课件：真菌感染试验诊断.ppt

第三章真菌感染实验诊断,第一节 真菌的基本特性 真菌是一大类具有典型细胞核，不含叶绿素，不分根、茎叶的真核细胞型微生物。,2019,-,1,一、真菌的形态特性,（一）单细胞真菌呈圆形，如酵母菌。 （二）多细胞真菌由菌丝和孢子组成， 称丝状菌或霉菌。,2019,-,2,菌丝和孢子的形态因菌而异，是鉴定 真菌的重要依据。孢子又分为多种， 如叶状孢子、分生孢子和孢子囊孢子 等。,2019,-,3,二、真菌菌落特性,真菌培养要求不高，常用沙氏 (Sabouraud)培养基(含1蛋白胨、 4葡萄糖或麦芽糖、2琼脂)培养， 适宜温度2228，但深部真菌为 37。形成三种菌落，菌落形态是 鉴别真菌的重要依据。,2019,-,4,1酵母型菌落 是单细胞真菌的菌 落，形态与细菌菌落相似，较大， 表面光滑湿润柔软、边缘整齐， 如新生隐球菌。,2019,-,5,2. 类酵母型菌落 如白假丝酵母菌， 形成假菌丝，伸人培养基中。,2019,-,6,3霉菌型菌落 是多细胞真菌的菌 落。菌落呈棉絮状、绒毛状，并 产生不同的色素，如皮肤癣菌。,2019,-,7,第二节 标本采集及检验程序,一、临床标本的采集 (一)临床标本类别 1皮肤的角质性物质：毛发、 指(趾)甲、皮屑等。,2019,-,8,2各种分泌物和排泄物：生殖道 分泌物、耳垢、痰、粪便、尿 液等。,2019,-,9,3血液和体液：体液包括胸水、 腹水、脑脊液、淋巴穿刺液等。 4脓汁及渗出物。,2019,-,10,(二)采集标本注意事项,1.采集的标本要适宜 不同真菌感染 应采取不同的临床标本。怀疑为浅 部真菌感染如体癣，应刮取病变边 缘的痂、皮屑，发癣应取病发。深 部真菌感染应取血液、脑脊液、脓 汁等。,2019,-,11,2在用药前采集标本 一般真菌 标本须在用药前采集，对已用 药者则需停药一段时间后再采 集标本。,2019,-,12,3采集的标本量要足 血液和脑 脊液标本5ml，胸腔液20ml， 皮屑标本两块，活体组织两份 (一份送病理科检查，一份作 镜检和培养)。,2019,-,13,4严格无菌操作 并进行消毒处理， 尤其是采集血液和脑脊液标本， 要避免污染杂菌。 5采集标本立即送检 深部真菌标 本最长不得超过2h。,2019,-,14,第三节 真菌检验,一、标本直接检查 (一)显微镜检查 直接镜检对真菌病的诊断较细菌更为重要。 许多真菌标本不需染色即可直接镜检，如癣病 标本多用KOH湿片检查法，即取病发或病损部位 皮屑、甲屑置于载玻片上，加1滴10-20 KOH 液，然后加盖玻片并微微加热，使标本组织溶解 透明，在显微镜下可观察到真菌的孢子和菌丝。,2019,-,15,直接镜检的意义,直接镜检阳性表示： 有诊断意义，如浅部真菌病等； 看到的就是真菌的形态，可确定某 些致病性真菌的属或种, 如假丝酵 母菌的厚膜孢子等；,2019,-,16,判断某些真菌种的致病性等,如 皮肤癣菌、曲霉等。,2019,-,17,直接镜检也有局限性： 阴性结果不能排除真菌感染； 有假阳性结果。 因此，对直接镜检可疑结果应 作复查或用其他检验方法鉴定。,2019,-,18,(二)抗原检测,常用的方法有胶乳凝集试验、 ELISA、半定量放射免疫法。 均应设对照，防止发生假阳 性和假阴性。,2019,-,19,用胶乳凝集试验检测标本中的白 假丝酵母菌甘露聚糖抗原。 用胶乳凝集试验和ELISA检测血 清和脑脊液中的隐球菌多糖荚膜抗 原，在治疗前检测非常敏感特异。,2019,-,20,用半定量放射免疫法检测血清、 尿液和脑脊液中荚膜组织胞浆菌循 环多糖抗原，可快速诊断。,2019,-,21,二、真菌的分离培养,真菌培养是目前鉴定真菌的惟一 方法。培养真菌的温度为28， 但深部真菌为37。菌落是鉴 别真菌的方法。注意以下几点：,2019,-,22,菌落性质：酵母菌还是霉菌； 菌落大小，病原性真菌菌落小， 而条件致病性真菌菌落大；,2019,-,23,菌落颜色 病原性真菌颜色淡， 污染真菌颜色深； 致病性真菌菌落下沉，有时使 培养基开裂；污染性真菌菌落 不下沉,很少引起开裂。,2019,-,24,三、真菌的生化反应,用于主要深部感染真菌如假丝酵 母菌、隐球菌等。 1.糖(醇)类发酵试验 37孵育， 观察糖发酵情况。,2019,-,25,2.同化碳源试验 含菌生理盐水 与已融化的固体同化碳源培养 基(45)混合，然后在培养基 上分别加糖，置25孵育观察 结果。若24h后无变化可重复 加糖。如能同化周围有生长圈， 否则无生长。,2019,-,26,3.同化氮源试验 同化碳源试 验相同，但需用无氮源的培 养基，不要加糖类，而加入 硝酸钾。,2019,-,27,四、动物实验,实验的目的是分离病原性真菌、 确定真菌菌种的致病性、研究药物 对真菌的作用等。如假丝酵母菌接 种家兔或小白鼠，肾脏明显肿胀， 肾皮质部位有白色脓疡。,2019,-,28,五、核酸检测,医学真菌的鉴定手段引入了分子生 物学的鉴定方法，从核酸碱基G+C mol分析、限制性片段长度多态 性(RFLP)、Southern印迹分析到脉 冲场凝胶电泳(PFGE)、PCR指纹、 随机扩增多态性DNA(RAPD)以及DNA 特殊片段测序等。,2019,-,29,（一)G+Cmol分类鉴定法,常用热变性温度法。原理是DNA加热变性使碱 基氢键被打开，双链螺旋变成单链，导致核 苷酸碱基在260nm紫外吸收明显增加，完全 变成单链后，紫外吸收增加停止。紫外吸收 增加的中点值温度为热变性温度（Tm）。 若真菌DNA中G+C碱基对含量多，Tm值就高。 可直接反映G +C碱基对的绝对含量。 计算公式为：G+Cmol=(Tm-53.9)2.44,2019,-,30,(二)真菌核型的脉冲电泳分析,脉冲凝胶电泳技术(PFGE)解决 了真菌大分子DNA的分离技术难题。,2019,-,31,原理：PFGE有两个方向的电场在设 定的脉冲时间里交替变换，使大分 子DNA在移动中不断改变自己的形状 及迁移方向，从而绕过细小的凝胶 孔隙而得以分离。较大的DNA分子泳 动慢些，较小的快些，有许多因素影 响电泳带型，分离真菌等大分子量的 DNA宜用较低电压和较长脉冲时间。,2019,-,32,用PFGE分析真菌核型，可直接比较 其遗传背景,从电泳核型差异中进行 分类鉴定,又能取得基因结构的基本 数据，构建出大尺度物理图谱。,2019,-,33,(三)随机扩增多态性 DNA(RAPD)分析,RAPD分析是一种利用随机合成的单个 寡核苷酸引物，通过PCR扩增靶细胞 DNA，扩增产物凝胶电泳，分析DNA 片段大小和数量的多态性，从而比 较靶基因差异的一种技术。由于病 原性真菌基因组庞大，RAPD分析适 用于真菌的鉴定与分类。,2019,-,34,六、真菌毒素的检测,真菌产生有毒的代谢产物，可引起急 慢性真菌中毒症，引起消化道中毒症 状，而且可进入人体内引起病变，如 引起肝脏损伤的黄曲霉毒素、杂色曲 霉毒素；引起肾脏损害的桔青霉素； 引起中枢神经系统损害的黄绿青霉素 等。甚至有的毒素具有致癌性，如黄 曲霉毒素与肝癌发生有关。,2019,-,35,后面内容直接删除就行 资料可以编辑修改使用 资料可以编辑修改使用 资料仅供参考，实际情况实际分析,感谢您的观看和下载,The user can demonstrate on a projector or computer, or print the presentation and make it into a film