课件：抗生素类药物的分析.ppt

抗生素药物的分析,一 概述 抗生素定义 某些微生物的代谢产物或合成的类似物 -在小剂量的情况下能抑制微生物的生长和存活 -对宿主不会产生严重的毒性 应用 抑制病原菌的生长-用于治疗细菌感染性疾病 具有抗肿瘤活性-用于肿瘤的化学治疗 免疫抑制和刺激植物生长作用 抗生素不仅用于医疗，而且还应用于农业、畜牧和食品工业方面,细菌感染疾病治疗中常用的抗生素: -内酰胺抗生素（青霉素、头孢霉素） 四环素类（四环素、土霉素、金霉素）及氯霉素类抗生素（氯霉素、甲砜霉素） 大环内酯类抗生素等（红霉素、阿奇霉素） 氨基糖甙类抗生素（链霉素、庆大霉素）,-内酰胺抗生素 -Lactam Antibiotics 结构 -内酰胺环：四原子内酰胺环的抗生素, -内酰胺抗生素的分类 青霉素（西林）类（Penicillins） 头孢菌素类（Cephalosporins）, 结构特征,位酰氨基并合杂环 内酰胺环 2位羧基,back, 青霉素 Benzylpenicillin（苄青霉素，青霉素G （Penicillin G），盘尼西林） 结构和化学名,（2S,R,6R）-3,3-二甲基-6-（2-苯 乙酰氨基）-7-氧代-4-硫杂-1-氮杂双环3.2.0庚烷-2-甲酸,青霉素G,注射用青霉素是青霉素G（benzylpenicillin）的钠盐，不能口服，因为胃中强酸会导致酰胺侧链水解和-内酰胺环开环而失去活性。 青霉素G钠外观：白色结晶性粉末；无臭或微有特异性臭；有吸湿性；遇酸碱或氧化剂等即迅速失效。 溶解性：在水中极易溶解，在乙醇中溶解，在脂肪油或液体石蜡中不溶。,药物的性质 酸性：有机酸（pKa2.652.70） 旋光性：青霉素家族分子都有三个手性碳原子，头孢家族有两个 紫外吸收特性：头孢家族有共轭的母环，青霉素家族一般有苯环取代基 -内酰胺环不稳定：四元内酰胺环，张力比较大,鉴别试验,呈色反应： 与羟胺作用生成羟肟酸，与铁离子呈色。 类似于肽键反应，双缩脲反应和茚三酮反应 钾钠离子的焰色反应 普鲁卡因青霉素有芳伯氨基，可以发生重氮化-偶合反应，生成红色染料沉淀。 光谱法：包括红外吸收光谱（IR)和紫外吸收光谱(UV) 色谱法:与对照品的高效液相色谱（HPLC)和薄层色谱(TLC)的保留时间和比移值一致,特殊杂质的检查,内源性过敏原：可能来自于生产、贮存和使用过程中-内酰胺环开环自身聚合，生成的高分子聚合物（青霉素过敏的原因）。 外源性过敏原：主要来自-内酰胺抗生素在生物合成时带入的残留量的蛋白质多肽类杂质。 有关物质和异构物：使用液相色谱，以样品加流动相稀释后作对照品检查。,含量测定,碘量法：采用剩余碘量法测定，以标准对照法计算含量。 电位配位滴定法：青霉素碱水解产物可以与二价金属离子形成配合物，故采用碱水解后用硝酸汞进行滴定。 紫外可见分光光度法：青霉烯酸在320nm360nm有强吸收，外标法测吸光度。 高效液相色谱法：发展最快的分析方法，使用反相的HPLC法，以外标法作标准曲线计算含量。,氯霉素Chloramphenicol,【外观】氯霉素为白色或者微带黄绿色的针状，长片状结晶或结晶性粉末，味苦，熔点149 152 比旋度+18.5+21.5，性质稳定，能耐热，水溶液在中性、弱酸性条件下比较稳定，强碱强酸下水解。,D-苏型-（-）-N-羟基-对硝基苯乙基-2,2-二氯乙酰胺,氯霉素Chloramphenicol,【鉴别】显色反应 吸取供试品溶液、对照品溶液、空白溶液各1ml，加1%氯化钙溶液3ml与锌粉50mg，置水浴上加热10min，倾取上清液，加苯甲酰氯约0.1ml，立即强力振摇1min，加三氯化铁试液0.5ml与氯仿2ml,振摇。供试品溶液和对照品溶液水层均显紫红色，空白溶液水层未显紫红色。,氯霉素的杂质检查,相关物质（氯霉素二醇物，对硝基苯乙酮）的检查 残留溶剂（甲醛、乙醇）的检查,氯霉素Chloramphenicol,【检查】 有关物质（氯霉素二醇物，对硝基苯乙酮）用流动相定量稀释，作为供试品溶液；另取氯霉素二醇物对照品与对硝基苯乙酮对照品适量，用流动相溶解稀释成每1ml中含氯霉素二醇物5g与对硝基苯乙酮5g的混合溶液，作为杂质对照品溶液分别注入液相色谱仪，记录色谱图。按外标法以峰面积计算，含氯霉素二醇物不得过1.0%，含对硝基苯乙酮不得过0.5%。,氯霉素 Chloramphenicol,【检查】 残留溶剂 （甲醛、乙醇） 高效液相色谱：加二甲亚砜溶解并稀释至刻度，作为供试品溶液；另精密取甲醛、乙醇，加二甲亚砜溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。照残留溶剂测定法测定，使用紫外检测器，按外标法计算，含甲醛、乙醇应符合规定。 毛细管色谱：柱温40-100，常以氮气为载气，采用火焰离子化检测器。,氯霉素 Chloramphenicol,【含量测定】 高效液相色谱法测定 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂； 以水-甲醇（68：32）为流动相； 检测波长为277nm； 用流动相定量溶解稀释制成每1ml中约含0.1mg的溶液，精密量取10l注入液相色谱仪，纪录色谱图；另精密称取纯氯霉素对照品适量，同法测定。按外标法以峰面积计算供试品中C11H12Cl2N2O5的含量。 还可以采用毛细管电泳和质谱联用(CE-MS)：氯霉素有两个氯原子，在质谱上具有较强的负离子响应。,四环类抗生素,【定义】由放线菌产生的一类广谱抗生素包括金霉素、土霉素、四环素等 盐酸四环素Tetracycline Hydrochlorid 【性状】 本品为黄色结晶性粉末；无臭，味苦；略有引湿性；遇光色渐变深，在酸性条件下不稳定，碱性溶液中易破坏失效，可以与金属离子形成不溶的螯合物。,盐酸四环素 Tetracycline Hydrochlorid,抗菌谱:四环素为广谱抗生素，用于G+和G-引起的感染 抗菌机理：作用于30S亚基，抑制蛋白质的合成 不良反应：消化道刺激，牙齿骨骼钙黄沉积 结构特点：含有并四苯的基本结构,盐酸四环素 Tetracycline Hydrochlorid,【鉴别】 用薄层层析快速鉴别四环类抗生素 pH为8.3的5%的EDTA-2Na溶液调制硅藻土G板为薄层固定相，以0.02mol/L的氢氧化钠的丙酮溶液为展开剂，将样品和对照品一起展开，通过计算比移值鉴别。 与钙镁离子形成沉淀； 与铁离子形成红色络合物； 与铝离子形成黄色络合物。,盐酸四环素 Tetracycline Hydrochlorid,【检查】 有关物质（土霉素0.5%、4-差向四环素3.0% 、盐酸金霉素1.0% 、脱水四环素0.5%和差向脱水四环素0.5% ） 液相色谱法 用0.01mol/L盐酸溶液溶解并定量稀释制成每1ml中约含0.5mg的溶液（临用现配）,作为供试品溶液；精密量取2ml，置100ml量瓶中，用0.01mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。照含量测定项下的色谱条件，取对照溶液10l注入液相色谱仪，按峰面积计算。,四环素,无菌检查 经薄膜过滤法处理后，用0.1%无菌蛋白胨水溶液冲洗，并配制成每1ml中含供试品30mg的供试品溶液，以大肠埃希菌作为阳性对照菌，培养两周，菌落数目应符合规定。,盐酸四环素 Tetracycline Hydrochlorid,【含量测定】 高效液相色谱法 用十八烷基硅烷键合硅胶为固定相 用醋酸-乙腈（83:17）为流动相； 紫外光度检测器，检测波长为280nm。 取本品约25mg，精密称定，置50ml量瓶中，用0.01mol/L盐酸溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置25ml量瓶中，加0.01mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，精密量取10l注入液相色谱仪，记录色谱图；另取盐酸四环素对照品适量，同法测定。按外标法以峰面积计算出供试品中 C22H24N2O8HCl的含量。,大环内酯类抗生素 Macrolide Antibiotics 一 概述 简介 由链霉菌产生的弱碱性抗生素（红霉素、阿奇霉素）。 抗菌特点：对G+和某些G-、支原体作用强 结构特征 内酯结构的十四元或十六元大环 通过内酯环上的羟基和去氧氨基糖或6-去氧糖缩合成碱性甙,红霉素 Erythromycin 一、结构和性质 来源红色链丝菌产生，包括A、B和C，三者的区别如下, 组分 通常 指Erythromycin A 杂质 组分B和C -C的活性较弱，只为A的1/5，而毒性则为5倍， -B 活性低，毒性大, 性状 白色或类白色的结晶或粉末；无臭，味苦，微有引湿性 本品的水合物熔点为128，而无水物为193；易溶于甲醇、乙醇或丙酮，微溶于水； 比旋度-7178（20mg/ml,无水乙醇）, 结构特点 碱性甙 红霉内酯去氧氨基糖 红霉糖 红霉内酯环 14原子大环 无双键 偶数碳上有六个甲基 9位羰基,二、【鉴定】沉淀反应 取本品10mg，加硝酸0.5ml使溶解，加水0.5ml，火焰加热（灼烧）2分钟，放冷，滴加硝酸银试液，即生成白色凝乳状沉淀。,三、【杂质检查】-液相色谱 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂； 以磷酸盐溶液-乙腈（40：60）为流动相； 波长为215nm。 按红霉素C、红霉素A、红霉素B的顺序出峰。 另取红霉素标准品适量，130加热破坏4小时，液相色谱分析。 记录色谱图至红霉素A保留时间的5倍。按红霉素C、红霉素A、杂质1、红霉素B、红霉素烯醇醚峰的顺序出峰。杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积（5.0%）。,四、含量测定液相色谱 分别加甲醇溶解，用磷酸盐缓冲盐（pH7.0）-甲醇（151）定量稀释制成溶液，分别作为供试品溶液和标准品溶液；精密量取供试品溶液与标准品溶液各20ul，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算供试品中红霉素A的含量。药典规定：按无水物计算，不得少于88.0%。,氨基糖苷类抗生素,一、概述 二、化学结构 三、理化性质 四、鉴别试验 五、杂质检查 六、含量测定,一、概述,代表药物： 链霉素、卡那霉素、庆大霉素、巴龙霉素、硫酸奈替米星等 制备方法： 微生物发酵或半合成 抗菌谱 ：G-菌和结核杆菌感染的首选药 抗菌机理： 抑制蛋白质的合成 不良反应： 耳毒性、可透过胎盘屏障 结构特点 ：氨基醇-氧桥-氨基糖氨基糖苷,二、化学结构,链霉素,庆大霉素,三、理化性质,溶解性与碱性： 碱性、水溶性抗生素 旋光性： 含有多个氨基糖具有旋光性 紫外吸收光谱： 链霉素在230nm有吸收,其它均无. 苷的水解与稳定性： 含有二糖胺结构的抗生素过酸或过碱条件下易水解失效。,四、鉴别试验,方法：茚三酮反应、Molish试验、N-甲基葡萄糖氨反应、麦 芽酚反应、坂口反应、硫酸盐反应、色谱法、光谱法等 【实例】硫酸核糖霉素-薄层色谱 取硫酸核糖霉素与其标准品适量，分别加水制成每1ml含核糖霉素10mg的溶液，取上述两种溶液等量混合，作为混合溶液吸取上述两种溶液各2l, 分别点于同一G薄层板上，用展开剂展开，晾干，喷以0.2%茚三酮水饱和正丁醇溶液，110。C加热10分钟。混合溶液所显示斑点应为单一斑点，供试品所显示斑点的应与对照品溶液或混合溶液主斑点的颜色和位置相同,五、杂质检查,1、无菌检查（硫酸链霉素） 取本品与0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml中含供试品2万单位的供试液，经薄膜过滤法处理，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲溶液分次冲洗，（每膜不少800ml），以金黄色葡萄球菌为阳性对照菌按药典附录的无菌检查法操作。另取装量10ml的0.5%葡萄糖肉汤培养基6管，分别加入每1ml中含2万单位的溶液0.250.5ml，3管在3035培养，另3管在2025培养，应符合规定。 2、硫酸盐检查 容量法 色谱法 3、有关物质检查 来源：菌种代谢产物或半合成时的中间体 方法：色谱法 薄层色谱（主要）,六、含量测定,1、微生物检定法 优点：成本低、适于推广使用 缺点：影响因素复杂、操作费时，且测定的是总效价，不能分别测定主成分和相关组分或有关物质的含量。 2、免疫法（体内药物监测） 3、色谱法 薄层色谱、气相色谱、高效液相色谱法 4、光谱法 5、高效毛细管电泳法-质谱法 其它：、核磁共振法、旋光法、量热法等,微生物法,概念:通过检测抗生素对微生物的抑制作用，来计算抗生素活性的方法 分类：管碟法和浊度法 管碟法：利用抗生素在琼脂培养基的扩散作用，比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小来测定供试品效价 浊度法：利用抗生素在液体培养基中对试验菌生长的抑制作用，通过测定培养后细菌浊度值的大小比较标准品与供试品对细菌生长的抑制程度以测定供试品效价 操作：中国药典,衍生化法：利用氨基糖苷类抗生素结构中的活泼基团（氨基、羰基）与衍生化试剂形成紫外光区有吸收或有荧光的物质，以便于紫外检测或荧光检测。 柱前衍生反相HPLC 非衍生化法：HPLC-ELSD（蒸发光散射检测法） 【实例】： HPLC-ELSD法测定核糖霉素的含量 实验条件：色谱柱：Agela Technologies Venusil ASB-C1815nm(250mm 4.6mm, 5m)； 流动相：0.11mol/L七氟丁酸酐混合溶液；流速：0.8mL/min； 采用蒸发光散射检测器漂移管温度：110，雾化气体流速：3.0L/min。测定方法：精密取核糖霉素对照品，分别加水溶解并定量稀释制成约含核糖霉素0.13、0.17和0.20mg/mL的溶液，作为对照品溶液(1)、(2)和(3)。精密量取上述3种溶液各20L，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。以对照品溶液浓度的对数值与相应峰面积的对数值计算回归方程。另取本品适量，精密称定，用水溶解并定量稀释制成约含核糖霉素0.17mg/mL溶液，同法测定，用回归方程计算供试品中核糖霉素含量。,高效毛细管电泳法（HPCE）,（1） 由于毛细管直径小，使光路太短，用一些检测方法（如紫外吸收光谱法）时，灵敏度较低； （2） 电渗会因样品组成而变化，进而影响分离重现性。 质谱法 （MS ） （1）由于氨基糖苷类抗生素在结构中含有多个伯胺或仲 胺基团显弱碱性 ,