课件：第章致癌作用.ppt

外源化学物致癌作用 chemical carcinogenesis,教学要求,掌握内容,基本概念 致癌作用机制,了解内容,熟悉内容,化学物按致癌模式分类 致癌作用评价方法,有关化学致癌的分子事件,教学内容,第一节,化学致癌过程,第二节,第四节,第五节,第三节,化学致癌机制,有关化学致癌的分子事件,化学致癌物的分类,化学致癌物筛查的基本方法,第六节,概述,肿瘤（tumor）？ 有分裂潜能的细胞受致癌因素作用后发生恶性转化和 克隆性增生所形成的新生物,永生性 迁移性 失去接触抑制,化学因素 物理因素 生物因素,烟草 30% 环境污染 2% 酒精 3% 工业产品 1% 饮食 35% 职业暴露 4% 食品添加剂 1% 地球物理因素 3% 生殖和性行为 7% 感染 10% 药品和医学处置 1%,归因于环境因素的癌症死亡百分比,对化学致癌作用的认识 1775年英国Pott扫烟囱工人阴囊癌 1895年德国Rehn 染料工业工人 膀胱癌 1915年日本山脊和市川 煤焦油诱发皮肤癌 1922年英国Kennaway 煤焦油分理 出多环芳烃 并诱发动物皮肤癌 1945年英国Case -萘胺及联苯胺 职业性膀胱癌,Pott发现煤焦油诱发阴囊癌 1775年英国外科医生Pott注意到一些清扫烟囱的工人常患阴囊癌。这些工人整天在烟囱里爬上爬下，脏头污脸，经常裸体工作，极少洗澡，浑身上下特别是腹股沟部位积满油烟烟垢，他们的工作服常年都是一套，难得有换洗的机会，尤其是靠近阴囊部位的工作裤上所存积的煤烟最多。Pott调查后认为阴囊与这些煤烟长期接触，久而久之导致了阴囊癌的发生，因此推测煤烟中存在某些化学物诱导了阴囊癌的发生，于是开始了致癌物的探索，这是历史上化学致癌研究的开端,对化学致癌作用的认识 1775年英国Pott扫烟囱工人阴囊癌 1895年德国Rehn 染料工业工人 膀胱癌 1915年日本山脊和市川 煤焦油诱发皮肤癌 1922年英国Kennaway 煤焦油分理 出多环芳烃 并诱发动物皮肤癌 1945年英国Case -萘胺及联苯胺 职业性膀胱癌,化学致癌作用（chemical carcinogenesis） 化学物质引起或诱导正常细胞发生恶性转化并发展成为肿瘤的过程。 化学致癌物（chemical carcinogen） 能引起肿瘤、增加其发病率或死亡率的化合物。黄曲霉毒素、苯并（a）芘,癌,上皮的恶性变癌,间质的恶性变肉瘤,良性肿瘤,第二节 化学致癌过程 Process of chemical carcinogenesis,化学致癌作用多因素、多基因参与的多阶段过程,细胞癌变的多阶段学说,化学致癌过程,引发阶段 细胞在各种致癌因素作用下，发生基因突变或表观遗传变异，导致异常增生的单克隆癌细胞的生成，从而引发致癌过程,引发细胞initiated cell,化学致癌物不可逆地将正常细胞转变为肿瘤细胞的起始阶段,化学致癌过程,引发阶段的形态学与生物学特征： 活细胞的不可逆性，因细胞的程序性死亡或凋亡可导致引发细胞的死亡 形态学上难以辨认引发“干细胞” 需要通过细胞分裂使其突变过程加以“固定” 剂量反应显示没有可测定的阈值 引发细胞对外源因素敏感 引发细胞的效能依赖于促长期肿瘤的损伤程度,引发剂（initiator）：具有引发作用的化学物,有致癌性 多数是致突变物 没有可检测的阈剂量,化学致癌过程,促长阶段 单克隆的癌细胞在一种或多种促癌物质的不断地作用下，表型发生了改变，恶性肿瘤细胞的各种性状得以表达的过程,引发细胞增殖成为癌前病变或良性肿瘤的过程,化学致癌过程,促长剂（promotor）：通过刺激细胞增生使引发细胞发展 进入促长阶段的化学物,无致癌性 非致突变物 有阈剂量,促长阶段特点 引发剂作用之后，促长剂长期、慢性作用 引发剂单独作用一般不会引起肿瘤 只有促长剂的慢性作用不会引起肿瘤 引发剂与促长剂的作用有先后次序 促长早期可逆,晚期不可逆，因此促长阶段（特别是在早期）持续给以促长剂是必需的,化学致癌过程,引发和促长的关系 【实例】小鼠皮肤致癌试验结果发现： （1）单给予小剂量苯并（a）芘没有肿瘤发生 （2）先给予小剂量苯并（a）芘后，每周两次再辅以巴豆油， 结果产生了肿瘤，且肿瘤出现明显加快 （3）单纯用苯并（a）芘诱发肿瘤所需浓度比用苯并（a）芘 再辅以巴豆油时的浓度大1000倍 （4）先给予巴豆油后再给予苯并（a）芘结果无肿瘤发生 （5）单给予巴豆油结果没有产生肿瘤,化学致癌过程,引发和促长作用关系*,一次引发剂后持续给予促长剂可诱发肿瘤,足量引发剂可诱发肿瘤,一次单用引发剂不诱发肿瘤,促长剂本身不诱发肿瘤,促长剂多次重复使用才诱发肿瘤,引发作用不可逆,促长剂仅在引发剂后才发挥作用,化学致癌过程,引发和促长作用的关系* （1）引发剂作用后，促长剂的慢性作用将引起肿瘤 （2）引发剂单独作用一般不会引起肿瘤，即仅有引发剂是不够的 （3）只有促长剂的慢性作用而没有引发剂的作用也不会引起肿瘤 （4）引发剂与促长剂作用先后次序十分重要，引发必须发生在促长之前 （5）引发产生的作用是不可逆的，促长在早期阶段是可逆的,化学致癌过程,进展阶段（progression） 由良性肿瘤转变为恶性肿瘤，并进一步演变成更具恶性表型或具有侵袭特征的肿瘤的过程，主要表现是细胞自主性和异质性的增加、生长加速、侵袭性加强、出现浸润和转移的恶性生物学特征。,遗传不稳定性和恶性转化 有可测定的和（或）形态学可描述的细胞基因组改变 不可逆性,化学致癌过程,进展剂（progressor） 使细胞由促长阶段进入进展阶段的化学物 完全致癌物（complete carcinogen） 兼有引发、促长和进展作用的化学致癌物,化学致癌过程,多阶段致癌的形态学和生物学特征,多阶段致癌理论图解,化学致癌过程,与致癌作用有关的代谢,化学致癌作用的代谢活化过程,代谢解毒,化学致癌过程,前致癌物（precarcinogens） 本身并不直接致癌，必须在体内经代谢转化，其所形成的代谢产物才具有致癌作用 近致癌物（proximate carcinogens） 前致癌物经代谢活化过程形成的一种或一系列中间代谢产物 终致癌物（ultimate carcinogens） 不需代谢活化的直接致癌物和间接致癌物经代谢活化所形成的具有致癌作用的代谢物的统称,终致癌物通常是带正电荷的亲电子物质，化学性质非常活跃，容易和DNA、RNA和蛋白质等生物大分子共价结合并导致遗传损伤,化学致癌过程,化学致癌作用个体遗传易感性 个体遗传易感性由特定基因的遗传多态性决定 对肿瘤遗传易感性的研究主要集中在代谢酶基因多态性与致癌物的代谢活化和人群肿瘤发生的关系，以及DNA修复酶基因多态性与DNA修复功能和基因组稳定性的关系,第三节 化学致癌机制 Mechanisms of chemical carcinogenesis,体细胞突变学说 癌基因学说 癌变多阶段学说 非突变致癌学说,化学致癌机制,化学致癌机制,一、体细胞突变学说 建立的理论基础 致癌物活化代谢后生成DNA加合物诱导基因突变 大多数致癌物在致突变试验中呈阳性 DNA修复缺陷可导致肿瘤的发生 许多肿瘤组织中存在染色体畸变或基因组不稳定性 肿瘤细胞来源于单细胞克隆 癌基因突变及抑癌基因突变或缺失在肿瘤细胞中普遍存在，且突变的基因型可以通过细胞分裂传递给子代细胞,化学致癌机制,体细胞突变学说,DNA加合物 癌基因、原癌基因激活及抑癌基因失活 DNA错误修复,（一）DNA加合物,许多化学致癌物进入体内经代谢活化形成带电荷的亲核或亲电子物质，与生物大分子如DNA、RNA、蛋白质等共价或非共价结合，其中与DNA碱基共价结合形成DNA加合物造成DNA损伤（基因突变、缺失、插入、交联、DNA链断裂等） 部分细胞恶性转化肿瘤 DNA加合物在化学致癌过程中起到关键作用，是体细胞突变机制的分子基础 Aflatoxin B1-DNA adduct、PAH-DNA adduct等可作为接触/效应生物标志，在肿瘤防治、人群生物监测、危险度评定、风险评估中具有重要应用价值。,碱基突变 缺失 插入 交联 DNA链断裂,化学致癌机制,致癌物,终致癌物,近致癌物,体内代谢,无致癌性产物,DNA加合物,与细胞内 DNA作用,间接作用,直 接 作 用,代谢活化,代谢解毒,代谢活化,代谢解毒,DNA加合物形成示意图,癌基因（oncogene）一类在自然或实验条件下具有诱发恶性转化的潜在基因 以原癌基因形式普遍存在于正常细胞基因组中 癌基因是化学致癌物作用的主要靶分子 癌基因实质是一类被激活的基因，所指导合成的蛋白质能促成细胞恶性表型的形成 生长因子癌基因（如sis，KS/hst），生长因子受体癌基因（如erbB, kit),细胞内酪氨酸激酶癌基因（如src，abl），信号转导分子癌基因（如ras，gsp/gip）,丝氨酸/苏氨酸激酶癌基因（如raf,mos）及转录因子癌基因（如myc,fos,jun）。,（二）癌基因、原癌基因激活及抑癌基因失活,化学致癌机制,原癌基因（pro-oncogene） 机体内正常细胞所具有的能致癌的遗传信息 正常情况下呈静止状态 当发生突变、缺失、病毒整合、染色体易位时，原癌基因失去正常的调控细胞生长和分化功能，使细胞发生恶性转化 发生恶性转化的原癌基因即是癌基因,化学致癌机制,抑癌基因（anti-oncogene） 细胞内一类能对抗肿瘤作用的基因，在控制细胞生长、增殖等过程起负调控作用 是正常细胞分裂生长的负性调节因子，其编码的蛋白质能够降低或抑制细胞分裂活性 正常时可抑制肿瘤细胞的肿瘤性状表达 在细胞癌变或恶变过程中发生失活或纯合缺失，使其自身不能表达或其产物失活化，允许肿瘤性状的表达 NF1、P53、P16,化学致癌机制,化学致癌机制,P53基因 野生型P53：肿瘤抑制基因，p53蛋白参与细胞周期G1/S交界处检查点的检查机制，负责检查基因组的完整性。如DNA有损伤，P53使细胞阻滞于G1期，以使其修复，如修复失败，则启动细胞发生凋亡 突变型P53：癌基因，促进细胞恶性转化，抑制细胞凋亡，在多种肿瘤中高表达,P53,（三）DNA修复与化学致癌,DNA修复,正确修复,错误修复,受损的DNA完全恢复 原有的结构和功能,DNA在结构和功能上仍有 缺陷，但能继续复制并伴有 较高的突变频率,化学致癌机制,非突变致癌学说 建立的理论基础 肿瘤形成与细胞分化和增生有关 肿瘤癌性状态有时候是可逆的 致癌作用可由非诱变剂引起 并非所有致癌物都是致突变物 致癌作用与DNA甲基化改变有关 体外细胞转化频率很高,化学致癌机制,非突变致癌学说,表观遗传变异 细胞异常增生 免疫抑制 内分泌激素失衡 过氧化物酶增殖剂激活受体,化学致癌机制,表观遗传变异 表观遗传学:即外遗传学，是研究机体发育和细胞增殖中的遗传的改变，但不改变DNA序列，受环境因素的影响。 表观遗传修饰：DNA甲基化、组蛋白修饰化、染色质重塑、非编码RNA等，能动地调控着具有组织和细胞特异性的基因表达模式。 肿瘤细胞的表观遗传变异共同特征：全基因组低甲基化、某些抑癌基因和DNA修复基因的高甲基化,例：DNA烷基转移酶O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（MGMT）基因启动子区甲基化所导致的基因沉默出现在40%神经胶质瘤和结肠癌中，25%非小细胞肉瘤、淋巴瘤中。采用转基因方法使MGMT基因在小鼠乳腺和胸腺中过表达，可使这些腺体具有很强的拮抗N-甲基-N-亚基脲的诱癌作用，推断MGMT基因功能与DNA正常修复和降低基因突变频率关系密切,化学致癌机制,DNA甲基化是指在DNA甲基化转移酶的作用下，在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶5碳位共价键结合一个甲基基团,CpG岛,肿瘤抑制基因 DNA修复基因 转移抑制基因,原癌基因 活化,高甲基化,失活,低甲基化,C:G至T:A转换突变的热点,化学致癌机制,细胞异常增生,良性增生,恶性增生,有明显的刺激因素 增生限于一定程度和一定时间 刺激因素消除，增生则停止,细胞不受任何约束和控制，呈无 规律的迅速生长，以至破坏正常 组织器官结构并影响其功能,质变,化学致癌机制,免疫抑制 肿瘤发生与机体免疫状态密切相关。 外源化学物通过抑制免疫功能促进肿瘤发生。 肿瘤细胞破坏宿主的免疫功能，使肿瘤细胞免受宿主的攻击，使肿瘤细胞继续生长、扩散，并发生转移，产生免疫“逃避” 。,化学致癌机制,内分泌激素失衡 长期使用激素可导致肿瘤发生 一些激素类药物在治疗过程中也会导致内分泌系统失衡而诱发肿瘤 环境内分泌干扰物能诱发人类某些肿瘤，但其致癌机制目前尚未明确,雌激素和孕酮能诱导大小鼠发生垂体和乳腺肿瘤,孕妇服用乙烯雌酚导致男性后代睾丸癌发生率上升,多氯联苯、DDT、二噁英乳腺癌、睾丸癌、前列腺癌,化学致癌机制,过氧化酶体增殖剂激活受体（PPAR-） 过氧化酶体：单层膜的亚细胞器，清除ROS和H2O2，参与甘油酯和胆固醇的生物合成和降解 过氧化酶体增殖剂：具有刺激肝脏过氧化物酶体增生作用的化学物，与PPAR-结合刺激过氧化酶体增殖,过氧化酶体增殖剂,肿瘤,氧化应激,损伤DNA,第四节 有关化学致癌的分子事件,自 学 端粒调控与细胞永生化 细胞周期调控紊乱 细胞凋亡与肿瘤发生,（一）端粒调控与细胞永生化,细胞染色体端粒（Telomere）随着细胞分裂而逐渐地缩短，这些细胞最终都进入以细胞死亡为特征的危机阶段M2期，如果在这个危机点细胞的端粒酶（Telomerase）被激活，细胞就获得了不断增值分裂的能力成为永生化细胞（Immortalized cells）。 细胞永生化过程是细胞恶性转化的必经阶段，因为多有的肿瘤细胞都具有无限分裂的特征。,（二）细胞周期调控紊乱,细胞周期调控的核心成员是细胞周期素（cyclin）、周期素依赖性蛋白激酶（cyclin dependent kinases，CDKs）和CDK的抑制性蛋白（CDK inhibitor，CKDI）. 上述几种不同分子与其他相关调控蛋白精确调控细胞周期每一个关卡（check point）。这些关卡中重要的是G1-S转换和G2-M转换关卡，前者是肿瘤形成最为关键的控制点。,细胞增生过程由细胞周期（cell cycle）来完成，细胞由一次分裂结束到下一次分裂结束，都要经历相同的变化阶段（G1 S G2 M）周而复始地进行。,（三）细胞凋亡与肿瘤的发生,细胞坏死实在种种不利因素影响下，由于细胞正常代谢活动受损或中断引起的细胞死亡。 细胞凋亡是细胞在一定的生理或病例条件下，受内在遗传机制的控制自动结束生命的过程。是机体为了清除多余的、有害的、已经完成使命的细胞，维持机体的稳态所启动的系统。 细胞凋亡调控异常与肿瘤发生密切相关。促癌剂TCDD、苯巴比妥能特异性抑制癌前细胞凋亡，三氧化二砷（砒霜）成功治疗急性早幼粒细胞白血病的重要机制之一，就是诱导细胞凋亡。 促进细胞凋亡的基因：p53,Rb,p16,WT1,Bax等；抑制细胞凋亡的基因：c-Myc,Ras,c-Abl,Src,Bcl-2家族等。,第五节 化学致癌物分类 Carcinogen Classification,对人类和动物致癌性 致癌作用模式 致癌作用机制,一、根据对人类和动物致癌作用分类* 国际癌症研究中心（International Agency for Research on Cancer, IARC） 根据人类致癌性资料和实验动物致癌性资料，将化学物分为4级：致癌性证据充分；致癌性证据有限；致癌性证据不足；证据提示缺乏致癌性。 根据在动物诱癌实验中证据将化学物分为5类：1、致癌性证据充分；2、致癌性证据有限；3、致癌性证据不足；4、致癌性证据阴性；5、无证据可引用。,致癌证据充分：在多物种或多品系的动物实验中，用不同的染毒途径均观察到肿瘤发生率升高。 致癌性证据有限：部分动物诱癌实验获得阳性结果，但资料有限。 致癌性证据不足：现有的实验结果由于实验设计因素（剂量、接触时间、动物数目、观察时间等）或某些重要因素限制，无法明确化学物与癌症作用的关系。 致癌性证据阴性：在多种动物或多种品系的动物诱癌实验中，没有结果显示该化学物具有致癌性。 无证据可引用：目前尚无相关的研究证据。,化学致癌物分类,组1，人类致癌物对人类致癌性证据充分（黄曲霉毒素，苯、砷、烟草烟雾） 组2A,人类可能致癌物对人类致癌性证据有限，对实验动物致癌性证据充分（丙烯晴、苯并（a）芘） 组2B,人类可疑致癌物对人类致癌性证据有限，对实验动物致癌性证据不充分，或对人类致癌性证据不足，实验动物致癌性证据充分（四氯化碳、六氯苯） 组3,现有的证据不能对人类致癌性进行分类（苯胺、狄氏剂） 组4,人类可能是非致癌物（己内酰胺）,只考虑化学物致癌性证据的充分性，不考虑致癌活性大小及其机制,截止2012年1月各组致癌物种类,化学致癌物分类,根据致癌作用模式分类 直接致癌物 间接致癌物 促癌剂,本身有致癌作用，在体内不需代谢活化即可致癌（各种烷化剂、大多数为亲电子反应物，如N-甲基-N-亚硝基脲,氮芥类）,本身并不致癌，在体内代谢活化后形成的代谢产物具有致癌作用（多环芳烃、芳香胺类化合物，黄曲霉毒素B1等）,本身无致癌性，在给予致癌物后再给予促癌剂可增强致癌物的致癌作用，也可促进“自发性”转化细胞发展成癌（佛波酯，巴豆油）,案例黄曲霉毒素和癌症诱导,黄曲霉素是由真菌产生的一组相关的真菌毒素，共有4种，即B1、B2、G1和G2。在闷热潮湿的环境中，真菌会在诸如谷物和花生等农作物上生长。流行病学证据显示，饮食中黄曲霉素B的暴露与人类肝癌发生相关。黄曲霉素B1由细胞色素P450酶代谢生成化学活性代谢物，与肝细胞中DNA和蛋白质分子发生反应。 高剂量暴露时，黄曲霉素代谢产物与蛋白质的反应能引起肝脏的即刻损伤（急性肝炎）。暴露剂量低时，与DNA的反应会引起遗传密码突变，进而引起癌症。采用大鼠等实验动物进行的实验室研究表明，黄曲霉素B能引起肝癌，在实验动物的血液中可以检测到黄曲霉素B的活性代谢产物。最近研究表明我国人群血样中蛋白质结合的黄曲霉素代谢产物（黄曲霉毒素的暴露指标）与肝癌发生相关。,化学致癌物分类,助致癌物 （co-carcinogen） 乙醇、二氧化硫,无致癌性，在致癌物之前或同时应 用助癌物可显著增加癌症的发生,促进引发作用和增强促长作用,既不具有引发作用，也不具有促长作用,化学致癌物分类,根据化学致癌物作用机制分类,与DNA共价结合，引起机体 遗传物质改变，导致癌变 占化学致癌物的大多数 可用遗传毒理学试验检测,不作用于遗传物质 促癌剂 内分泌调控剂 免疫抑制剂 细胞毒剂 过氧化物酶体增殖剂 固态物质,遗传毒性致癌物 （genotoxic carcinogens）,非遗传毒性致癌物 （non-genotoxic carcinogens）,2.非遗传毒性致癌物,促癌剂：增强致癌物的致癌作用，如佛波酯（TPA及其衍生物）、苯巴比妥等。 内分泌调控剂 改变内分泌系统平衡及细胞正常分化，起促长剂作用。如乙烯雌酚、雌二醇、硫脲。 免疫抑制剂 对病毒诱导的恶性转化起增强作用。如嘌呤同型物。 细胞毒剂 导致细胞死亡的物质可引起代偿性增生，发生肿瘤。如次氮基三乙酸及氯仿等。 过氧化物酶体增殖剂 导致细胞内氧自由基过量生成 固态物质：可能涉及细胞毒性。如塑料、石棉等。,化学致癌物分类,固态物质 啮齿类动物皮下包埋塑料后，经过较长的潜伏期，可导致肉瘤形成 固态物质的化学成分并不重要，只要是薄片，即使是金属也和各种塑料一样可导致肿瘤形成，关键是大小和形状，且光滑者比粗糙者更有效，无孔的比有孔的效果好 作用机制可能是固态物质可对上皮成纤维细胞增殖提供基底,第六节 化学致癌物筛查的基本方法,化学致癌物,定性判别：受试物是否致癌,定量判别：剂量-反应关系,常用方法,短期实验,动物致癌实验,人类流行病学检查,化学致癌物筛查的基本方法,化学致癌物的判别证据 人群流行病学调查 动物实验,限制和干扰因素多,花费大、周期长、使用动物数量大,评价化学致癌物的常用方法 定量-构效关系分析 遗传毒性组合试验 细胞恶性转化试验 哺乳动物致癌试验 人群流行病学调查,初筛,化学致癌物筛查的基本方法,化学致癌物筛查的基本方法,一、定量构效关系分析（quantitative structure-activity relationship，QSAR） 利用理论计算和统计分析研究化学物结构与其生物学效应间的定量关系 构效关系分析从一种同系物着手，找出该系物质化学结构中与致癌性关系最密切的结构成份，以及其他结构成分改变时对其致癌性的影响 快速、经济、有效 分析方法不统一，未结合生物因素,化学致癌物筛查的基本方法,二、遗传毒性试验,通过以致突变试验作为致癌物筛检。遗传毒性致癌物可能有多种致癌机理，因此要求试验组合尽可能反映较多的遗传学终点。 短期试验有Ames试验、哺乳动物细胞tk正向突变试验、微核试验、染色体畸变试验、UDS和SCE试验等。,遗传毒性试验,化学致癌物筛查的基本方法,三、细胞恶性转化试验 受试物与正常细胞在体外接触，如有致癌作用，可使正常细胞形态、功能发生变化，出现癌细胞的表现 观察终点：细胞恶性变,接触抑制消失、灶性生长,接触抑制是将多细胞生物的细胞进行体外培养时，分散贴壁生长的细胞一旦相互汇合接触，即停止移动和生长的现象。细胞增殖到一定程度,也就是互相挨在一起的时候,糖蛋白识别了这种信息,就会使细胞停止继续繁殖,这种现象就叫做接触抑制。,化学致癌物筛查的基本方法,细胞恶性转化试验 用于恶性转化试验的细胞 原代细胞，如叙利亚仓鼠胚胎细胞（SHE细胞） 动物细胞系，如BALB/C-3T3细胞 病毒感染细胞，如SA7/SHE细胞,化学致癌物筛查的基本方法,细胞恶性转化试验,细胞恶性转化结果判定标准： 细胞形态学及生长状况的改变 染色体核型异常 细胞转化灶形态 半固体琼脂培养基中形成集落的能力 在免疫抑制动物或裸鼠体内的致瘤能力,化学致癌物筛查的基本方法,四、哺乳动物致癌试验,观察时间,靶器官范围,哺乳动物 致癌试验,哺乳动物 短期致癌试验,哺乳动物 长期致癌试验,在有限观察时间范围内，观察的靶器官限定为一个而非全部器官和组织 ，有限动物试验（limited in vivo bioassay）,终身试验（life-time test），经典的和公认的化学物致癌性检测方法,化学致癌物筛查的基本方法,（一）哺乳动物短期致癌试验（limited carcinogenicity study） 常用的哺乳动物短期致癌试验 （1）小鼠肺肿瘤诱发试验 （2）雌性SD大鼠乳腺癌诱发试验 （3）大鼠肝转变灶试验 （4）小鼠皮肤肿瘤诱发试验,在给与受试物后，多次持续给予促癌剂，在20-30周左右观察靶组织有无肿瘤,化学致癌物筛查的基本方法,不是成组试验，应根据受试 物特点选择使用,应遵从长期动物致癌试验的 一般要求,阳性结果的意义与长期动物 致癌试验相似,阴性结果不能排除受试物的 致癌性,观察终点不是病理确认的恶性肿瘤，而是癌前病变（腺瘤或者瘤性增生结节）,哺乳动物短期致癌试验,化学致癌物筛查的基本方法,（二）哺乳动物长期致癌试验 （long-term carcinogenicity study） 下列情况应考虑进行长期致癌试验 （1）人体可能长期暴露于该化学物 （2）该化学物或其代谢物化学结构与已知致癌物相似 （3）反复染毒毒性试验提示该化学物可能产生癌前病变,1. 动物选择 物种、品系 特定的靶器官：大鼠-肝癌；小鼠-呼吸道或肺肿瘤；金黄地鼠-膀胱癌 无法知道靶器官：大、小鼠 需考虑自发肿瘤率 年龄和性别 选用断乳或断乳不久的动物； 性别一般要求雌雄各半。 数量 每组动物数较一般毒性试验多。 一般每组动物数雌雄各50只。,2. 剂量设计 一般使用3个剂量组和1个对照组，必要时另设一个容剂对照组。 3个染毒剂量组包括无作用剂量组、阈剂量组、发生肿瘤的剂量组（此为最高剂量组），以求出明确的剂量反应关系。,较低剂量为前一级较高剂量的1/3至1/4； 最低剂量高于人类实际可能接触的剂量，一般不低于高剂量的10%。 最高剂量应为最大耐受量。 理想的最大耐受量不应致死，也不引起可能缩短寿命的毒性表现和病理改变，与对照组相比体重下降不大于10%。,3. 试验期限与染毒时间 原则上试验期限要求长期或终生。一般情况下小鼠最少1.5年，大鼠2年；可能时分别延长至2年和2.5年。 一般主张一直染毒至试验结束。,4. 结果的观察、分析和评定 一般观察： 体重、外观、活动、摄食是否正常，肿瘤出现时间、部位、数目、性质、大小，死亡时间。 病理检查,肿瘤发生率：是最重要的指标，需要计算肿瘤总发生率、恶性肿瘤总发生率、各器官或组织肿瘤发生率和恶性肿瘤发生率，以及各种类型肿瘤发生率。,指一组实验动物中发生肿瘤的动物数与该组有效动物数之比。有效动物数指最早出现肿瘤时该组存活动物数。,多发性 是指一个动物出现多个肿瘤或一个器官出现多个肿瘤。是化学致癌的又一特征。一般计算每一组的平均肿瘤数。,潜伏期 通常用各组第一个肿瘤出现的时间作为该组潜伏期。其局限性是只适用于能在体表观察的肿瘤。,致癌指数,肿瘤发生率越高，潜伏期越短，则该受试物的致癌力越强。利用致癌指数可对不同化学物的致癌力进行比较。,化学致癌物筛查的基本方法,哺乳动物长期致癌试验 致癌试验阳性的判定标准 （1）对于对照组出现的一种或数种肿瘤，试验组肿瘤发 生率增加 （2）试验组发生对照组没有的肿瘤类型 （3）试验组肿瘤发生早于对照组 （4）与对照组比较，试验组每只动物平均肿瘤数增加 在进行试验的两个种属、两种性别动物中，有一种结果为阳性，即认为该受试物有致癌性,化学致癌物筛查的基本方法,哺乳动物长期致癌试验 阴性结果的判定 符合试验设计的最低要求，即两个种属、两种性别、三个剂量组中有一个接近最大耐受剂量，每组有效动物数雌雄至少各50只，实验动物均为阴性，方能认为为观察致癌作用。,化学致癌物筛查的基本方法,哺乳动物长期致癌试验 在较高剂量组出现显著差异，不如在较低剂量下或在人类可能实际接触的剂量出现差异的意义重大，因为大剂量出现阳性结果存在无法肯定的问题：一是实际上是否有无接触可能的问题，二是机体是否出现代谢饱和或出现低剂量时没有的活化途径 。,化学致癌物筛查的基本方法,哺乳动物长期致癌试验 哺乳动物长期致癌试验在毒理学安全性评价中的地位是任何 其他体外试验所不能替代的 局限性：花费大、周期长、使用动物数量大 最大局限性是动物试验结果外推至人存在不确定性，原因是 动物试验的暴露水平往往超过人体的实际接触剂量，染毒方 式也不能模仿人类的实际暴露途径,化学致癌物筛查的基本方法,五、促癌剂的检测 哺乳动物短期致