一套完善的适用于玉米品种鉴定的SSR标准体系。 SSR技术优点：a.数量丰富，覆盖整个染色体组；b.具有多等位基因特性，信息含量高；c.以孟德尔方式遗传，呈共显性；d.易于利用PCR技术分析，对DNA数量及纯度要求不高，结果重复性好；e.每个位点由引物序列顺序决定，便于交换。SSR技术最大的缺点是必须对重复序列两端的保守序列进行寻找和分析，从而设计出同两端保守序列互补的引物，这限制了该技术在大多数检验机构中的普及应用。但一旦开发出一套某种生物的微卫星标记，其他的研究工作者将受益无穷。 4 总结及展望 形态标记鉴定法作为经典传统的鉴定方法，现阶段仍是国内应用最广泛和最方便的种子纯度鉴定方法，随着科学的不断发展，这种传统方法自身也在不断完善和改进，但是受人为因素限制和外在环境影响，形态鉴定法发展的空间有限，在未来只能通过不断地修订和改进，获得有限的进步。生化标记鉴定法和DNA分子标记鉴定法作为较为领先的种子纯度鉴定技术，拥有更加广阔的发展空间，是更加准确的鉴定方法。但是受现阶段科学技术和实验水平的限制，生化标记鉴定和DNA分子标记鉴定仍未能被广泛利用在实践生产中，在不久的将来，其有可能替代传统的鉴定方法，并且更广泛地应用到实际生产中。 综上，每一种方法都有其自身的优缺点，至今还没有一种鉴定方法能够比较全面、准确、快速、经济地进行种子纯度检验。所以，现阶段的种子纯度鉴定仍然是以形态标记、生化标记和DNA分子标记结合进行综合的鉴定。 参考文献 王玺，张宝石.玉米种子纯度鉴定技术研究进展J.种子，2002（1）：43-45. 成雪峰，张凤云.种子检验技术的现状与展望J.种子，2009， 28（8）：58-61. 高荣岐，张春庆.种子生物学M.北京：中国农业出版社，2008：153-175. 马学礼，辛学敏大田种子纯度检验技术分析J黑龙江科技信息，2010（20）：213. 兰海燕，李立会蛋白质凝胶电泳技术在作物品种鉴定中的应用J中国农业科学，2002，35（8）：916-920. 张承毅，吴承来，张春庆蛋白质电泳法鉴定大白菜种子纯度J山东农业科学，2007（3）：108-110. 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