课件：微生物相关培训.ppt

主要内容,一、微生物简介 二、微生物控制-消毒与灭菌 三、GMP与微生物 四、我们公司微生物检测情况,1,2019,-,一、微生物简介,什么是微生物 微生物的类群和形态结构 微生物的营养 微生物的生长繁殖,2,2019,-,什么是微生物 ？,1.微生物的定义 个体微小，必须借助于显微镜才能看清它们外形的一群低等的、原始的微小生物。,3,2019,-,2.微生物的特征 体积小，面积大 吸收多，转化快 生长旺，繁殖快 适应强，变异频 分布广，种类多（10万多种）,4,2019,-,3.微生物的作用及危害,（1）微生物的作用 绝大多数微生物对人和动物是有益的，已广泛应用于农业、食品、医药、酿造、化工、制革、石油等行业，发挥了越来越重要的作用。例如与我们日常生活密切相关的如酸奶、酒类、抗生素、疫苗等。,（2）微生物的危害 微生物中也有一部分能引起人及动、植物发生病害，这些具有致病性的微生物，称为病原微生物。如人类的许多传染病（感冒、伤寒、痢疾、结核、脊髄灰质炎、病毒性肝炎等），均是由病原微生物引起的。 从药品生产的卫生学而言，微生物对药品的原料、生产环境和成品的污染是造成生产失败、成品不合格的重要因素。,5,2019,-,微生物的类群和形态结构,一、细菌 细菌是单细胞生物，即一个细胞就是一个个体。 1.细菌的形态与结构 常用光学显微镜观察，其大小可以用测微尺在显微镜下测量，一般以微米为单位。细菌按其形态不同，主要分为球菌、杆菌和螺形菌三类。 细菌虽小，仍具有一定的细胞结构和功能。细胞壁、细胞膜、细胞质和核质等各种细菌都有，是细菌的基本结构。,6,2019,-,7,2019,-,2.细菌的繁殖 二分裂繁殖最普遍、最主要的繁殖方式。 在分裂前先延长菌体，染色体复制为二，然后垂直于长轴分裂，细胞赤道附近的细胞质膜凹陷生长，直至形成横隔膜，同时形成横隔壁，这样便产生两个子细胞。 细菌生长速度很快，一般约20min分裂一次。 若按此速度计算，细菌群体将庞大到难以想象的程度。但事实上由于细菌繁殖中营养物质的逐渐消耗，有害代谢产物的逐渐积累，细菌不可能始终保持高速度的无限繁殖。经过一段时间后，细菌繁殖速度逐渐减慢，死亡菌数增多，活菌增长率随之下降并趋于停滞。,8,2019,-,细菌细胞分裂的电镜超薄切片图,杆菌二分裂过程模式图,9,2019,-,3.细菌的菌落 单个或少数细菌细胞生长繁殖后，会形成以母细胞为中心的一堆肉眼可见、有一定形态构造的子细胞集团，这就是菌落。 细菌菌落常表现为湿润、粘稠、光滑、较透明、易挑取、质地均匀以及菌落正反面或边缘与中央部位颜色一致等。,10,2019,-,粘质沙雷氏菌的菌落特征,沙门氏菌的菌落特征,铜绿假单孢菌的菌落特征,弗氏志贺氏菌的菌落特征,粘质沙雷氏菌的菌落特征,11,2019,-,二.真菌 有细胞壁，无叶绿素，以寄生或腐生方式生存，进行无性或有性繁殖的一类真核细胞型微生物。 真菌包括单细胞（少数）与多细胞（多数）两类。单细胞真菌呈圆形或卵圆形，称为酵母菌；多细胞真菌由菌丝和孢子组成，并交织成团，称丝状菌或霉菌。 真菌生长的最适的温度为2228，最适的pH值为46。其繁殖能力强，但生长速度比细菌慢。真菌对热的抵抗力不强，一般加热6070 1小时即被杀死，但对干燥、日光、紫外线和一些化学消毒剂有抵抗力。,12,2019,-,1.霉菌 霉菌是丝状真菌的俗称，意即“发霉的真菌”，它们往往能形成分枝繁茂的菌丝体，但又不象蘑菇那样产生大型的子实体。 （1）霉菌的形态、大小和结构 构成霉菌营养体的基本单位是菌丝。菌丝是一种管状的细丝，把它放在显微镜下观察，很像一根透明胶管，它的直径一般为3-10微米，比细菌的细胞约粗几倍到几十倍。菌丝可伸长并产生分枝，许多分枝的菌丝相互交织在一起，就叫菌丝体。,13,2019,-,（2）霉菌的繁殖 在自然界中，霉菌主要依靠产生形形色色的孢子进行繁殖。孢子有点像植物的种子，不过数量特别多，特别小。 霉菌的孢子特点：小、轻、干、多，以及形态色泽各异、休眠期长和抗逆性。 孢子的这些特点有助于霉菌在自然界中随处散播和繁殖。对人类的实践来说，有利于接种、扩大培养、菌种选育、保藏和鉴定等工作；对人类的不利之处则是易于造成污染、霉变和易于传播动植物的霉菌病害。,14,2019,-,（3）霉菌的菌落 由于霉菌的菌丝较粗而长，因而霉菌的菌落较大，有的霉菌的菌丝蔓延，没有局限性。菌落质地一般比较疏松，外观干燥，不透明，呈现或紧或松的蛛网状、绒毛状或棉絮状；菌落与附着物的连接紧密，不易挑取；菌落正反面的颜色和边缘与中心的颜色常不一致。,2019,-,2.酵母菌 酵母菌在自然界中分布很广，尤其喜欢在偏酸性且含糖较多的环境中生长，在水果、蔬菜、花蜜的表面和果园土壤中最为常见。 （1）酵母菌的形态、大小和结构 酵母菌是单细胞真核微生物。酵母菌细胞的形态通常有球形、卵圆形、腊肠形、椭圆形、柠檬形或藕节形等。比细菌的单细胞个体要大得多，一般为1-5微米5-30微米。 酵母菌具有典型的真核细胞结构,有细胞壁、细胞膜、细胞核、细胞质、液泡、线粒体等。,16,2019,-,（2）酵母菌的繁殖 酵母菌有多种繁殖方式，包括无性繁殖和有性繁殖。有人把只进行无性繁殖的酵母菌称作“假酵母“，而把进行有性繁殖的酵母菌称作“真酵母“。 （3）酵母菌的菌落 大多数酵母菌的菌落特征与细菌相似，但比细菌菌落大而厚，菌落表面光滑、湿润、粘稠，容易挑起，菌落质地均匀，正反面和边缘、中央部位的颜色都很均一，菌落多为乳白色，少数为红色，个别为黑色。,17,2019,-,各种曲霉的菌落,18,2019,-,微生物的营养,微生物生长繁殖所需的营养物质主要有水、碳源、氮源、无机盐和生长因子等。 1.水 水是各种生物细胞必需的，是良好的溶剂，微生物新陈代谢过程中的一切生化反应都离不开水的作用。 2.碳源 碳源是合成菌体成分的原料，也是微生物获取能量的主要来源。整体上看来，微生物可以利用的碳源范围极广，分为有机碳源和无机碳源两大类。 糖类是最广泛利用的碳源。,19,2019,-,3.氮源 氮源主要是供给合成菌体结构的原料，很少作为能源利用。与碳源相似，微生物作为一个整体来说，能利用的碳源种类十分广泛。某些微生物（如固氮菌）能利用空气中分子态的氮或利用无机氮化物如铵盐、硝酸盐合成有机氮化物。 4.无机盐类 无机盐主要可为微生物提供除碳、氮以外的各种重要元素。微生物需要的无机盐类很多，主要有P、S、K、Na、Ca、Mg、Fe等，其主要功能为构成菌体成分；调节渗透压；作为某些酶的成分，并能激活酶的活性等。 5.生长因子 有些微生物虽然供给它适合的碳源氮源和无机盐类，仍不能生长，还要供给一定量的所谓“生长因子”。其种类很多，主要是B族维生素的化合物等。生长因子可以从酵母浸出液、血液或血清中获得。,20,2019,-,微生物的生长和繁殖,细菌纯培养的群体生长规律 将少量单细胞纯培养接种到一恒定容积的新鲜液体培养基中，在适宜的条件下培养，定时取样测定其细菌含量，可以看到以下现象： 开始有一短暂时间，细菌数量并不增加，随之细菌数目增加很快，既而细菌数又趋稳定，最后逐渐下降。 如果以培养时间为横坐标，以细菌数目的对数或生长速度为纵坐标作图，可以得到一条曲线，称为繁殖曲线，通常又称为生长曲线。生长曲线代表了细菌在新的适宜的环境中生长繁殖直至衰老死亡全过程的动态变化。 根据细菌生长繁殖速率的不同，可将生长曲线大致分为延迟期、对数期、稳定期和衰亡期四个阶段。,21,2019,-,(1)延迟期：少量细菌接种到新鲜培养基后，一般不立即进行繁殖，生长速度近于零。因此在开始一段时间，细菌数几乎保持不变，甚至稍有减少。延迟期的长短与菌种、种龄、接种量和培养基成分有关。 (2)对数期：细菌数以几何级数增加，代时稳定。细菌数目的增加与菌液混浊度的增加呈正相关性。 (3)稳定期：即最高生长期。处于稳定期的微生物，新增殖的细胞数与老细胞的死亡数几乎相等，整个培养物中二者处于动态平衡，此时生长速度又逐渐趋向零。 稳定期的细胞内开始积累贮藏物，如肝糖、异染颗粒、脂肪粒等，大多数芽孢细菌也在此阶段形成芽孢。如果为了获得大量菌体，就应在此阶段收获，因这时细胞总数最高；这一时期也是发酵过程积累代谢产物的重要阶段，某些放线菌抗生素的大量形成也在此时期。 (4)衰亡期：稳定期后如再继续培养，细菌死亡率逐渐增加，以致死亡数大大超过新生数，群体中活菌数目急剧下降，出现了“负生长”，此阶段叫衰亡期。,22,2019,-,23,2019,-,二、微生物控制-消毒与灭菌,消毒：杀死物体上病原微生物的方法,并不一定能杀死含细菌的芽胞。消毒所用的试剂称为消毒剂。 灭菌：杀灭物体上所有微生物的方法。灭菌比消毒要求高，包括杀灭细菌芽孢在内的全部病原微生物和非病原微生物。 抑菌：抑制体内或体外细菌的生长繁殖。常用的抑菌剂为各种抗生素，可抑制细菌的繁殖。 防腐：防止或抑制体外细菌生长繁殖的方法，细菌一般不死亡。 同一种化学药品在高浓度时为消毒剂，低浓度时常为防腐剂。 消毒与灭菌的方法一般可分为物理学方法和化学方法两大类。,24,2019,-,一. 物理消毒灭菌法 用于消毒灭菌的物理因素有热力、辐射、过滤等。 1. 热力灭菌法 干热灭菌法 焚烧：废弃物、尸体 灼烧：接种环、试管口 干烤：玻璃器皿 红外线：医疗器械 湿热灭菌法 巴氏消毒法：61.6-62.8 30min或71.7 15-30s，主要用于牛乳消毒。 煮沸法 流动蒸汽消毒法 间歇蒸汽消毒法 高压蒸汽灭菌法,25,2019,-,高温杀菌 原理：菌体中蛋白质包括酶类在内，过热后引起凝固变性，失去活性，使代谢发生障碍而引起菌体死亡。 高压蒸汽灭菌法：通过加压提高蒸汽温度，其具有穿透力强、温度高、灭菌效果好的特点，是简便、经济、可靠、无毒的安全灭菌方法。,26,2019,-,2. 辐射灭菌法 （1）紫外线 最适宜的波长大约为260nm ；在这个波长区域，最合适的紫外线光源是汞灯，最高发射电平在254nm。产生微量臭氧也有一定杀菌作用。 缺点由于紫外线穿透能力差，不易透过不透明的物质，故紫外杀菌灯只适用于空气及物体表面消毒 。 使用时注意个人防护！ （2）电离辐射 对各种细菌均有致死作用。常用于大量一次性医用塑料制品的消毒和食品的消毒。 （3）微波 是一种波长为1mm1m的电磁波，可穿透玻璃、塑料薄膜及陶瓷等物质，但不能穿透金属表面。多用于检验室用品、无菌室的用具的消毒。,27,2019,-,3. 滤过除菌法 用物理阻留的方法将液体或空气中的细菌除去,以达到除菌目的。 滤菌器含有微细小孔0.22微米,只允许液体或气体通过,而大于孔径的细菌等颗粒不能通过 。 适用范围：血清、毒素、抗生素以及空气等的除菌。,28,2019,-,二. 化学消毒灭菌法 许多化学药物能影响微生物的化学组成、物理结构和生理活性，从而发挥防腐、消毒及灭菌的作用。 洁净室(区)应定期消毒，使用的消毒剂不得对设备、物料和成品产生污染。消毒剂品种应定期更换，防止产生耐药菌株。,29,2019,-,常用消毒剂 乙醇 60%-90% 碘附 甲醛：温度低于20摄氏度时活性不强，使用 时相对湿度至少应在70%以上。 苯扎溴铵(新洁尔灭） 乳酸 氯和次氯酸盐,30,2019,-,GMP与微生物,GMP为什么要控制微生物？ 药品生产中微生物的形态学分布 微生物污染导致药品变质的因素 防止微生物污染的原则 药品生产人员卫生注意事项,31,2019,-,GMP为什么要控制微生物？,大量临床资料表明: 注射剂（尤其是静脉注射剂）如污染了712m的尘粒，可导致热原反应、肺动脉炎、微血栓或异物肉芽肿等，严重的还会致人死命。 如果污染了细菌，轻则局部红肿化脓，重则引起全身细菌性感染。 使用了污染的软膏或乳膏会引起皮肤和粘膜感染。 服用了污染大肠杆菌、沙门菌等致病菌的制剂会导致肠道传染病的发生和流行。 因此，对微生物和尘粒进行更加严格的控制对于注射剂生产洁净室非常重要。,32,2019,-,药品生产中微生物的生态学分布,制药厂房环境的空气 制药用水 厂房建筑与设备表面 操作人员 物料 因此，GMP对各种要素都提出了防止污染的基本要求。中国药典微生物限度检查法规定的检查项目包括细菌数、霉菌及酵母菌数和控制菌检查。,33,2019,-,1.空气中的微生物 来源：灰尘微粒（自然因素如风，人为因素如车）人的皮肤与衣服 谈话、咳嗽、打喷嚏等造成的飞沫。 在药品生产中，减少空气中微生物数量的方法： 空气洁净技术采用的过滤方法 （最常用的方法） 过滤介质种类很多，例如：纤维素、玻璃棉或人造纤维等。 化学消毒方法 采用消毒剂作用于室内空气和物体表面。 紫外线照射方法 采用紫外线对室内空气进行照射。,34,2019,-,2.制药用水中的微生物 各类水不管怎样仔细蒸馏或过滤，总会含有一定量的可溶性有机物和盐类。正是这些可溶性的物质被微生物利用作为它们生长的养料源泉。 常用的对水消毒的方法： 化学消毒剂方法 较常用，效果也最好。常使用次氯酸钠或通氯气。在使用中，应注意到水系统中不能留有消毒不到的“死角”。 膜过滤法 适用于水系统的连续循环处理。 紫外线照射法 在水系统中应用紫外线照射消毒，适用于需要特殊处理的水（如光学透明度要求高），一般在末端之前。这种方法因处理过的水无臭无味，而优于化学消毒剂方法；因不产生微生物移居滤器的现象，而优于膜滤器。 在水系统中，这3种方法综合应用，设计安装在适当的位置。,35,2019,-,3.厂房建筑与设备表面的微生物 制药企业生产车间的厂房，库房及实验室都必须清洁整齐。建筑物表面不透水，光滑平整、无裂缝、接口严密、无颗粒物脱落，并能耐受清洗和消毒。设备、管道应易于拆卸、结构简单，便于清洁消毒。特别是药品生产过程中使用的容器，包括内包装容器，都应进行清洗和消毒。 由于空气中的湿度，所有表面都包上一层含水的薄膜。这层薄膜由于静电吸引而饱含尘埃微粒，有很多时候，表面还覆盖一层油状物质，此层油膜易受到尘粒污染。尘埃微粒和微生物由于空气传播的回降，而导致各种表面受到污染。 ！请记住：一个表面看起来很干净，而实际上已经被千百万个微生物所污染，除非已经做了正确的消毒灭菌。,36,2019,-,以下几点适用于大多数设备，可作为减少微生物定殖的普遍指南： 所有的设备应该易于拆卸和清洗。 所有和产品接触的表面应该光滑连续且无凹陷，不存在锐角转角，连接处呈弧形或凹形。 所有设备内部应该没有螺纹，外面的螺纹要易于清洗。 管道工程上所连接的螺母和阀门都应该能被拆除和清洗。 搅拌桨叶和轴最好是一体的且易于清洗。 包装盒最好使用机械密封，因为包装材料通常很难消毒，而且往往会使用润滑剂，这些润滑剂就有了与产品接触的机会。 阀门应该采取清洁设计，所有的连接部门一定要清洗干净。,37,2019,-,4.人体的微生物 凡是人体体表皮肤与外界相通的腔道如口腔、鼻腔、肠道、眼结膜等均存在不同种类的微生物，其中有些微生物可以长期寄居在人的体表、皮肤和黏膜上。 以下举出一些人员污染的途径和方式： (1) 人的头发和皮肤 每分钟从人类皮肤中要散发出约10,000个微生物。我们的手上，也拥有大量的微生物。此外，在人们正常的日常活动中都接触大量微生物。 (2) 水滴 呼吸和咳嗽将产生出大量水滴，这种水滴既含有尘粒污染也含有微生物污染。 一次咳嗽或喷嚏将把千百万个微生物引入工作环境内。,38,2019,-,(3) 衣着 从可洗涤的纺织物中，可能散发出棉绒和淀粉粒。而从羊毛、开士米和其它松软的针纺织物中也可能散落出纤维和磨损下的微粒。污染也可能通过我们的鞋子进入工作场所。 (4) 化妆品和珠宝手饰 发胶、香水、睫毛膏、香粉等，为微生物污染提供了极好的源泉。耳环、戒指、项链、手链能传播微生物污染。如果，一小片珠宝碎片落入一批产品中，则可能引起严重的尘粒污染。 (5) 生产过程中人们所引起的混杂和误差 由人引起的污染也可能来自于生产过程中出现的混杂和误差。例如，当员工没有按照SOP进行工作时，车间的污染程度增加。让装产品的容器不加盖存放，将导致产品污染。,39,2019,-,由于人体携带有不同种类的微生物，因此在药品生产的全过程中，每个工序都有可能发生由人体携带的微生物导致药品污染的危险。例如，用未经清洁消毒的手直接接触药品使其污染，通过谈话、咳嗽等方式引起药品的污染。,人体不同部位所带细菌数量,40,2019,-,41,2019,-,5. 物料的微生物 物料系指原料、辅料和包装材料等。 原辅料可能将大量的微生物带入到药物制剂中。因此，选用符合标准的原辅料，将有利于控制药品和环境的污染水平。 来源于动物的原料药或辅料（如明胶），有可能被动物病原体所污染；来源于植物的原料药或辅料（如淀粉）则可能被多种细菌、霉菌、酵母菌所污染。 原辅料的处理方法因药物类型而异，许多原辅料需进行消毒或灭菌处理。植物药材可用晾晒、烘烤方法使之充分干燥，以减少微生物繁殖。 原辅料在储藏过程中必须注意环境条件。 包装材料，特别是内包装材料，一方面包装药品，另一方面防止外界微生物进入药中。若处理不当，在药品储藏和运输过程中，极易引起污染，造成严重后果。总之，包装材料应考虑不同需要加以清洁或消毒处理进行合理封装。 原则是尽量减少微生物数量，预防发生污染。,42,2019,-,微生物污染导致药物变质的因素,微生物污染数量 在药品生产中应将微生物污染数量控制在最低限度，这就需要采取综合措施。 微生物生长的营养因素 许多药物成分，都有微生物生长所需的碳源、氮源或无机盐类；生产用水（纯化水、注射用水）亦能支持微生物生长。 pH值 pH值为中性时最适合微生物生长，某些微生物在pH3.5或pH8.09.5仍能生长。 温度 对于微生物污染引起药物变质的温度，不同的微生物有不同的最适温度。根据微生物生长的最适温度不同，可以将微生物分为嗜冷、兼性嗜冷、嗜温、嗜热和超嗜热等五种不同的类型。对嗜温微生物来说，可将药物储藏在阴冷、干燥处。,43,2019,-,防止微生物污染的原则,1.了解污染源 对药品生产全过程可能造成污染的来源，进行深入的了解研究，从而设计一个完好的生产工艺，制定规章制度和标准操作规程，从各个环节采取消毒和卫生措施来防止微生物污染，使产品达到所要求的卫生学质量，包括稳定性及各种微生物参数。 2.进行微生物监测 在药品生产过程中，应按GMP要求不断进行各项微生物卫生学监测。例如：对洁净室空气中的浮游菌、沉降菌进行监测；对无菌设备清洁灭菌进行验证；对非无菌药品进行细菌和活菌数测定和病原菌的限制性检查等。,44,2019,-,生产人员卫生注意事项,1.新进人员的健康检查 生产企业在招收新员工时，一定要对新员工进行全面的健康检查，要确保新进厂的员工不患有急性或慢性传染病。另外还要根据新员工安排的具体岗位性质再确定其它具体检查的项目。 2.建立生产人员健康档案 生产企业应建立员工个人健康档案，以便于检查、了解、追踪个人健康状况。 3.培养生产人员良好的个人卫生习惯 勤洗手、勤剪指甲；勤洗澡、勤理发；勤换衣服、勤洗工作服； 生产区内做到三个禁止：禁止吃东西、禁止吸烟、禁止大声喧哗。,45,2019,-,4.洁净区生产人员要求 洁净区工作人员要尽可能少而精，只有工作需要时才能进入；操作人员在洁净区动作要避免剧烈运动，以减少人的发尘量；洁净区的门应关紧，避免不必要的移动，以保持洁净区的风速、风量、风型和风压；如果是无菌区，操作人员的自我约束就更多，要严格按无菌操作规程执行。 5.药品生产防污染控制措施 划分洁